不同季節(jié)使用微生態(tài)制劑后養(yǎng)殖海水細菌群落特征

王永妍 趙炳赫 梁廣鈺 李云 徐仰倉

（1. 天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津 300457；2. 上饒師范學(xué)院，上饒 334100）

近年來，海水養(yǎng)殖業(yè)因其具有養(yǎng)殖效率高、占地面積少、方式多樣化、節(jié)約水資源等優(yōu)點而蓬勃發(fā)展，但在高密度、集約化養(yǎng)殖模式下，餌料投放、排出的糞便和魚藥濫用都會直接或間接影響水質(zhì)平衡。氨氮、亞硝酸鹽、硫化物及COD等是養(yǎng)殖海水中常見的有害物質(zhì)。目前主要采用化學(xué)、物理和生物的方法進行去除。與傳統(tǒng)方法相比較，微生態(tài)制劑成本低，能夠徹底凈化水體并且對海產(chǎn)品有益。美國商品型養(yǎng)殖海水菌劑可以有效減少換水需求，在一定時間內(nèi)消除水體中的氨氮和亞硝酸鹽。微生物在生態(tài)系統(tǒng)中對環(huán)境變化比較敏感［1］，不同時期不同環(huán)境下使用菌劑處理養(yǎng)殖海水可能會產(chǎn)生不同效果，因此研究將菌劑投入到養(yǎng)殖海水后，水體中細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性可以在一定程度上反映其效果和變化趨勢，對合理利用微生態(tài)制劑和實現(xiàn)海水養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

高通量測序技術(shù)現(xiàn)在已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物研究等方面［2］，通過16S rRNA可以分析出微生物多樣性。呂寧［3］測定對蝦養(yǎng)殖水體連續(xù)5個月的理化指標、微生物群落結(jié)構(gòu)組成及其變化，得出水質(zhì)因子和微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)存在相關(guān)性，李可［4］對對蝦養(yǎng)殖環(huán)境微生物多樣性進行了分析并從中篩選出了有益的菌株開發(fā)微生態(tài)制劑。但很少有針對于在不同時期使用完菌劑，再對養(yǎng)殖海水中微生物群落進行測定的研究。本文將美國商品型菌劑分別于冬、春、夏3個季節(jié)投入到養(yǎng)殖海水中，基于IonS5TMXL 測序平臺研究微生物群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性，旨在揭示菌劑的功能隨季節(jié)變化趨勢以及水體中細菌和環(huán)境因子的關(guān)系，為以后養(yǎng)殖海水治理和微生態(tài)制劑的研制與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

微生態(tài)制劑：美國商品型養(yǎng)殖海水凈水劑

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 為檢測不同季節(jié)養(yǎng)殖海水在凈水劑投入后微生物菌群的變化和多樣性，分別于2019年1月、2019年4月、2019年7月在天津某海水養(yǎng)殖廠投入商品型菌劑，3 d后采集樣品（不同時期同時取3個樣品作為平行）。海水樣品的溫度、鹽度、溶解氧和pH當(dāng)場使用儀器測定并記錄，然后使用滅菌的玻璃瓶收集海水樣品，在低溫下運回實驗室［5］。

1.2.2 總基因組DNA提取 將2 h內(nèi)運回實驗室現(xiàn)場收集的海水樣品立即進行處理：取1 L海水，經(jīng)滅菌后的3 μm和0.22 μm微孔濾膜兩級過濾后，棄去3 μm微孔濾膜，0.22 μm微孔濾膜上即壓載水微生物，使用滅菌的鑷子，將0.22 μm濾膜轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，對3個季節(jié)收集的養(yǎng)殖海水樣品進行編號，冬季樣品標記為RZ1，春季樣品標記為RZ2，夏季樣品標記為RZ3，然后立即放入-80℃冰箱中冷凍4 h，取出冷凍后放有微生物濾膜的離心管，使用滅菌剪刀和鑷子，將0.22 μm濾膜剪碎轉(zhuǎn)移到1.5 mL滅菌離心管中，然后使用試劑盒對微生物的DNA 進行提?。?］。

1.2.3 細菌16S rRNA的高通量測序 將提取的DNA樣品稀釋至20 ng/μL后作為PCR模板，使用帶有Barcode標簽的特定16S rRNA V3、V4區(qū)引物（515F和806R）進行擴增，然后通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，并用Thermo Scientific公司GeneJET膠回收試劑盒純化回收產(chǎn)物后，使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進行文庫的構(gòu)建，經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL進行上機測序［1，6］。利用Qimme對有效序列進行質(zhì)量過濾，并通過Mothur去除嵌合體，得到最終用于后續(xù)分析的優(yōu)質(zhì)序列，然后使用UCLUST對優(yōu)質(zhì)序列進行聚類成為OTU，最后，通過blast將OTU代表序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫比對，對OTU代表序列進行注釋，獲得每個OTU的分類學(xué)信息。去掉原始OTU中 可信度較低的序列，所得數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析。最后進行OTU豐度與 Alpha 多樣性計算，以得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息［7-8］。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用Excel處理數(shù)據(jù)，用SPSS 25.0進行相關(guān)性和顯著性差異分析，水質(zhì)理化指標采用One-way ANOVA（單變量因素方差分析），與細菌多樣性指數(shù)之間的關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析；門和屬分類水平柱形圖使用Origin8.0完成；通過Canoco 4.5對優(yōu)勢屬的相對豐度和環(huán)境因子進行冗余分析（RDA）。

2 結(jié)果

2.1 養(yǎng)殖海水環(huán)境特征

經(jīng)測定養(yǎng)殖海水在冬季到夏季3個季節(jié)中溫度變化范圍為4.4-28.2℃，鹽度變化范圍為15.8-19.1，溶解氧變化范圍為5.2-11.1mg/L，pH變化范圍為7.96-8.10，如表1所示。可以看出冬季和夏季養(yǎng)殖海水溫差比較大，但是冬季鹽度和溶解氧卻相對來說較高。采用SPSS 25.0軟件對水環(huán)境指標分別進行One-way ANOVA（單變量因素方差分析）顯著性檢驗和Person相關(guān)性分析，結(jié)果顯示除夏季和冬季pH沒有顯著差異（P=0.05），其余3個季節(jié)中溫度、鹽度、溶解氧和pH兩兩之間均存在顯著性差異（P＜0.05），溫度和溶解氧呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01）。

表1 天津某海水養(yǎng)殖廠水質(zhì)指標

2.2 三個季節(jié)細菌群落多樣性分析

2.2.1 物種多樣性曲線分析 從冬季RZ1、春季RZ2、夏季RZ3樣本中隨機抽取一定測序量的數(shù)據(jù)，根據(jù)它們所代表的OTUs數(shù)目，以抽取的測序數(shù)據(jù)量與對應(yīng)的物種數(shù)來構(gòu)建曲線（圖1）。稀釋曲線可直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣本中物種豐富程度，從圖中可以看出在97%相似性水平下冬季RZ1、春季RZ2、夏季RZ3隨著測序深度增加，曲線趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量漸進合理，更多的序列數(shù)只會產(chǎn)生少量新的OTU，測序深度足以覆蓋大多數(shù)菌。3條曲線RZ3位于最上方，表明RZ3在這3種菌中物種豐富度是最高的，夏季的養(yǎng)殖海水環(huán)境和條件可能更有利于微生物菌群的生長和繁殖。

圖1 97%相似水平下樣品的稀釋性曲線

2.2.2 Alpha Diversity指數(shù)分析 Alpha Diversity 用于分析樣本內(nèi)（Within-community）的微生物群落多樣性，通過對樣本的多樣性分析可以反映樣本內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性。Alpha Diversity分析指 數(shù) 包 括 shannon、simpson、chao1、ACE、goods_coverage、PD_whole_tree。冬季RZ1、春季RZ2、夏季RZ3三種復(fù)合菌的Alpha多樣性分析見表2。觀測物種數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)值越大，表示樣品中群落豐富度越高，Shannon指數(shù)反映群落的多樣性，Simpson指數(shù)反映群落中優(yōu)勢種的集中程度，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說明樣品中的物種多樣性越高［9］。上述結(jié)果顯示微生物豐富度和多樣性整體情況夏季＞春季＞冬季，夏季物種豐富，而冬季和春季物種相對單一。PD_whole_tree指數(shù)反應(yīng)了樣品中物種對進化歷史保存的差異，PD_whole_tree指數(shù)越大說明物種對進化歷史保存的差異越大［10］。goods_coverage指數(shù)反應(yīng)了測序的深度，goods_coverage指數(shù)越接近于1，說明測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣本中所有的物種。

表2 RZ1、RZ2、RZ3三種樣品多樣性指數(shù)統(tǒng)計

2.3 細菌群落組成與結(jié)構(gòu)

2.3.1 序列拼接組裝與OTU聚類分析 冬季養(yǎng)殖海水RZ1通過16S rDNA高通量測序技術(shù)過濾掉低質(zhì)量堿基后共得到原始序列78 148條，然后進行嵌合體過濾，最終用于后續(xù)分析的有效序列67 069條。按照上述篩選方法，春季RZ2過濾掉低質(zhì)量堿基后的原始序列為84 025條，用于后續(xù)分析的有效序列為67 743條，夏季RZ3分別為76 206條和62 732條。為了研究各樣本的物種組成，對所有樣本的有效序列以97%的一致性進行OTUs聚類，RZ1、RZ2、RZ3分別有134、162、194個OTUs。通過OTUs聚類的結(jié)果表明，RZ1混合菌分屬于13個門，18個綱，38個目，65個科，89個屬；RZ2混合菌分屬于15個門，19個綱，43個目，60個科，77個屬；RZ3混合菌分屬于16個門，22個綱，47個目，48個科，58個屬，以上分析結(jié)果如表3所示。

表3 RZ1、RZ2、RZ3三種樣品16S rDNA高通量測序基本信息

2.3.2 不同水平的細菌組成 利用RDP classifier 對各樣品 OTU 從門到屬依次進行分類信息分析，挖掘在3個季節(jié)中加入復(fù)合菌劑后養(yǎng)殖海水樣品在各個水平上的菌群結(jié)構(gòu)。選取每個分組在門、屬分類水平上最大豐度排名前十的物種并進行對比，生成物種相對豐度柱形圖（圖2）。

在門分類水平上，3種養(yǎng)殖海水樣品中共同相對豐度較高的菌門依次為變形菌門（Proteobacteria，55.16%-72.18%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，18.86%-40.34%），另外放線菌門（Actinobacteria，2.8%）為冬季RZ1樣品中的優(yōu)勢菌門，厚壁菌門（Firmicutes，1.24%-2.13%）是冬季RZ1和春季RZ2樣品的共有優(yōu)勢菌門，夏季RZ3樣品中豐度相對較高的還有綠彎菌門（Chloroflexi，2.82%）和疣微菌門（Verrucomicrobia，1.40%）。在已分類的優(yōu)勢門中，只有放線菌門和厚壁菌門為革蘭氏陽性細菌，其余菌門均是革蘭氏陰性細菌。在不同時期的養(yǎng)殖海水樣品中，變形菌門作為豐度最大的優(yōu)勢菌門，包含γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria，14.47%-61.12%）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria，8.48%-62.99%），可以看出RZ1、RZ2、RZ3在綱水平優(yōu)勢菌豐度所占百分比相差較大。

在屬分類水平上，冬季RZ1的優(yōu)勢菌為Tenacibaculum（38.28%），卓貝爾氏菌屬（Zobellella，30.78%）、鹽單胞菌屬（Halomonas，13.55%）。春季RZ2優(yōu)勢菌為Glycocaulis（34.00%）、鹽單胞菌屬（11.36%）、Planktosalinus（9.67%）。 與 RZ1相比，RZ2優(yōu)勢菌占整體相對豐度值并不大。夏季RZ3優(yōu)勢菌為Pseudofulvimonas（28.94%）、Zobellella（17.51%）、Planktosalinus（15.86%）、 海 桿 菌 屬（Marinobacter，12.30%）。

2.3.3 細菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系 將3個季節(jié)的養(yǎng)殖海水樣品細菌多樣性指數(shù)與環(huán)境因子之間進行相關(guān)性分析（表4），Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)與溫度呈顯著正相關(guān)，與溶解氧呈顯著負相關(guān)；ACE指數(shù)與鹽度呈顯著負相關(guān)，Chao1指數(shù)和PD_whole_tree與其它環(huán)境因子間的相關(guān)性均未達到顯著性水平。說明在投入菌劑之后，3個季節(jié)養(yǎng)殖海水樣品中的細菌多樣性和豐富度主要受溫度、鹽度、溶解氧的影響，在此過程中pH變化并不大，所以pH對群落結(jié)構(gòu)可能沒有顯著影響。

用RDA分析細菌主要群落與水質(zhì)環(huán)境因子之間的關(guān)系，如圖3所示，Planktosalinus、Pseudofulvimonas、海桿菌屬與溫度和pH呈顯著正相關(guān)，卓貝爾氏菌屬、Tenacibaculum、Pseudomonas也與pH呈正相關(guān)，但與溫度呈負相關(guān)；Lactococcus、鹽單胞菌屬、Pseudomonas、Tenacibaculum、卓貝爾氏菌屬與鹽度和溶解氧呈正相關(guān)，而Acinetobacter、Glycocaulis也與溶解氧呈正相關(guān)。

圖2 養(yǎng)殖海水樣品細菌類群門（A）和屬（B）水平分布圖

表4 水體細菌多樣性指數(shù)與水體環(huán)境因子之間的相關(guān)性

3 討論

水溫、鹽度、溶解氧和pH不僅是水環(huán)境物理參數(shù)，還是養(yǎng)殖海水中不可或缺的環(huán)境因子，而且會影響水生生物的生理狀態(tài)［11］。李潤玲［11］在研究海水環(huán)境因子變化對遼寧灣貝類免疫相關(guān)酶活性影響時，表明水溫變化會影響水體溶解氧和pH的變化。Ludlam等［12］認為水溫是決定溶解氧飽和度的重要因素，水溫越低，水中溶解氧含量越高，另外pH值也和二者有很高的相關(guān)性［13］。

圖3 細菌群落與環(huán)境因子的RDA圖

在海洋生態(tài)系統(tǒng)中，海水溫度、鹽度和營養(yǎng)鹽等是影響細菌群落分布的最主要因素［14-15］。李麗娜［16］在研究環(huán)境因素對水稻土中發(fā)酵微生物群落的影響時，提出了不同初始pH和培養(yǎng)溫度都可以改變物種豐富度指數(shù)和Shannon指數(shù)。由此可以推斷物種多樣性指數(shù)可能和養(yǎng)殖海水的環(huán)境因子有關(guān)，溫度較高，鹽度和溶解氧偏低增加了微生物多樣性，夏季觀測物種數(shù)大約是冬季的1.5倍。

擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、綠彎菌門廣泛存在于蝦蟹貝養(yǎng)殖池塘中［17］，這也和天津塘沽某海水養(yǎng)殖廠實際情況相符合。不同時期養(yǎng)殖海水菌群結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，只是主要菌種存在一定差異，3個季節(jié)樣品中優(yōu)勢菌群分配不均，可能是加入微生態(tài)制劑之后菌群隨溫度、鹽度、溶解氧、pH的不同出現(xiàn)了變化，除此以外養(yǎng)殖海水中初始菌群也應(yīng)該是使細菌多樣性發(fā)生變化的一個重要因素，微生物之間存在競爭和互利共生的關(guān)系導(dǎo)致相互作用產(chǎn)生影響［18-19］，而且養(yǎng)殖海水中可能還有豐富的有機質(zhì)。Tenacibaculum是一個新的屬，它在養(yǎng)殖過程中可導(dǎo)致大菱鲆發(fā)生屈撓桿菌?。?0］。Zobellella為革蘭氏陰性菌，中度嗜鹽，分布在海水好氧反硝化，對高濃度亞硝酸鹽具有較好的耐受性，可以有效的去除硝酸鹽、亞硝酸鹽氮，因此被應(yīng)用于處理養(yǎng)殖廢水的過程中。有研究表明對來自不同生境的污水污泥樣品進行篩菌，反硝化效果較好的菌株主要為γ-變形菌綱的鹽單胞菌屬和卓貝爾氏菌屬［21］，鹽單胞菌是鹽單胞菌科（Halomonadaceae）中最大的一個屬，在海水等鹽度較高的環(huán)境中占有較高比例［22］，而冬季RZ1養(yǎng)殖海水樣品鹽度值高，可能更有利于鹽單胞菌屬的生長。Glycocaulis為革蘭氏陰性菌，具有運動性、需氧性、嗜溫性和中度嗜鹽性特點，可從石油污染鹽漬土和海洋中分離出來，養(yǎng)殖海水對碳氫化合物的值有一定限制，此菌種能夠有效降解碳氫化合物。屬于擬桿菌門黃桿菌科的Planktosalinus參與有機物降解、異養(yǎng)反硝化、自養(yǎng)反硝化和氨氧化過程。γ-變形菌綱的Pseudofulvimonas也具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化功能［23-24］。海桿菌屬是中度嗜鹽菌的重要組成部分，主要分布在不同的海洋環(huán)境中，如海沙、海灘淤泥、北極冰面、有殼的海洋生物表面等［25］。微生物在氮循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用，亞硝酸鹽對人體及養(yǎng)殖動物都存在較大的毒害，對某些細菌亦是如此，隨著亞硝酸鹽含量升高，菌株生長速度減緩甚至生長會被完全抑制［26］。目前針對養(yǎng)殖環(huán)境及污水等環(huán)境中與氮循環(huán)有關(guān)的微生物多樣性的報道有很多，研究表明反硝化效率高，對硝酸鹽和亞硝酸鹽耐受性好的菌株在處理高濃度亞硝態(tài)氮廢水的應(yīng)用中具有一定價值。假單胞菌屬、鹽單胞菌屬、海桿菌屬中的一些種可以進行反硝化［27］，并且鹽單胞菌屬、卓貝爾氏菌屬為高效反硝化菌，在最適條件下能將硝酸鹽、亞硝酸鹽完全去除［21］，Planktosalinus、Pseudofulvimonas也表現(xiàn)出異養(yǎng)硝化和好氧反硝化的能力，這些菌屬在含氮廢水和高濃度亞硝酸鹽廢水處理方面有很大應(yīng)用潛力。RZ1、RZ2、RZ3在優(yōu)勢菌屬水平方面有所區(qū)別，但也有一定相似性，由于3個季節(jié)樣品中的優(yōu)勢菌能夠降解氨氮、亞硝酸鹽，因此推測出將微生態(tài)制劑投入到養(yǎng)殖海水中，不同時期細菌組成結(jié)構(gòu)和多樣性跟隨環(huán)境因子表現(xiàn)出變化，但可能仍具有調(diào)節(jié)養(yǎng)殖海水水質(zhì)的能力。

微生物在生態(tài)系統(tǒng)中對環(huán)境變化比較敏感，而溫度、鹽度和營養(yǎng)鹽是影響細菌群落分布的最主要因素。在溫度較低，鹽度較高的冬季，出現(xiàn)了豐度較高的致病菌Tenacibaculum，但另外一些有益菌也發(fā)揮了相應(yīng)的優(yōu)勢。鹽單胞菌屬適應(yīng)能力強，對鹽度依賴大［28］，春季和夏季鹽度依次遞減，鹽單胞菌屬的生長也不斷受到限制，說明水體鹽度在微生物多樣性方面起到了一定作用。除此以外假單胞菌屬對營養(yǎng)要求簡單，能夠在低溫下生長［29］，潛在益生菌乳酸菌屬會降低致病菌等危害因素。春季RZ2水質(zhì)指標處在中間水平，Planktosalinus與溫度呈顯著正相關(guān)，所以夏季此菌屬相對豐度高于春季，Planktosalinus也是春季和夏季發(fā)揮異養(yǎng)硝化、好氧反硝化功能的主要菌屬。夏季RZ3中假單胞菌屬是3個季節(jié)中豐度最低的，有研究推測假單胞菌的分布與季節(jié)性溫度變化有關(guān)［30］，這也就表明水體溫度是影響群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性的主要因素。從RDA圖可以看出夏季優(yōu)勢菌種和pH呈顯著正相關(guān)，3個季節(jié)養(yǎng)殖海水都偏弱堿性，pH值幾乎接近，而且豐富度指數(shù)、多樣性指數(shù)都和pH沒有顯著相關(guān)性，推測此養(yǎng)殖海水樣品中的菌群受季節(jié)pH變化影響不大。水體溫度和溶解氧呈極顯著負相關(guān)性，冬季溶解氧含量較高，RZ1樣品優(yōu)勢菌種與溶解氧呈正相關(guān)性，所以夏季和冬季菌種豐度有所差別。整體來看3個季節(jié)大多數(shù)菌種都具有去除氨氮、亞硝酸鹽的能力，說明水質(zhì)環(huán)境因子雖然改變了微生物的多樣性，但微生態(tài)制劑依然保持相應(yīng)的作用，只是可能會在不同時期表現(xiàn)出不同的效果，3個季節(jié)下微生態(tài)制劑凈化養(yǎng)殖海水的功能在以后還需進行深一步的測定。用，只是可能會產(chǎn)生不同效果。

（3）微生態(tài)制劑的應(yīng)用對維持養(yǎng)殖海水穩(wěn)定起重要作用，不同季節(jié)下微生物群落結(jié)構(gòu)有一定差異，但也發(fā)揮了各自的調(diào)控能力，這為以后微生態(tài)制劑的研制和應(yīng)用提供了新方向、新思路，而且通過此項研究某些菌株的特性和能力也被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)其獨特生理代謝、功能特征，對治理其它廢水和生物修復(fù)有重要價值。

4 結(jié)論

（1）不同季節(jié)的環(huán)境因子，溫度、鹽度、溶解氧、pH都會對投入微生態(tài)制劑后的養(yǎng)殖海水菌群結(jié)構(gòu)組成和多樣性產(chǎn)生影響，但由于3個季節(jié)的pH值相差不大，所以pH在決定優(yōu)勢菌群和物種相對豐度方面并不占據(jù)主要地位。

（2）3個季節(jié)的細菌結(jié)構(gòu)組成和多樣性有所差別，但優(yōu)勢菌屬具備去除氨氮和對高濃度硝酸鹽、亞硝酸鹽耐受性的能力，說明微生態(tài)制劑在環(huán)境因子的影響下菌群發(fā)生變化，可能依然保持相應(yīng)的作