基于退火緩沖液的SLiCE無縫克隆方法的改良

楊東成 蔡松 趙筱 王金華 王永澤

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，武漢 430068）

構(gòu)建重組質(zhì)粒是現(xiàn)代分子生物學(xué)中十分重要的技術(shù)。傳統(tǒng)的質(zhì)粒構(gòu)建多采用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的方式［1］，但這種方法常依賴酶切位點(diǎn)，酶切耗時(shí)較長還可能會(huì)引入一段不需要的序列，另外限制性核酸內(nèi)切酶的價(jià)格也較為昂貴。近幾年以來，無縫克隆的方法發(fā)展迅猛［2-5］，相比較傳統(tǒng)方法，無縫克隆的方法不受酶切位點(diǎn)限制而且操作簡(jiǎn)便快速。

目前市場(chǎng)上無縫克隆試劑盒種類繁多，如NEB公司的NEBuilder試劑盒、Thermo公司的GeneArt試劑盒、CloneTech公司的In-Fusion試劑盒等。其采用的無縫克隆技術(shù)和原理各有不同，共同的特點(diǎn)是成本相對(duì)較高，每次反應(yīng)大約需要18-36美元［6］。Zhang等［7］所 建 立 的 SLiCE（Seamless ligation cloning extract）方法是一種利用大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)同源重組相關(guān)酶進(jìn)行DNA克隆的新方法，其機(jī)理在于不依賴于 RecA-的片段重組［8-12］。Motohashi［13］從成本角度進(jìn)一步優(yōu)化了SLiCE技術(shù)，選用RecA-實(shí)驗(yàn)菌株E.coliJM109提取細(xì)胞裂解液，并優(yōu)化了裂解液配方降低了裂解成本，使基于SLiCE技術(shù)的反應(yīng)折合人民幣僅僅0.4元一次［14］。相比較于市面上的無縫克隆技術(shù)，SLiCE技術(shù)為目前最便宜的無縫克隆技術(shù)［14］。

雖然SLiCE反應(yīng)能實(shí)現(xiàn)較為經(jīng)濟(jì)的無縫克隆，但是SLiCE反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化依賴于高轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞，例如Zhang等［7］采用1×1010CFU/μg電轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞和1×109CFU/μg的化學(xué)轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞，Motohashi［13］則采用的是1×108CFU/μg化學(xué)轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞。商業(yè)化的高感受態(tài)細(xì)胞價(jià)格不菲，但自制高感受態(tài)細(xì)胞工序較為繁瑣，且轉(zhuǎn)化效率往往不穩(wěn)定，因此很多無縫克隆方法建立時(shí)都考慮到了感受態(tài)細(xì)胞效率這個(gè)因素［6，14］。

對(duì)于無縫克隆的高感受態(tài)細(xì)胞依賴問題，Zhang等［7］將λ噬菌體Red/ET重組系統(tǒng)導(dǎo)入到DH108菌株用于SLiCE反應(yīng)，通過提高克隆子形成率從而提高克隆效率［14］，由于菌株不易獲得使得該方法推廣到各個(gè)實(shí)驗(yàn)室有一定困難；王廣珺等［15］在使用T4聚合酶進(jìn)行無縫克隆的基礎(chǔ)上，通過添加退火緩沖液進(jìn)行退火處理，將重組效率提高了10倍之多。

據(jù)最新報(bào)道體內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行核酸片段重組是基于核酸外切酶［16］，對(duì)于采用細(xì)胞裂解液進(jìn)行無縫克隆的SLiCE而言，我們推測(cè)采用退火處理［15］的方式也有可能提高SLiCE的重組效率。此外，電轉(zhuǎn)化法很容易獲得很高的轉(zhuǎn)化效率，但此前無縫克隆采用電轉(zhuǎn)化鮮有成功的例子，我們推測(cè)很可能與無縫克隆反應(yīng)帶來雜質(zhì)有關(guān)，如SLiCE反應(yīng)就有反應(yīng)緩沖液，因此本文對(duì)SLiCE反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行了純化后再實(shí)施電轉(zhuǎn)化，以期待獲得更高的克隆效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 本研究采用的菌株大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、DH5α、MG1655 以及質(zhì)粒pUC19等均為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.5% NaCl；2×YT 培養(yǎng)基：1.6%胰蛋白胨，1% 酵母提取物，0.5% NaCl；SOC培養(yǎng)基：2%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，10 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MgSO4，20 mmol/L葡萄糖。

1.1.3 酶和試劑 高保真酶：PrimeSTAR Max DNA PoLymerase，大連TaKaRa產(chǎn)品；Taq聚合酶：2×Taq Master Mix（Dye Plus），南京Vazyme產(chǎn)品；限制性核酸內(nèi)切酶：EcoR I和BamH I，大連TaKaRa產(chǎn)品；裂解緩沖液：3%（W/V）Triton X-100，50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）［17］；SLiCE buffer（10×）：500 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，100 mmol/L MgCl2，10 mmol/L ATP，10 mmol/L 二硫蘇糖醇，用0.22 μm濾膜過濾，以40 μL體積分裝到PCR管中，放置-20℃保存；10×退火緩沖液：0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA；硅藻土懸濁液：稱取1 g硅藻土（Celite545，F(xiàn)luka），用5 mL蒸餾水懸浮并輕輕倒入已裝有45 mL蒸餾水的Falcone管中，4 min后回收懸濁液，再經(jīng)1 300×g離心1 min，棄上清液。離心所得的顆粒用1 mL蒸餾水懸浮，經(jīng)高壓滅菌后4℃保存?zhèn)溆茫?8］。

1.1.4 儀器與設(shè)備 MyCycler PCR儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；DYY-6C型電泳儀，北京是六一儀器廠產(chǎn)品；凝膠成像儀、金屬浴恒溫儀，美國Major Science公 司 產(chǎn) 品；Centrifuge 5417R、Centrifuge 5804R離心機(jī)，美國 Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 插入DNA片段和線性化載體DNA 的制備 有兩種方式都可將質(zhì)粒變成線性化載體，其具體做法如下：

1.2.1.1 雙酶切法制備線性化載體 以來源于E.coliMG1655的可溶性吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶（Soluble Pyridine Nucleotide Transhydrogenase，udhA）的基因片段udhA（1 401 bp）作為插入基因，pUC19質(zhì)粒作為線性化載體的模板。插入DNA片段采用表1的udhA-F和udhA-R引物進(jìn)行擴(kuò)增，采用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I對(duì)pUC19質(zhì)粒進(jìn)行切割以獲得雙酶切線性化載體。隨后DNA片段都經(jīng)過乙醇沉淀和膠回收試劑盒（OMEGA）純化。

表1 引物及序列

1.2.1.2 PCR擴(kuò)增線性化載體 采用Linearized pUC-F 和Linearized pUC-R引物，以pUC19為模板，采用高保真酶進(jìn)行PCR，PCR條件為：98℃預(yù)變性 30 s；98℃變性 10 s，50℃退火 15 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。對(duì)應(yīng)的插入DNA片段則采用表1的LinearizedudhA-F和LinearizedudhA-R引物進(jìn)行擴(kuò)增。插入DNA和載體DNA的同源區(qū)域大小設(shè)計(jì)為19 bp。

1.2.2 SLiCE提取物的制備及反應(yīng) 參考Okegawa等［14］的方法制備SLiCE提取物：從LB平板上挑取JM109單菌落于LB培養(yǎng)基（1 mL）中，放置搖床37℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。然后轉(zhuǎn)到裝有50 mL 2×YT培養(yǎng)基的搖瓶中，37℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600到3.0（對(duì)數(shù)生長后期，約3.5 h），隨后在4℃及5 000×g條件下離心10 min，棄去上清液，加入50 mL預(yù)冷的無菌水洗滌，再一次在4℃及5 000×g條件下離心5 min，棄去上清液。加入1.2 mL 裂解緩沖液輕輕的重懸，室溫放置10 min。細(xì)胞裂解產(chǎn)物在16 000×g，4℃離心2 min，上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL管與等體積的冰浴的80%（V/V）甘油混合。以上制備所得的SLiCE提取物以40 μL每管裝到0.2 mL PCR管，干冰速凍后放置于-80℃冰箱長期保存，如3個(gè)月內(nèi)使用也可放置在-20℃冰箱。

SLiCE反應(yīng)溶液由以下成分組成：線性化載體DNA，適量的插入DNA片段，1 μL 10×SLiCE buffer，1 μL SLiCE提取物，加入無菌水使反應(yīng)體系達(dá)到10 μL。將SLiCE反應(yīng)混合物放于金屬浴恒溫儀在37℃反應(yīng)30 min，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

1.2.3 SLiCE反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 選用了兩種方式制備感受態(tài)細(xì)胞，并用1 μL 濃度為1 ng/μL的pUC19質(zhì)粒測(cè)定了感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。采用Inoue法［19］制備感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)得轉(zhuǎn)化效率約為1×107CFU/μg；采用傳統(tǒng)的CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)得轉(zhuǎn)化效率為 1×105-1×106CFU/μg。

SLiCE反應(yīng)產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化方法：將100 μL感受態(tài)細(xì)胞放置冰上解凍，加入10 μL的SLiCE反應(yīng)產(chǎn)物，輕輕混勻，置于冰水浴放置30 min，然后放置在42℃水浴鍋中90 s后，迅速放回冰上停留2 min，隨后加入預(yù)熱至37℃的890 μL SOC培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)移到10 mL離心管，于37℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)1 h。將菌液于離心機(jī)12 000 r/min室溫離心1 min，棄去上清800 μL，用剩余的上清液重懸沉淀，全部涂布于含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)12-16 h。

1.2.4 克隆子驗(yàn)證 挑取轉(zhuǎn)化子作為模板，采用Taq聚合酶和驗(yàn)證引物V-pUC-udhA-F和V-pUC-udhA-R（表1）進(jìn)行菌落PCR。PCR條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，53℃退火10 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。采用0.8%瓊脂糖凝膠在100 V電壓下對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，如果條帶大小為1 982 bp表明該轉(zhuǎn)化子為克隆子，若條帶大小為552 bp，則為未被酶切的質(zhì)粒形成的轉(zhuǎn)化子，判定為假陽性。根據(jù)電泳結(jié)果統(tǒng)計(jì)克隆子數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算重組效率：

1.2.5 SLiCE反應(yīng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 DNA濃度對(duì)SLiCE反應(yīng)的影響 在Okega-wa等［14］的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)插入DNA片段與載體的摩爾比在10∶1時(shí)，SLiCE反應(yīng)后克隆效率最高。基于此我們?cè)趯?duì)DNA濃度進(jìn)行優(yōu)化前先將插入DNA片段與載體的摩爾比確定為10∶1。

為明確DNA濃度對(duì)SLiCE反應(yīng)效率的影響，在確定插入DNA與線性化載體摩爾比為10∶1的條件下，設(shè)定線性化載體濃度為10 ng、50 ng和100 ng，考察線性化載體濃度對(duì)SLiCE反應(yīng)的影響。將插入DNA片段（基因片段）和線性化載體在37℃下進(jìn)行SLiCE反應(yīng)30 min，隨后將SLiCE反應(yīng)產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞（轉(zhuǎn)化pUC19質(zhì)粒效率為1.16×107CFU/μg），進(jìn)行克隆子驗(yàn)證并計(jì)算重組效率。

1.2.5.2 退火方式對(duì)SLiCE反應(yīng)的影響 采用兩種不同退火方式考察退火方式對(duì)SLiCE反應(yīng)的影響：

（1）先退火處理，再進(jìn)行SLiCE反應(yīng)：在DNA片段混合液（含50 ng線性化載體，插入DNA與線性化載體摩爾比為10∶1）中加入1 μL 10×退火緩沖液，用超純水補(bǔ)充至總體積為8 μL，進(jìn)行以下退火程序：75℃ 10 min，每1 min降低1℃，至37℃。隨后加入 1 μL 10×SLiCE buffer與 1 μL SLiCE 提取液在37℃下反應(yīng)30 min；

（2）先進(jìn)行SLiCE反應(yīng)，后退火處理：DNA片段混合液先加入 1 μL 10×SLiCE buffer與 1 μL SLiCE提取物并用ddH2O補(bǔ)充至總體積9 μL，37℃下進(jìn)行SLiCE反應(yīng)30 min，隨后加入1 μL 10×退火緩沖液進(jìn)行退火程序。將SLiCE反應(yīng)產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞（轉(zhuǎn)化pUC19質(zhì)粒效率為1.16×107CFU/μg），進(jìn)行克隆子驗(yàn)證并計(jì)算重組效率。

1.2.5.3 電轉(zhuǎn)化法對(duì)SLiCE反應(yīng)的影響 相對(duì)于化學(xué)轉(zhuǎn)化法，電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化效率更高，但是用于無縫克隆效果并不理想。我們認(rèn)為其原因可能是未將無縫克隆反應(yīng)后的溶液進(jìn)行純化。

（1）SLiCE反應(yīng)產(chǎn)物的純化 將DNA片段混合液（含50 ng線性化載體，插入DNA與線性化載體摩爾比為10∶1）在37℃下進(jìn)行SLiCE反應(yīng)30 min，隨后加入退火緩沖液進(jìn)行退火程序，再利用硅藻土懸濁液將SLiCE反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化［20］：將SLiCE反應(yīng)后的溶液先用3倍體積的6 mol/L NaI混合室溫放置2-5 min，加入到約20 μL硅藻土懸濁液中，混勻，冰上放置15 min，期間每分鐘混勻1次。12 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用70%乙醇懸浮。再次12 000 r/min離心5 min，棄上清。沉淀在室溫條件下自然干燥數(shù)分鐘后，加入經(jīng)70℃預(yù)熱的30 μL的超純水，室溫靜置2-5 min，期間每分鐘混勻1次。最后12 000 r/min離心5 min，在盡量不要吸到硅藻土條件下取上清液，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備及電轉(zhuǎn)化 從LB平板上挑取E.coliDH5α單菌落于2 mL 的LB培養(yǎng)基中，放置搖床37℃、200 r/min過夜培養(yǎng)后，取1 mL菌液接種到50 mL LB培養(yǎng)基中，一共接種兩瓶，放置搖床37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600到0.3-0.4。菌液放置冰上預(yù)冷30 min，隨后在4℃、6 000 r/min離心5 min，棄上清，用40 mL預(yù)冷的滅菌后的超純水重懸，再次離心，收集兩管的菌體合并后重懸至一管，然后離心棄上清，用預(yù)冷的滅菌后的超純水重懸至總體積約為 240 μL。取 80 μL 菌液與 10 μL 純化后的SLiCE反應(yīng)液于冰上預(yù)混，轉(zhuǎn)移至電極杯，放至電轉(zhuǎn)化儀（Bio-Rad）調(diào)電壓為2.5 kv進(jìn)行電擊，電擊時(shí)間約4.9 ms，立即加入200 μL 預(yù)熱至37℃的SOC培養(yǎng)基，使用移液器輕輕吹打混合。轉(zhuǎn)移所有菌液到10 mL離心管，補(bǔ)加SOC培養(yǎng)基至1 mL，37℃，200 r/min復(fù)蘇1 h。所有菌液涂布于含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)12-16 h后進(jìn)行克隆子驗(yàn)證并計(jì)算重組效率。

1.2.5.4 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率對(duì)SLiCE的影響 分別采用 1×105、1×106和 1×107CFU/μg 轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化SLiCE反應(yīng)，以確定感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率對(duì)SLiCE的影響。SLiCE反應(yīng)采用10 ng的線性化載體，插入DNA與線性化載體摩爾比為10∶1，于37℃反應(yīng)30 min，隨后化轉(zhuǎn)到相應(yīng)轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞中，隨后進(jìn)行克隆子驗(yàn)證并計(jì)算重組效率。

2 結(jié)果

2.1 DNA濃度對(duì)SLiCE反應(yīng)的影響

我們將插入DNA片段的濃度確定為載體摩爾濃度的10倍，對(duì)SLiCE反應(yīng)所需的線性化載體的量進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如表2所示。

當(dāng)線性化載體的量從10 ng提升到50 ng時(shí)，轉(zhuǎn)化子數(shù)目有了很大幅度的提升，提高了近4倍，當(dāng)線性化載體的量從50 ng提升到100 ng后，轉(zhuǎn)化子數(shù)目變化不大。挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，提高線性化載體的量后重組效率仍保持在很高的水平（圖1）。

表2 不同DNA濃度對(duì)SLiCE反應(yīng)的影響

圖1 菌落PCR驗(yàn)證SLiCE克隆結(jié)果

2.2 退火程序?qū)LiCE反應(yīng)的影響

在線性化載體為50 ng，插入DNA與線性化載體摩爾比為10∶1的條件下，SLiCE優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了不同的退火方式，結(jié)果如表3所示。

表3 退火方式對(duì)SLiCE無縫克隆的影響

相對(duì)于對(duì)照，先進(jìn)行SLiCE反應(yīng)，后退火處理，轉(zhuǎn)化子數(shù)目提高了2倍，重組效率也達(dá)到了100%。而先退火處理，再進(jìn)行SLiCE反應(yīng)，僅產(chǎn)生3個(gè)轉(zhuǎn)化子，且經(jīng)過菌落PCR驗(yàn)證沒有發(fā)現(xiàn)克隆子，表明先進(jìn)行SLiCE反應(yīng)，后退火處理的方式能夠提高SLiCE的克隆效率。

線性化載體片段制備有兩種方式，除了上述酶切方式制備線性化載體片段外，通過PCR方式制備線性化載體片段具有不依賴限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的特點(diǎn)也廣泛采用。我們對(duì)50 ng的PCR線性化載體，插入DNA與線性化載體摩爾比為10∶1，采用先進(jìn)行SLiCE反應(yīng)，后退火處理的方式進(jìn)行了反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化子數(shù)目為52，挑取克隆子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，重組成功率為100%。相比酶切方式制備線性化載體片段，獲得克隆子數(shù)目更多。因此，PCR法制備線性化載體不僅適用于優(yōu)化后的SLiCE方案，且能夠提升SLiCE的克隆效率。

2.3 電轉(zhuǎn)化對(duì)于SLiCE反應(yīng)的影響

先對(duì)SLiCE反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化，再采用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至效率為3.26×109CFU/μg的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，獲得761個(gè)的轉(zhuǎn)化子，但對(duì)挑取的20個(gè)單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證后僅有一個(gè)為克隆子（圖2）。結(jié)果表明電轉(zhuǎn)化法雖然可以提高轉(zhuǎn)化DNA片段轉(zhuǎn)化到胞內(nèi)的能力，但不管是酶切方式還是PCR方式獲得線性化載體的方法都會(huì)殘留一些完整的質(zhì)粒，這些也帶有氨芐抗性的質(zhì)粒也會(huì)高效轉(zhuǎn)化到菌體中形成轉(zhuǎn)化子，產(chǎn)生假陽性，這樣就加大了后續(xù)的篩選的工作量。在轉(zhuǎn)化前加入DpnⅠ酶有可能減少假陽性，但會(huì)增加額外成本和步驟，對(duì)于SLiCE無縫克隆的經(jīng)濟(jì)性有一定影響，因此也不建議電轉(zhuǎn)化方式用于SLiCE無縫克隆。

圖2 菌落PCR驗(yàn)證電轉(zhuǎn)化方式下的SLiCE克隆結(jié)果

2.4 不同效率的感受態(tài)細(xì)胞SLiCE的影響

為克服對(duì)感受態(tài)細(xì)胞的依賴，首先測(cè)試了不同轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞對(duì)SLiCE的影響，結(jié)果如表4所示。

當(dāng)采用10 ng線性化載體，插入DNA與線性化載體摩爾比為10∶1時(shí)進(jìn)行SLiCE反應(yīng)，轉(zhuǎn)化到化轉(zhuǎn)效率為2×105CFU/μg的感受態(tài)細(xì)胞沒有菌落長出，轉(zhuǎn)化到化轉(zhuǎn)效率為1.32×106CFU/μg的感受態(tài)細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生2個(gè)轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR驗(yàn)證并非為克隆子。而當(dāng)轉(zhuǎn)化到化轉(zhuǎn)效率為1.16×107CFU/μg的感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，雖然只產(chǎn)生7個(gè)轉(zhuǎn)化子，但經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證重組效率高達(dá)100%。表明在本實(shí)驗(yàn)中感受態(tài)細(xì)胞效率達(dá)到1.16×107CFU/μg時(shí)，SLiCE便可成功構(gòu)建出重組質(zhì)粒。

表4 不同轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞對(duì)SLiCE克隆的影響

但是采用Inoue法制備化轉(zhuǎn)效率為1.16×107CFU/μg的感受態(tài)細(xì)胞仍較為繁瑣。為此我們采取了本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的SLiCE方案：采用線性化載體濃度為50 ng，插入DNA與線性化載體摩爾比為10∶1，先進(jìn)行SLiCE反應(yīng)，后退火處理。再將SLiCE反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至CaCl2法制備的化轉(zhuǎn)效率為1.7×106CFU/μg感受態(tài)細(xì)胞，也產(chǎn)生2個(gè)轉(zhuǎn)化子，且經(jīng)過PCR驗(yàn)證后均為克隆子。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的SLiCE方案，即使用CaCl2法制備得到的感受態(tài)細(xì)胞也能實(shí)現(xiàn)無縫克隆。

雖然經(jīng)過一系列的優(yōu)化后可以在較低感受態(tài)效率的條件下實(shí)現(xiàn)SLiCE無縫克隆，但是產(chǎn)生的克隆子過少。我們推測(cè)SLiCE克隆中的一些鹽，如SLiCE buffer和退火緩沖液都含有一定濃度的鹽類，都會(huì)一起隨插入片段和線性化載體轉(zhuǎn)化，而一些鹽往往會(huì)降低感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。本研究檢測(cè)了退火緩沖液對(duì)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響，感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化pUC19質(zhì)粒的效率為3.6×107CFU/μg，而在轉(zhuǎn)化中加入退火緩沖液的化轉(zhuǎn)效率降低到6×106CFU/μg，表明退火緩沖液雖然促進(jìn)了線性化載體和插入DNA同源區(qū)域退火形成連接，但也有可能影響到了轉(zhuǎn)化效率。

為進(jìn)一步提升轉(zhuǎn)化效率，采用硅藻土純化的方式對(duì)最終的SLiCE反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化，再化轉(zhuǎn)到轉(zhuǎn)化效率為1.7×106CFU/μg感受態(tài)細(xì)胞中。雖然相比未經(jīng)純化的處理的SLiCE反應(yīng)產(chǎn)物多產(chǎn)生了一倍的轉(zhuǎn)化子，但PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化效率僅為50%（圖3）。

圖3 SLiCE反應(yīng)產(chǎn)物的純化對(duì)克隆的影響

3 討論

Zhang等［7］所建立的SLiCE（Seamless ligation cloning extract）無縫克隆方法在同源臂長度為15-19 bp條件下就能很好的完成質(zhì)粒構(gòu)建。Motohashi［13］和 Okegawa［14，17］對(duì)這一方法進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，改用E.coliJM109進(jìn)行細(xì)胞裂解液的制備，且采用更便宜的非離子表面活性劑來對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，大大降低了每次反應(yīng)的成本，使SLiCE成為最便宜的無縫克隆方法之一［14］。但是該無縫克隆技術(shù)需要轉(zhuǎn)化效率約為1×108CFU/μg的感受態(tài)細(xì)胞，購買高感受態(tài)細(xì)胞使得整個(gè)實(shí)驗(yàn)成本居高不下，而自己制備高感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率往往不穩(wěn)定。

降低無縫克隆對(duì)高感受態(tài)細(xì)胞的依賴性，需要繼續(xù)提高無縫克隆的克隆效率。王廣珺等［15］通過添加退火緩沖液進(jìn)行退火處理，將依賴T4聚合酶外切酶活性的無縫克隆的重組效率提高了10倍之多，方法簡(jiǎn)單且有效。考慮現(xiàn)有的無縫克隆技術(shù)及其涉及的相關(guān)商品化試劑盒大多也是基于外切酶的應(yīng)用，如核酸外切酶 III［21］、T4 DNA 聚合酶［22］、T5 DNA聚合酶［6］、λ核酸外切酶［23-24］、ExoVIII［25］等，它們共同的特點(diǎn)是將插入DNA片段和載體兩端外切，形成單鏈的同源重組臂，從而實(shí)現(xiàn)無縫克隆。因此，添加退火緩沖液進(jìn)行退火處理，對(duì)這些基于核酸外切酶的無縫克隆技術(shù)來說都有提高克隆效率的可能。

最近Nozaki［16］的研究表明大腸桿菌體內(nèi)具有3'-5'外切酶活性的酶如XthA，該酶也能促進(jìn)核酸片段重組，據(jù)此我們推測(cè)E.coliJM109細(xì)胞裂解液中也可能含有核酸外切酶。因此，本研究也采用添加退火緩沖液進(jìn)行退火處理的方式來優(yōu)化SLiCE技術(shù)（圖4）來進(jìn)一步提高SLiCE技術(shù)的克隆效率。

圖4 優(yōu)化的SLiCE流程圖

在引入變性和復(fù)性的步驟之前，我們首先對(duì)線性化載體的最佳濃度進(jìn)行了探索。傳統(tǒng)的酶連接多采用20-100 ng線性化載體進(jìn)行反應(yīng)。Zhang等［7］認(rèn)為SLiCE反應(yīng)中加入10-200 ng的線性化載體和1-10倍線性化載體摩爾濃度的插入DNA的量較為合適。我們的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)參與SLiCE反應(yīng)的線性化載體的量從10 ng升高到50 ng時(shí)，克隆效率提高了近4倍（表5），但是隨著濃度進(jìn)一步提高，克隆子的數(shù)量并沒有明顯的提高，這可能受限于細(xì)胞裂解液中的相關(guān)外切酶的酶活。在盡可能減少線性化載體用量且保障克隆效率的原則下，本研究選用50 ng線性化載體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，先進(jìn)行SLiCE反應(yīng)，再進(jìn)行退火程序的方式有利于增強(qiáng)SLiCE克隆效率。推測(cè)可能原因，先進(jìn)行SLiCE反應(yīng)，可通過外切酶作用將插入DNA片段或者載體兩端形成單鏈懸突，此時(shí)再進(jìn)行退火程序，在退火緩沖液和緩慢降溫過程的共同作用下，單鏈DNA（ssDNA）中可能形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)全部打開，可更準(zhǔn)確地使插入DNA片段和載體同源區(qū)域的堿基產(chǎn)生氫鍵互補(bǔ)配對(duì)，重組形成新的質(zhì)粒，進(jìn)而提高重組效率。而先退火處理，再進(jìn)行SLiCE反應(yīng)這種方式，退火程序使線性片段和插入DNA片段的雙鏈都打開，所生成的ssDNA在同源區(qū)域也不會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，但此時(shí)除了線性化載體和插入DNA同源區(qū)域產(chǎn)生堿基互補(bǔ)配對(duì)外，還有線性化載體的兩條ssDNA之間、插入DNA的兩條ssDNA之間的競(jìng)爭(zhēng)性堿基互補(bǔ)配對(duì)，這可能導(dǎo)致了重組效率的降低。

即使通過DNA片段純化，電轉(zhuǎn)化也不能滿足SLiCE克隆的要求。電轉(zhuǎn)化相對(duì)于化學(xué)轉(zhuǎn)化，往往具有更高的轉(zhuǎn)化效率，且制作感受態(tài)細(xì)胞的過程更為簡(jiǎn)單。更高的轉(zhuǎn)化效率意味更多的DNA片段或者質(zhì)粒能進(jìn)入細(xì)胞，產(chǎn)生更多的克隆子，但以往的無縫克隆研究中發(fā)現(xiàn)，電轉(zhuǎn)化取得的效果并不理想［6］。有研究者認(rèn)為，電轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生大量熱量會(huì)導(dǎo)致DNA片段形成錯(cuò)誤的二級(jí)結(jié)構(gòu)［26］，也有人認(rèn)為電轉(zhuǎn)化不同于化轉(zhuǎn)，只會(huì)形成少數(shù)孔洞，不像化學(xué)轉(zhuǎn)化那樣保證充足DNA片段轉(zhuǎn)化到每個(gè)細(xì)胞。我們認(rèn)為，影響電轉(zhuǎn)化效率最重要的原因是沒有去除反應(yīng)體系中離子，造成了最終轉(zhuǎn)化效率的下降。實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證了我們的結(jié)果，當(dāng)SLiCE反應(yīng)后我們加入了退火緩沖液進(jìn)行了退火處理，這種SLiCE反應(yīng)產(chǎn)物直接去實(shí)施電轉(zhuǎn)化，沒有任何克隆子的產(chǎn)生，而純化后，產(chǎn)生了761個(gè)轉(zhuǎn)化子，雖然最終的重組效率僅為6.25%，但獲得克隆子的數(shù)目還是不少于化學(xué)轉(zhuǎn)化方法的。只是電轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生的假陽性克隆太多，增加了篩選壓力，因此不建議在SLiCE克隆中使用電轉(zhuǎn)化。

表5 不同的處理方法對(duì)SLiCE的影響

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)SLiCE反應(yīng)所需DNA濃度進(jìn)行優(yōu)化后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)線性化載體量從10 ng升高到50 ng，插入DNA片段與載體的摩爾比為10∶1時(shí)，SLiCE的克隆效率提高了近4倍。在SLiCE反應(yīng)之后加入退火緩沖液并進(jìn)行退火程序，不僅能夠提高SLiCE的克隆效率，而且使得SLiCE能利用CaCl2法制備的轉(zhuǎn)化效率僅為1.7×106CFU/μg的感受態(tài)細(xì)胞完成重組轉(zhuǎn)化，克服了SLiCE對(duì)高感受態(tài)細(xì)胞的依賴性，進(jìn)一步降低了SLiCE克隆的成本。