MiRNA-138抑制JNK/p38 MAPK通路保護(hù)新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡

郭偉偉，張曉鵬，李 霞，劉平洋，李樹(shù)立

（新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院急診內(nèi)科，河南新鄉(xiāng) 453000）

隨著社會(huì)老齡化問(wèn)題的加劇，急性心血管事件發(fā)生率越來(lái)越高，而心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）治療可能會(huì)加重心臟結(jié)構(gòu)及功能的損傷；心肌缺血再灌注損傷是指心肌細(xì)胞在缺血損傷后，血液恢復(fù)供應(yīng)，導(dǎo)致病情進(jìn)展，出現(xiàn)更為嚴(yán)重的心肌損傷，如心肌梗死面積擴(kuò)大、惡性心率失常等［1］。因此，心肌缺血再灌注損傷的預(yù)防和治療成為研究熱點(diǎn)［2］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路是一種保守的三級(jí)激酶模式，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等生理活動(dòng)［3］。大量研究發(fā)現(xiàn)［4-6］，JNK/p38 MAPK通路在心肌缺血在灌注細(xì)胞中明顯激活，引起大量炎性因子的合成和分泌，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡。He等［7］研究顯示，miRNA-138通過(guò)MLK3/JNK/c-jun信號(hào)通路保護(hù)缺氧心肌細(xì)胞的凋亡。近期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-138可介導(dǎo)MAPK和AKT通路抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖［8］，提示miRNA-138對(duì)MAPK信號(hào)通路也有一定調(diào)控作用?；诖耍孪雖iRNA-138可能介導(dǎo)MAPK信號(hào)通路參與心肌缺血再灌注損傷，故本研究旨在探究miRNA-138是否可介導(dǎo)JNK/p38 MAPK通路，在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2018年1月至12月治療急性心肌缺血患者的全血樣本33例，另招募同期體檢健康者全血樣本33例作對(duì)照。所有受試者均簽署知情同意書(shū)，本研究已得到醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)可。納入標(biāo)準(zhǔn)：急性心肌缺血患者具有以下臨床表征［9］，①持續(xù)性胸痛，超過(guò)30 min，且服用硝酸酯類(lèi)藥物無(wú)法緩解，②胸痛發(fā)作不超過(guò)12 h，或胸痛發(fā)作超過(guò)12 h，但持續(xù)胸痛、ST段持續(xù)抬高，③至少兩個(gè)相鄰的胸導(dǎo)聯(lián)ST段上抬≥0.2 mV，或肢導(dǎo)ST段上抬≥0.1 mV；健康對(duì)照各項(xiàng)生理指標(biāo)及心電圖均正常；年齡18歲～70歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有重要器官疾?。缓喜盒阅[瘤；伴有其他類(lèi)型心血管疾??；血液疾??；先天性免疫疾病。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

新生SD大鼠，雄性，SPF級(jí)，日齡6～7 d，體質(zhì)量（20±2）g，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2018-0206，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房中，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，自由攝食飲水。本研究已通過(guò)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。將40只新生大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（Control）、模型組（I/R model）、陰性對(duì)照組（注射無(wú)序序列，Scramble）及miRNA-138過(guò)表達(dá)組（Ad-miRNA-138），每組10只。

1.3 試劑與儀器

腺病毒載體Ad-miRNA-138、無(wú)序序列及miRNA-138、Bcl2及Bax引物序列由上海和元生物技術(shù)股份公司提供；TRizol裂解液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，半胱氨酸蛋白酶3（cyste?ine protease-3，caspase-3，ab2302），β-Actin（ab227387），c-Jun氨基末端激酶1/2（c-Jun N-ter?minal kinase1/2，JNK1/2，ab179461），磷酸化JNK 1/2（phosphorylation-JNK1/2，p-JNK1/2，ab124956），原癌基因c-jun（ab131497），p-c-jun（ab32385），p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 Mitogen activated protein kinase，p38 MAPK，ab27986）和p-p38 MAPK（ab178867）。

動(dòng)物無(wú)創(chuàng)心電圖機(jī)（ECGenie）、電生理記錄儀（iWorx）購(gòu)自美國(guó)健康醫(yī)療儀器國(guó)際公司；低溫高速離心機(jī)（Eppendorf5424）購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；熒光定量PCR儀（CFX96 Touch）購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；光學(xué)顯微鏡（DSZ-70）購(gòu)自日本CARTON公司。

1.4 方 法

1.4.1 新生大鼠缺血再灌注模型的構(gòu)建 腹腔注射20%烏拉坦麻醉大鼠，連接心電監(jiān)測(cè)電極，開(kāi)胸、暴露心臟；結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支15 min，再恢復(fù)供血；當(dāng)心電圖顯示ST段抬高0.1 mV或T波高聳，心肌變暗紅時(shí)，提示結(jié)扎成功。Control組僅穿線(xiàn)，但不結(jié)扎；Scramble組建模前24 h于心肌表面選擇注射點(diǎn)（5個(gè)，每點(diǎn)10 μL，共50 μL），注射無(wú)序序列；Ad-miRNA-138組建模前24 h于心肌表面選擇注射點(diǎn)（5個(gè)，每點(diǎn)10 μL，共50 μL），注射腺病毒載體Ad-miRNA-138。術(shù)后注意保暖和抗感染處理。

1.4.2 樣本采集 清晨空腹采集受試者肘靜脈血3 mL，抗凝處理后凍存于-20 ℃冰箱中備用。大鼠處理結(jié)束后，處死大鼠，取大鼠心臟，洗凈后部分固定于中性多聚甲醛中作石蠟切片，余下凍存于液氮罐中備用。

1.4.3 qRT-PCR檢 測(cè)miRNA-138、Bcl2及BaxmRNA的表達(dá) 取全血樣本和心肌組織，室溫下解凍，加入Trizol裂解液，以氯仿-異丙醇體系提取樣本中總mRNA；經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，miRNA-138、Bcl2及Bax引物序列見(jiàn)表1，經(jīng)qRTPCR檢測(cè)；反應(yīng)條件：95 ℃5 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，72 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法，計(jì)算miRNA-138、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl2）及Bcl2相關(guān)X蛋白（Bcl2-associated X protein，Bax）mRNA的相對(duì)表達(dá)，作3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。

1.4.4 心臟功能的檢測(cè) 造模過(guò)程中，連接電生理記錄儀，建模成功后記錄各組大鼠心率（heart rate，HR），左室收縮壓（left ventricular systolic pres?sure，LVSP），左室內(nèi)壓最大上升速率（maximal rate of increase in left ventricular pressure，+dp/dtmax）。

1.4.5 HE染色 取出心臟組織切片（5 μm），脫蠟后滴加蘇木精染色，沖洗后滴加依紅復(fù)染，經(jīng)梯度酒精脫水后，二甲苯透明、中性樹(shù)脂封片；于顯微鏡下觀察各組大鼠心肌排列情況和組織損傷情況。

1.4.6 免疫組化檢測(cè)心肌組織中Casapse-3的表達(dá) 取出心臟組織切片（5 μm），經(jīng)脫蠟、水化后，浸于封閉通透液中，室溫條件下避光潤(rùn)片30 min；將切片置于檸檬酸鈉緩沖液中煮沸30 min，進(jìn)行抗原修復(fù)；滴加50 mL/L羊血清，室溫條件下孵育30 min，封閉非特異性蛋白；加入經(jīng)稀釋的一抗（Casapse-3，1∶100），4 ℃下反應(yīng)過(guò)夜；加入二抗，37℃下反應(yīng)30 min；加入SP（鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶）液，37 ℃下反應(yīng)30 min；避光條件下，快速滴加DAB進(jìn)行染色；清洗后滴加蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片；顯微鏡下隨機(jī)挑選5個(gè)視野，觀察Casapse-3的表達(dá)情況。染色結(jié)果判斷，采用雙盲法，Casapse-3陽(yáng)性表達(dá)染色呈黃色或棕色，定位于胞漿［10］。

1.4.7 TUNEL染色 取出心臟組織切片（5μm），經(jīng)脫蠟、水化后，固定于預(yù)冷的40 g/L多聚甲醛中5 min，添加蛋白酶K處理10 min；浸于含5%過(guò)氧化氫的緩沖液中20 min，封閉內(nèi)源過(guò)氧化物酶活性；添加TUNEL反應(yīng)混合液，37 ℃下反應(yīng)1 h；加入POD轉(zhuǎn)換液，37 ℃下反應(yīng)30 min；進(jìn)行DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片；顯微鏡下觀察大鼠心臟細(xì)胞凋亡情況。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences of genes

1.4.8 心肌組織線(xiàn)粒體活性氧含量的檢測(cè) 取出液氮罐中的心臟組織，加入生理鹽水冰上勻漿，4 ℃下以3 000 r/min（r=15 cm）離心10 min，分離上清；參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)心肌組織中線(xiàn)粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）的含量。

1.4.9 Western blotting檢測(cè)通路蛋白的表達(dá) 取出液氮罐中的心臟組織，研磨后加入裂解液勻漿，提取組織中總蛋白；檢測(cè)其濃度后，取50 μg樣品蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠分離，再電轉(zhuǎn)至PVDF膜上；浸泡于5%脫脂奶粉中，室溫孵育2 h，封閉非特異性位點(diǎn)；孵育一抗，4 ℃反應(yīng)過(guò)夜；孵育二抗，37 ℃反應(yīng)40 min；滴加ECL發(fā)光液，于暗室顯影曝光，應(yīng)用Image J軟件分析各蛋白灰度值，以β-Actin（稀釋比1∶1 000）的表達(dá)為內(nèi)參，計(jì)算JNK1/2（稀釋比1∶1 500），p-JNK1/2（稀釋比1∶1 500），c-jun（稀釋比1∶1 000），p-c-jun（稀釋比1∶1 000），p38 MAPK（稀釋比1∶1 000）和p-p38 MAPK（稀釋比1∶1 000）蛋白的相對(duì)表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，服從正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)；多組比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK法；計(jì)數(shù)資料以率表示，多組計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者一般資料

健康對(duì)照年齡42～69歲，年齡（54.16±14.82）歲；男19例，女14例。急性心肌缺血患者年齡45～70歲，平均年齡（55.75±15.39）歲；男21例，女12例。兩組年齡、性別比例資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性（表2）。

表2 兩組受試者一般資料Table 2 General data in both groups

2.2 兩組受試者全血中miRNA-138 表達(dá)的比較

如圖1，與健康對(duì)照相比，急性心肌缺血患者全血miRNA-138的水平顯著降低（t=9.987，P=0.000）。

2.3 過(guò)表達(dá)miRNA-138對(duì)I/R大鼠心臟組織中miRNA-138表達(dá)及心功能指標(biāo)的影響

如圖2，各組miRNA-138表達(dá)、心功能指標(biāo)+dp/dtmax、HR及LVSP水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=367.198、83.737、117.218、40.290，P=0.000、0.000、0.000、0.000）。與對(duì)照組相比，I/R模型組大鼠心臟組織中miRNA-138表達(dá)、心功能指標(biāo)+dp/dtmax、HR及LVSP水平顯著下降（q=16.988、12.645、15.113、8.721，P=0.000、0.000、0.000、0.000）；與I/R模型組相比，Ad-miRNA-138組miRNA-138表達(dá)、心功能指標(biāo)+dp/dtmax、HR及LVSP水平顯著上升（q=28.313、9.766、11.693、6.128，P=0.000、0.000、0.000、0.000）；陰性對(duì)照組上述指標(biāo)與I/R模型組相近（P=0.233、0.709、0.457、0.826）。

圖1 兩組受試者全血中miRNA-138 表達(dá)的比較，與健康對(duì)照相比Fig.1 Comparison of miRNA-138 expression in whole blood between the two groups，compared with healthy controls

2.4 過(guò)表達(dá)miRNA-138對(duì)I/R大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

如圖3，HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊、緊密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；I/R模型組和陰性對(duì)照組心肌細(xì)胞間隙明顯增大，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，排列紊亂；Ad-miRNA-138組細(xì)胞間隙、排列整齊性及完整性明顯優(yōu)于I/R模型組。免疫組化結(jié)果顯示，各組Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=96.679，P=0.000）；與對(duì)照組相比，I/R模型組Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞率顯著增加（q=13.788，P=0.000）；與I/R模型組相比，Ad-miRNA-138組Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞率顯著下降（q=11.031，P=0.000）；陰性對(duì)照組Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞率與I/R模型組相近（P=0.277）。TUNEL染色顯示，與對(duì)照組相比，I/R模型組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.05）；與I/R模型組相比，AdmiRNA-138組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著下降（P＜0.05）；陰性對(duì)照組凋亡細(xì)胞數(shù)與I/R模型組相近（P＞0.05）。

2.5 過(guò)表達(dá)miRNA-138對(duì)I/R大鼠Bcl2、Bax 及ROS水平的影響

如圖4，各組Bcl2/Bax mRNA及蛋白、ROS水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=386.190、919.142、167.147，P=0.000、0.000、0.000）；與對(duì)照組相比，I/R模型組Bcl2/Bax水平顯著下調(diào)，ROS水平顯著上調(diào)（q=25.236、40.443、18.344，P=0.000、0.000、0.000）；與I/R模型組相比，Ad-miRNA-138組Bcl2/Bax水平顯著上調(diào)，ROS水平顯著下調(diào)（q=22.041、32.897、13.627，P=0.000、0.000、0.000、0.000）；陰性對(duì)照組Bcl2/Bax、ROS水平與I/R模型組相近（P=0.527、0.881、0.302）。

圖2 過(guò)表達(dá)miRNA-138對(duì)I/R大鼠心臟組織中miRNA-138 表達(dá)及心功能指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of overexpression miRNA-138 on miRNA-138 expression and cardiac function indexes in cardiac tissues of I/R rats

圖3 過(guò)表達(dá)miRNA-138對(duì)I/R大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effects of overexpression miRNA-138 on cardiomyocytes apoptosis in I/R rats

圖4 過(guò)表達(dá)miRNA-138對(duì)I/R大鼠Bcl2、Bax及ROS水平的影響Fig.4 Effects of overexpression miRNA-138 on levels of Bcl2，Bax and ROS in I/R rats

2.6 過(guò)表達(dá)miRNA-138對(duì)I/R大鼠JNK/p38 MAPK通路的影響

如圖5，各組p-p38/p38、p-c-jun/c-jun及p-JNK1/2/JNK1/2水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=174.029、148.400、234.183，P=0.000、0.000、0.000）；與對(duì)照組相比，I/R模型組p-p38/p38、p-c-jun/cjun及p-JNK1/2/ JNK1/2水平顯著上調(diào)（q=16.998、16.923、21.837，P=0.000、0.000、0.000）；與I/R模型組相比，Ad-miRNA-138組p-p38/p38、p-c-jun/cjun及p-JNK1/2/ JNK1/2水平顯著下調(diào)（q=13.681、14.041、16.368，P=0.000、0.000、0.000）；陰性對(duì)照組上述蛋白水平與I/R模型組相近（P=0.222、0.148、0.119）。

圖5 過(guò)表達(dá)miRNA-138對(duì)I/R大鼠JNK/p38 MAPK通路的影響Fig.5 Effects of overexpression miRNA-138 on JNK/p38 MAPK pathway in I/R rats

3 討論

miRNA是一類(lèi)非編碼的小RNA分子，參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡等過(guò)程，其在心肌缺血再灌注損傷中有重要調(diào)控作用［11］。miRNA-138是一種抑癌miRNA，可靶向下游基因參與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡［12］。Morton等［13］研究顯示，miRNA-138在心臟的發(fā)育過(guò)程中有重要的調(diào)控作用，提示miRNA-138可能是心肌細(xì)胞的保護(hù)因子。本研究通過(guò)分析急性心肌缺血患者和健康者全血樣本，發(fā)現(xiàn)急性心肌缺血患者全血miRNA-138水平顯著低于健康者，提示miRNA-138可能在急性心肌缺血中有重要作用。為進(jìn)一步探究miRNA-138與急性心肌缺血的關(guān)系，本研究建模前于心肌表面注射腺病毒載體Ad-miRNA-138，發(fā)現(xiàn)Ad-miRNA-138組大鼠心臟組織miRNA-138水平顯著升高，表明過(guò)表達(dá)miRNA-138心肌I/R大鼠模型構(gòu)建成功。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，心肌出現(xiàn)缺血性再灌注損傷時(shí)，心室功能會(huì)不斷惡化，可能是心肌細(xì)胞反復(fù)丟失、剩余心肌細(xì)胞功能障礙導(dǎo)致的，而凋亡可能是心肌細(xì)胞反復(fù)丟失的主要因素之一［14］。本研究記錄各組大鼠心功能指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miRNA-138可顯著上調(diào)+dp/dtmax、HR及LVSP水平，表明過(guò)表達(dá)miRNA-138可有效改善心肌功能，有助于恢復(fù)心肌舒張、收縮能力。同時(shí)，觀察大鼠心肌病理組織變化發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miRNA-138可明顯緩解缺血再灌注對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。Zhao［15］等研究指出，心肌缺血時(shí)會(huì)生成大量ROS，脂質(zhì)過(guò)氧化大量生成丙二醛，會(huì)破壞心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而形成I/R損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miRNA-138可明顯下調(diào)I/R大鼠心肌組織中ROS水平，表明過(guò)表達(dá)miR?NA-138可通過(guò)清除ROS，從而減輕I/R損傷。

細(xì)胞凋亡在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有重要意義，受多種信號(hào)通路的調(diào)控，如細(xì)胞缺血容易引起細(xì)胞凋亡［16］。體內(nèi)調(diào)控細(xì)胞凋亡的通路主要有死亡受體通路和線(xiàn)粒體通路，死亡受體通路是死亡受體與配體相結(jié)合后，會(huì)啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡［17］。線(xiàn)粒體通路是促細(xì)胞凋亡信號(hào)不可逆改變線(xiàn)粒體通透性，破壞其跨膜電位，引起呼吸鏈斷裂、滲透壓升高、細(xì)胞內(nèi)膜腫脹等一系列變化，最終啟動(dòng)Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［18］。Bcl2和Bax屬于線(xiàn)粒體通路，Bcl2具有抑制凋亡的作用，而B(niǎo)ax具促凋亡的作用，因此Bcl2/Bax水平可反映細(xì)胞凋亡程度［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miRNA-138組可顯著下調(diào)Caspase-3水平，并上調(diào)Bcl2/Bax水平，提示過(guò)表達(dá)miRNA-138可能通過(guò)抑制I/R大鼠心肌細(xì)胞的凋亡，而保護(hù)心肌損傷。

MAPKs是真核細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)絲/蘇氨酸蛋白激酶，主要包括JNK、p38MAPK、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulatory protein kinase，ERK）等，其中ERK可能與細(xì)胞存活有關(guān)，而JNK、p38 MAPK活化與細(xì)胞凋亡有關(guān)，JNK還參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控［20-21］。本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miRNA-138組大鼠心肌組織中p-p38/p38、p-c-jun/c-jun及p-JNK1/2/JNK1/2水平顯著下調(diào)，提示過(guò)表達(dá)miR?NA-138可抑制JNK/p38 MAPK的活化，從而減輕心肌損傷后的炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡。

I/R損傷涉及活性ROS的產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡、線(xiàn)粒體損傷等多個(gè)生理病理過(guò)程，并有多種炎性細(xì)胞和免疫因子的參與，發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜［22］。本研究結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miRNA-138可以改善I/R大鼠心臟功能、降低ROS水平、抑制心肌細(xì)胞的凋亡，同時(shí)抑制JNK/p38 MAPK通路的活化，從而發(fā)揮對(duì)I/R大鼠心肌損傷的保護(hù)作用。首次揭示了miRNA-138在心肌缺血再灌注損傷中的作用及其機(jī)制，為其預(yù)防和治療提供新的研究思路。