黃連素抑制機(jī)械牽張力誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞MAPK磷酸化以及細(xì)胞增殖和遷移

鄧 烈，王林麗，劉樹迎，李朝紅

（中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，廣東廣州 510080）

血管重塑（vascular remodeling，VR）系指血管壁在局部生長(zhǎng)因子、血管活性物質(zhì)及血流動(dòng)力學(xué)刺激等作用下，管壁發(fā)生結(jié)構(gòu)與功能改變的主動(dòng)過程［1］。高血壓［2-3］、高血脂［4-5］以及高血糖［6］單獨(dú)或合并作用均可引起血管重構(gòu)，加速動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）病變發(fā)展。平滑肌細(xì)胞的表型改變［7］、遷移、異常增殖或凋亡是VR的重要原因之一［8-9］。其中，高血壓產(chǎn)生的對(duì)血管壁的機(jī)械牽張力在血管的重構(gòu)與疾病發(fā)生發(fā)展過程中起決定作用［10-11］。新近研究［11］顯示，機(jī)械牽張力可引起血管平滑肌細(xì)胞膜上所有跨膜蛋白構(gòu)型改變，致使多信號(hào)通路同步激活，引起血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡同時(shí)增加，加速VR。因此，如何防止血壓升高產(chǎn)生的機(jī)械力對(duì)細(xì)胞的異常作用是防治重點(diǎn)。黃連素（berberine，BBR）是一種生物堿，主要來源黃連、黃檗。有報(bào)道稱黃連素可抑制腫瘤細(xì)胞增殖［12-13］、抗炎［14］、降血脂［15-16］、治療肥胖作用［17-19］、降低胰島素抵抗、提高葡萄糖代謝效率［20］，保護(hù)受損血管［21］，以及治療阿爾茲海默癥的作用［22］。在我國(guó)的多項(xiàng)臨床研究中，研究者將口服降糖藥格列吡嗪［23］、抗高血壓藥苯磺酸氨氯地平［24］、調(diào)血脂藥阿托伐他汀鈣［25］聯(lián)合黃連素使用，發(fā)現(xiàn)能很好地提高降糖藥、抗高血壓、調(diào)血脂藥的治療效率，暗示黃連素具有很好的心血管治療潛力。但黃連素是否可抑制機(jī)械力誘導(dǎo)的VSMC增殖、遷移的發(fā)生未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究我們首次提出黃連素可通過抑制機(jī)械力誘導(dǎo)的MAPK活性增加，進(jìn)而抑制VSMC增殖和遷移作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與主要試劑

血管平滑肌細(xì)胞源于小鼠主動(dòng)脈的原代分離。培養(yǎng)基DMEM、青-鏈霉素雙抗購(gòu)自gibco，胎牛血清購(gòu)自天津TBD，黃連素購(gòu)自成都威爾曼標(biāo)準(zhǔn)品公司。Ki67抗體購(gòu)自Santa Cruz、MAPK磷酸化抗體購(gòu)自CST公司。本研究經(jīng)本單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的潮濕環(huán)境中，血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）培養(yǎng)于含100 ml/L胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。VSMC每隔2 d換培養(yǎng)基1次，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)按1∶2比例傳代。后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用第3代到第10代的VSMC。

1.3 細(xì)胞牽拉處理

將VSMC種于硅膠彈性底細(xì)胞培養(yǎng)板中（Flexcell，Meckeesport，PA），當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%融合后，無血清培養(yǎng)基饑餓處理24 h，再進(jìn)行牽拉處理。我們使用的牽拉儀主要由一個(gè)真空泵和一個(gè)培養(yǎng)板底座（FX3000 AFC-CTL，F(xiàn)lexcell）構(gòu)成。真空泵會(huì)重復(fù)地形成15～20 KPa的真空狀態(tài)，真空力反復(fù)地（60次/min）牽拉培養(yǎng)板的彈性硅膠底部及VSMC。牽拉時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)胞處于含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的37℃環(huán)境中。牽拉儀的牽拉強(qiáng)度可以設(shè)定5%～30%之間，牽拉強(qiáng)度是指培養(yǎng)板的硅膠底部受拉伸的變形程度。根據(jù)此前的研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)將牽拉強(qiáng)度設(shè)定為10%。檢測(cè)MAPK磷酸化實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞牽拉時(shí)間為15 min，細(xì)胞增殖遷移實(shí)驗(yàn)的牽拉時(shí)間為1 h。在檢測(cè)黃連素對(duì)牽張力作用的影響時(shí)，先用黃連素預(yù)處理1 h，再按上述進(jìn)行相應(yīng)的牽拉處理。

1.4 免疫熒光檢測(cè)ki67表達(dá)

VSMC傳代時(shí)，將約1×106個(gè)/mL VSMC接種于牽拉培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至VSMC達(dá)到60%融合，換無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓處理24 h。在檢測(cè)SS對(duì)VSMC增殖作用實(shí)驗(yàn)中，VSMC進(jìn)行牽拉處理1 h后，再培養(yǎng)23 h后進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。在檢測(cè)黃連素對(duì)SS的增殖作用影響的實(shí)驗(yàn)中，先用黃連素（60 μg/mL）預(yù)處理1 h，然后進(jìn)行牽拉處理1 h，繼而再培養(yǎng)23 h，收集細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。

收集的VSMC先用40 g/L多聚甲醛固定10 min，再用含0.5%Triton-x的PBS破膜10 min，經(jīng)過含10 g/L胎牛血清白蛋白（BSA）的PBS封閉30 min后進(jìn)行相應(yīng)的染色處理。增殖的VSMC用ki67標(biāo)記，總VSMC用4′，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）（0.001%）標(biāo)記，我們使用萊卡DM4000B研究級(jí)倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照，記錄每個(gè)視野下ki67陽性的細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，以ki67細(xì)胞陽性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用的抗體如下：TRITC熒光標(biāo)記二抗（1∶500）、ki67抗體（1∶100，Santa Cruz）。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

VSMC傳代時(shí)，將約1×106個(gè)/mL VSMC接種于特制的牽拉培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至VSMC達(dá)到60%融合，換無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓處理，然后用100 μL的tips對(duì)培養(yǎng)板底部的單層VSMC劃痕，長(zhǎng)度約2 cm。劃痕后用無菌的PBS洗滌兩次，以除去劃痕時(shí)受傷的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組為：NC組、SS組、BBR+SS組、BBR組。NC組的VSMC再培養(yǎng)24 h進(jìn)行劃痕寬度的測(cè)量；SS組的VSMC進(jìn)行牽拉處理1 h后，再培養(yǎng)23 h后進(jìn)行劃痕寬度的測(cè)量；BBR+SS組的VSMC先用黃連素預(yù)處理1 h，再進(jìn)行牽拉處理1 h，再培養(yǎng)23 h進(jìn)行劃痕寬度的測(cè)量；BBR組的VSMC用黃連素處理1 h后再換無血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)23 h，然后進(jìn)行劃痕寬度的測(cè)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，我們用研究級(jí)倒置相差顯微鏡觀察并拍照，記錄每組的劃痕邊界距離，計(jì)算每組的細(xì)胞群邊界距離作為細(xì)胞的遷移距離，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)MAPK磷酸化

分組處理VSMC后，收集細(xì)胞，PBS清洗3次，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解提取總蛋白質(zhì)，等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，然后用5%的脫脂奶粉/TBS液進(jìn)行封閉，再依次孵育P-ERK、P-JNK、P-P38、ERK、JNK和P38抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（HRP），最后進(jìn)行顯影成像并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算。P-ERK、P-JNK、P-P38、ERK、JNK和P38抗體用含5%BSA的TBS緩沖液配制，濃度都是1∶1 000。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 20進(jìn)行，計(jì)量資料用或M（P25～P75）表示，多組均數(shù)比較，若數(shù)據(jù)滿足獨(dú)立、正態(tài)、方差齊性，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。若不滿足方差分析的條件則采用非參數(shù)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃連素抑制SS誘導(dǎo)的MAPK磷酸化

為探索黃連素對(duì)機(jī)械力誘導(dǎo)MAPK磷酸化作用影響的分子機(jī)制，蛋白印跡分析MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的磷酸化，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了3次生物學(xué)重復(fù)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察了一系列濃度梯度（0、2、20、40和60 μg/mL）的黃連素對(duì)牽張力誘導(dǎo)的MAPK磷酸化的影響作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予VSMC牽張力刺激15 min，ERK、JNK和P38通路磷酸化都明顯增加，并且黃連素預(yù)處理后MAPK磷酸化受到了明顯的抑制，并且呈現(xiàn)濃度依賴（表1，圖1）。

表中BBR-2組表示VSMC先用2 μg/mL預(yù)處理1 h；BBR-20組表示VSMC先用20 μg/mL預(yù)處理1 h；BBR-40組表示VSMC先用40 μg/mL預(yù)處理1 h；BBR-60組表示VSMC先用60 μg/mL預(yù)處理1 h，再進(jìn)行牽拉刺激15 min。

2.2 黃連素可抑制SS誘導(dǎo)的VSMC增殖

利用免疫熒光檢測(cè)增殖生物標(biāo)志物ki67的表達(dá)水平變化來觀察黃連素（60 μg/mL）對(duì)SS誘導(dǎo)的VSMC增殖作用影響，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了3次生物學(xué)重復(fù)。圖2中ki67陽性細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞ki67陽性率見表2。以細(xì)胞ki67陽性率作統(tǒng)計(jì)分析，SS組與NC組比較，ki67陽性VSMC明顯增加（P=0.002 ＜0.05），SS組的ki67陽性細(xì)胞是NC組的7倍，說明牽張力能明顯促進(jìn)VSMC的增殖；BBR+SS組與SS組比較，ki67陽性VSMC明顯減少（P=0.0185 ＜0.05），說明黃連素預(yù)處理后再給予牽張力刺激，VSMC的增殖受到了抑制，計(jì)算得到的黃連素抑制率約為70%；BBR組與NC組比較，ki67陽性VSMC增減不明顯，P=0.5072 ＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明黃連素預(yù)處理不會(huì)促進(jìn)VSMC增殖。

表1 MAPK磷酸化各組比較的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 The statistical results of MAPK phosphorylation［n=3，M（P25～P75）］

圖1 應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡方法檢測(cè)各組VSMC的MAPK磷酸化作用Fig.1 detecting the phosphorylation of MAPK using western blotting in such groups

表2 黃連素對(duì)SS誘導(dǎo)的VSMC增殖作用的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 The statistical results of berberine inhibiting VSMC proliferation induced by SS［n=3，%（n），M（P25～P75）］

表3 黃連素對(duì)SS誘導(dǎo)的VSMC遷移作用Table 3 berberine inhibits VSMC migration induced by SS［n=3，M（P25～P75）］

2.3 黃連素可抑制SS誘導(dǎo)的VSMC遷移

利用劃痕實(shí)驗(yàn)來研究黃連素（60 μg/mL）對(duì)SS誘導(dǎo)的VSMC遷移作用影響，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了3次生物學(xué)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，SS組的VSMC再培養(yǎng)23 h后劃痕距離明顯減少，細(xì)胞的遷移距離明顯增加（P=0.002 ＜0.01）；相對(duì)于SS組，BBR+SS組劃痕的距離則明顯的增加，細(xì)胞遷移距離減少（P=0.0226 ＜0.05，說明黃連素可明顯抑制SS誘導(dǎo)的VMSC遷移；BBR組與NC組比較，劃痕的距離無明顯變化，細(xì)胞遷移距離無明顯變化（P=0.25 ＞0.05）。結(jié)果顯示，SS增加了VSMC的遷移能力；黃連素預(yù)處理后，VSMC的遷移能力受到了明顯的抑制，而且，黃連素本身對(duì)VSMC的遷移能力無明顯的作用（表3，圖3）。

3 討論

本研究觀察了黃連素對(duì)機(jī)械力牽拉引起的血管平滑肌細(xì)胞MAPK磷酸化、增殖和遷移的影響。首次發(fā)現(xiàn)黃連素不僅能明顯抑制機(jī)械牽拉力引起的血管平滑肌細(xì)胞MAPK磷酸化增加，而且還能抑制機(jī)械牽拉力引起的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移增加。這些結(jié)果可為中國(guó)傳統(tǒng)中藥黃連素在臨床上的更廣泛應(yīng)用的機(jī)制研究提供重要資料。

圖2 應(yīng)用免疫熒光方法檢測(cè)各組VSMC的增殖情況Fig.2 The proliferation of VSMC in such groups was detected by immunofluorescence

血壓升高產(chǎn)生異常機(jī)械力可非特異性激活細(xì)胞膜上所有跨膜蛋白，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)眾多信號(hào)通路，包括蛋白激酶系統(tǒng)MAPK［4］、PKC［26-27］，氧化還原系統(tǒng)NADPH［28］、PDI［29］，炎癥系統(tǒng)NF?κB［30］、炎癥因子以及細(xì)胞因子［31］等。然而，資料顯示能夠同時(shí)阻斷機(jī)械力多信號(hào)通路的藥物報(bào)道不多。本研究中，我們第一次嘗試用黃連素干預(yù)機(jī)械力作用，獲得了重要結(jié)果。機(jī)械牽拉可明顯激活細(xì)胞內(nèi)MAPK三成分ERK，JNK和p38磷酸化增加，而黃連素可呈濃度依賴性抑制機(jī)械力牽拉引起的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路MAPK磷酸化增加。因此，本研究結(jié)果為黃連素降低高血壓機(jī)制研究提供重要資料。

圖3 應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)（愈傷實(shí)驗(yàn)）方法檢測(cè)各組VSMC遷移情況Fig.3 The migration of VSMC in such groups was detected by wound-heal assay

血液流經(jīng)血管主要產(chǎn)生與血管壁平行的剪切力（shear stress）以及與血管壁垂直向外擴(kuò)張的牽張力（stretch stress），前者主要對(duì)血管內(nèi)皮起作用，而后者對(duì)管壁三層中的所有細(xì)胞均起作用，包括內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞、中膜的平滑肌細(xì)胞以及外膜的成纖維細(xì)胞等。血壓升高產(chǎn)生的異常機(jī)械力導(dǎo)致內(nèi)皮損傷、平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、遷移和異常增殖，最終引起動(dòng)脈血管粥樣硬化病變。因此，如何抑制平滑肌細(xì)胞異常遷移和增殖是防治高血壓血管重構(gòu)的重要方向。本研究中我們發(fā)現(xiàn)機(jī)械力可引起體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移增加，而黃連素可明顯抑制機(jī)械力誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖和遷移增加。該結(jié)果從病理生理學(xué)方面為黃連素防治高血壓血管疾病的致病機(jī)制研究提供有用的證據(jù)。

黃連素是我國(guó)臨床上常用的傳統(tǒng)中藥，除了常用于治療腹瀉、抑制消化道細(xì)菌生長(zhǎng)外，新近報(bào)道顯示黃連素可抗高血壓、高血脂以及高血糖引起血管動(dòng)脈粥樣化的作用以及抗腫瘤細(xì)胞增殖等，但其作用機(jī)制仍不十分明了。本研究首次將其應(yīng)用于阻斷機(jī)械力作用，發(fā)現(xiàn)其不僅能夠抑制機(jī)械力牽拉引起MAPK磷酸化增加，還可抑制平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖。因此，這一研究結(jié)果提供了黃連素舊藥新用途的機(jī)制，為拓展傳統(tǒng)中藥的多疾病防治應(yīng)用提供了重要資料。

總之，本研究第一次觀察到黃連素可對(duì)機(jī)械力牽拉引起的VSMC細(xì)胞增殖、遷移以及細(xì)胞內(nèi)MAPK磷酸化增加等起到明顯抑制作用；可為因VSMC結(jié)構(gòu)與功能改變所致血管疾病如高血壓的防治機(jī)制研究提供重要資料；同時(shí)揭示了傳統(tǒng)中藥黃連素的新用途和新機(jī)制。