疊氮化鈉氧化法測定生物組織中半胱氨酸含量

張忠義， 曹彥圣， 鄭能建， 肖紅偉， 羅 笠， 梁 越，朱仁果， 謝亞軍， 郭 威， 潘媛媛， 潘春蓉

(1.東華理工大學(xué) 江西省大氣污染成因與控制重點實驗室，江西 南昌 330013；2.東華理工大學(xué) 水資源與環(huán)境工程學(xué)院，江西 南昌 330013)

在全球范圍內(nèi)，人類賴以生存的環(huán)境、食物、水體等已經(jīng)遭受有毒重金屬的污染，大部分人暴露于慢性、低水平的重金屬污染中(付美云等，2006;趙慶齡,2010; Tchounwou et al.， 2012)。隨著我國工業(yè)化的快速發(fā)展，大量工業(yè)廢水的排放、含重金屬農(nóng)藥化肥的廣泛使用及采用污水灌溉等導(dǎo)致我國農(nóng)田重金屬超標(biāo)等環(huán)境問題日趨嚴重(Li et al.，2014; Cheng, 2003；曹維鵬等，2006)。以汞、鎘和鉛等為代表的巰基活性重金屬生物代謝性非常差，通過食物鏈的放大和富集作用，其含量往往可以高達環(huán)境濃度的數(shù)百萬倍，嚴重危害人類健康(Quig, 1998; 張禮等, 2017)。

汞，尤其是其有機形態(tài)的甲基汞，具有極強的神經(jīng)毒性和生殖危害性。普遍認為，飲食(如食用魚類、水產(chǎn)品和稻米等)是人體甲基汞暴露的主要途徑(Lavoie et al.，2013; Schaefer et al.， 2009)。已有研究表明，在生物體對甲基汞的攝取、儲存和轉(zhuǎn)運、排泄等過程中，甲基汞主要與含硫氨基酸結(jié)合(Clayden et al.，2013; Rao et al.，2014)。例如，甲基汞與谷胱甘肽的結(jié)合是其主要的解毒機制，而與半胱氨酸的結(jié)合是甲基汞越過血腦屏障的主要方式(Dago et al.，2014; Parvinder et al.，2006; Quig，1998)。同時，環(huán)境中無機汞與半胱氨酸結(jié)合后甲基化效率明顯增加(Chakraborty et al.，2015; Schaefer et al.，2009)。Lemes等(2009)研究發(fā)現(xiàn)，角鯊魚肌肉組織中甲基汞主要以甲基汞-半胱氨酸絡(luò)合物形態(tài)存在。因此測定生物組織內(nèi)結(jié)合態(tài)氨基酸尤其是半胱氨酸的含量，有助于深入了解巰基活性重金屬的行為(如轉(zhuǎn)運、排泄和生物富集等)。但是在典型的苯酚保護高溫酸水解條件下，半胱氨酸極易被破壞，目前國內(nèi)外該領(lǐng)域的研究中少有含硫氨基酸含量的報道(Manneberg et al.， 1995; Thera et al.， 2017， 2018)。

基于此，本研究采用氧化法對半胱氨酸進行預(yù)處理，使用疊氮化鈉將半胱氨酸及胱氨酸轉(zhuǎn)化為磺基丙氨酸，通過氨基酸分析儀進行測定進一步解釋巰基重金屬生物富集行為。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Membrapure A300氨基酸分析儀(德國曼默博爾公司)，配備蠕動泵、陽離子色譜柱、在線脫氣系統(tǒng)、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器以及數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)；Milli-Q超純水系統(tǒng)。

磺基丙氨酸、胱氨酸和半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(純度高于99.9%)購買于Sigma-Aldrich公司；18種氨基酸混標(biāo)為儀器自帶標(biāo)樣，除胱氨酸(50 nmol/mL)外，其余氨基酸濃度均為100 nmol/mL。疊氮化鈉、鹽酸、苯酚等均為分析純試劑，購買于本地供應(yīng)商；魚類樣品2016年10月采自于鄱陽湖南湖區(qū)域。

1.2 氨基酸分析儀條件

本研究中使用的陽離子色譜柱為德國曼默博爾公司自產(chǎn)色譜柱，批號為T615。采用6組pH不同的流動相對18種氨基酸進行梯度洗脫，6種流動相均為鋰鹽系列緩沖液。其中流動相A、B、C、D、E的pH分別為2.70、3.19、4.04、7.90、9.90，緩沖液F為0.2 mol/L的氫氧化鋰溶液。不同的氨基酸大致根據(jù)其等電點依次洗脫，在柱后衍生裝置中與茚三酮衍生劑反應(yīng)，反應(yīng)生成的氨基酸衍生物在440 nm/570 nm兩個波段下分別進行檢測。梯度洗脫程序如下：0～24 min，100%流動相A；24～39 min，100%流動相B；39～51 min，100%流動相C；51～56 min，100%流動相D；56～83 min，100%流動相E；83～90 min，100%流動相F。流動相流速始終保持在220 μL/min。柱溫箱溫度：0～35 min保持在40 ℃；35～60 min緩慢上升到60 ℃；60～90 min緩慢上升到70 ℃。進樣體積為20 μL。

1.3 樣品前處理

由于疊氮化鈉氧化法能同時將胱氨酸和半胱氨酸氧化為磺基丙氨酸，因此半胱氨酸含量通過氧化水解法測定的磺基丙氨酸與典型水解法測定的胱氨酸的差值計算。本研究中氧化水解法步驟為：稱取干重樣品1.50 mg(精確到小數(shù)點后2位)于10 mL水解管中，依次加入6 mol/L鹽酸890 μL、1%苯酚溶液10 μL、2%的疊氮化鈉溶液100 μL，勻速氮吹5 min；密封后于110 ℃下水解24 h。水解完成后，在70 ℃下連續(xù)趕酸3次，最后用0.01 mol/L稀鹽酸1 mL定容。

1.4 方法重現(xiàn)性、精密度及回收率實驗

配置100 nmol/mL磺基丙氨酸和胱氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進樣6次，根據(jù)峰面積計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，評估方法的重現(xiàn)性。

將魚肌肉組織樣品按照上述方法平行進行6次實驗，根據(jù)檢測結(jié)果計算半胱氨酸RSD，得出方法的精密度。

將適量半胱氨酸及胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(20，50，100 pmol)置于魚肌肉組織干樣中，按上述方法進行6次樣品氧化水解預(yù)處理，計算加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化方法的選擇

目前大部分的研究中，均采用過甲酸氧化方法測定含硫氨基酸(Thera et al., 2017; Wright et al.，1998; 李玉玲等，2012)。過甲酸氧化法成熟可靠，然而也存在一系列的問題：①過甲酸氧化法回收率通常低于90%；②氧化過程中大部分酪氨酸會被破壞掉；③過甲酸氧化法步驟繁瑣，需要時間較長；④過甲酸氧化法需要熟練的操作(過甲酸需和樣品充分接觸)，因此回收率不是很穩(wěn)定(Manneberg et al., 1995)。疊氮化鈉法簡單易行，只需將足夠濃度的疊氮化鈉置于水解液即可。因此，本研究采用疊氮化鈉氧化法測定半胱氨酸含量。氨基酸混標(biāo)經(jīng)過疊氮化鈉氧化前后，色譜峰結(jié)果如圖1所示。由圖1可得，經(jīng)疊氮化鈉氧化后，胱氨酸原有峰位置上的峰消失，相應(yīng)的出現(xiàn)磺基丙氨酸的峰位置。這表明在疊氮化鈉存在條件下，胱氨酸和半胱氨酸可以被完全轉(zhuǎn)化為磺基丙氨酸。

2.2 方法驗證

2.2.1 方法可行性及重現(xiàn)性

氨基酸色譜峰之間的基線分離是定量的基礎(chǔ)。如圖1a所示，18種氨基酸基線分離效果較好，且磺基丙氨酸與胱氨酸前后無雜峰出現(xiàn)，表明該方法可以較好地定量半胱氨酸。

100 nmol的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)進樣6次，磺基丙氨酸和胱氨酸峰面積的RSD均小于5%，表明該儀器定量氨基酸的重現(xiàn)性良好(表1)。

表1 氨基酸分析方法學(xué)驗證參數(shù)

2.2.2 樣品精密度及回收率

樣品加標(biāo)回收率結(jié)果如表1所示。胱氨酸及半胱氨酸3個不同濃度(20，50，100 pmol)的加標(biāo)回收率結(jié)果均在90%以上，回收率良好，表明使用的疊氮化鈉氧化法滿足方法學(xué)要求，可以用來測定樣品半胱氨酸含量。

將草魚肌肉組織進行6次平行的氧化水解處理，經(jīng)氨基酸分析儀測定后，胱氨酸及半胱氨酸含量的RSD分別為5.40%和6.28%，說明氧化水解方法氧化產(chǎn)率穩(wěn)定，測試結(jié)果精密度良好。

2.2.3 檢測限及線性范圍

由于生物組織樣品中含硫氨基酸含量普遍較低(Lemes et al., 2009; Manceau et al., 2018)，本研究中磺基丙氨酸及胱氨酸線性范圍濃度的驗證只取10，50，100，200 nmol/mL 4個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行驗證，線性范圍及檢測限結(jié)果見表1。在10～200 nmol/mL濃度范圍內(nèi)，磺基丙氨酸和胱氨酸均有較好的線性范圍，相關(guān)系數(shù)大于0.99?；腔彼峒半装彼岬淖畹蜋z出值均較低，分別為15 pmol和12 pmol，表明儀器靈敏度較高。

2.2.4 優(yōu)化疊氮化鈉用量

為了找到合適的疊氮化鈉用量，配置了一系列濃度梯度的疊氮化鈉溶液，使用草魚肌肉組織樣品進行驗證，測得磺基丙氨酸如表2所示。在疊氮化鈉濃度低于0.15%時，磺基丙氨酸濃度逐漸提高；疊氮化鈉濃度高于0.2%后，磺基丙氨酸濃度變化不大。因此本研究最終選擇0.2%作為疊氮化鈉最終濃度。

表2 疊氮化鈉濃度對草魚肌肉組織磺基丙氨酸檢測結(jié)果的影響

2.3 方法應(yīng)用

將采自鄱陽湖南湖不同種類的魚類肌肉組織冷凍干燥、粉碎為均勻粉末后，進行氧化水解，含硫氨基酸測定結(jié)果見表3。結(jié)果表明，生物組織中含硫氨基酸含量一般較低。水草為代表的初級生產(chǎn)者半胱氨酸顯著低于10 nmol/mg；以草魚和白鰱為代表的初級消費者半胱氨酸含量與頂級消費者(烏鱧、鯰魚等)差異不明顯。這可能表明鄱陽湖重金屬污染水平較低，不會導(dǎo)致明顯的重金屬毒性效應(yīng)。

表3 鄱陽湖生物樣品中半胱氨酸含量

3 結(jié)論

為了進一步理解巰基活性重金屬生物富集機制，本研究首先建立了生物樣品中半胱氨酸預(yù)處理方法及氨基酸分析儀測定方法。氧化水解方法的最佳條件為：在1.50 mg肌肉組織加入6 mol/mL HCl 0.89 mL， 2%的疊氮化鈉溶液100 μL及1%苯酚溶液10 μL，氮吹5 min后于110 ℃下水解24 h。18種氨基酸分離度良好，可用氨基酸分析儀進行定量。磺基丙氨酸和胱氨酸均與相鄰氨基酸實現(xiàn)良好的基線分離，在10～200 nmol/mL范圍內(nèi)兩種氨基酸均具有較好的線性關(guān)系，分析方法檢測限低(小于15 pmol)且具有較好的重復(fù)性(RSD<5%)，加標(biāo)回收率高于90%。應(yīng)用該方法測定了鄱陽湖水生生物半胱氨酸含量，半胱氨酸含量在不同消費者間差異不明顯。綜上所述，該方法可為深入研究巰基活性重金屬生物富集問題提供理論基礎(chǔ)。