白頭翁總皂苷調(diào)控CXCR4/CXCL12信號(hào)通路抑制小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究

馬 漪，文 靜

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，長(zhǎng)沙 410000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer,CRC）是臨床常見(jiàn)的消化道腫瘤，其發(fā)病率居于惡性腫瘤的第3 位，死亡率僅次于肺癌、肝癌和胃癌，位居第4 位[1]。隨著城市化進(jìn)程的加快，其患病率也逐年攀升。CRC 早期癥狀通常不明顯，約有30%的患者在確診時(shí)已出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，其中約65%的患者在完全切除肝轉(zhuǎn)移灶后5 年內(nèi)復(fù)發(fā)[2]。因此，預(yù)防和抑制CRC 肝轉(zhuǎn)移的形成對(duì)患者生存率的提高至關(guān)重要。近年研究顯示[3]，趨化因子受體4（CXCR4）及其天然配體CXCL12 的相互作用在腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到重要作用，通過(guò)應(yīng)用CXCR4 拮抗劑可抑制CRC 細(xì)胞的增殖和遷移，提示阻斷CXCR4/CXCL12 信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠抑制CRC 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。白頭翁總皂苷為清熱解毒中藥白頭翁的主要有效成分，具有抑制炎癥反應(yīng)、抗菌、抗腫瘤等多種藥理學(xué)作用[4]。研究[5-6]表明，其在體外對(duì)人CRC 細(xì)胞表現(xiàn)出良好的抑制作用。本研究通過(guò)脾臟注射CT26 細(xì)胞建立小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，觀察不同劑量白頭翁總皂苷對(duì)小鼠肝轉(zhuǎn)移的抑制作用，并圍繞CXCR4/CXCL12 通路探討其發(fā)揮作用的潛在機(jī)制，為中醫(yī)藥防治CRC 肝轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與動(dòng)物 小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞 CT26 細(xì)胞株購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)；BALB/c雄性小鼠 50 只，SPF級(jí)，體質(zhì)量 18～22 g，飼養(yǎng)于清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中，溫度為（22 ± 2）℃，照明時(shí)間12 h/d。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 白頭翁總皂苷購(gòu)自上海一基實(shí)業(yè)有限公司，純度為98%；希羅達(dá)（500 mg/片）購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Hyclone 公司；小鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；VEGF、CD31+抗體試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司；抗CXCR4、CXCL12、MMP-9、MMP-2 和β-actin 抗體購(gòu)自Santa Crutz 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)為日本SANYO 產(chǎn)品，光學(xué)倒置顯微鏡為德國(guó)Olympus 產(chǎn)品，石蠟包埋機(jī)、組織切片機(jī)為德國(guó) Leica 產(chǎn)品，低溫高速離心機(jī)、酶標(biāo)儀為美國(guó) Thermo 產(chǎn)品、電泳儀為美國(guó)Bio-rad 公司產(chǎn)品。

1.4 模型建立及給藥 將BALB/c 小鼠隨機(jī)分為5 組：假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、白頭翁總皂苷低劑量組、白頭翁總皂苷高劑量組，每組 10 只。除假手術(shù)組外，其余各組小鼠采用脾臟注射法建立小鼠CRC 肝轉(zhuǎn)移模型：小鼠結(jié)腸癌CT26 細(xì)胞于含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)消化離心，調(diào)整為密度 2×106/mL 的PBS 細(xì)胞懸液備用；小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后取仰臥位固定，常規(guī)消毒后開(kāi)腹，暴露脾臟，取0.2 mL 細(xì)胞懸液緩慢推注于脾下極，輕按針眼止血后縫合切口。術(shù)后7 d左右小鼠肝臟可觸及米粒大小結(jié)節(jié)，視為造模成功，假手術(shù)組僅行開(kāi)腹處理。造模后第2 d，白頭翁總皂苷低、高劑量組分別予不同劑量（100、200 mg/kg）灌胃給藥，陽(yáng)性對(duì)照組給予希羅達(dá)（267 mg/kg）灌胃治療，每日1 次，持續(xù)治療3 周。假手術(shù)組和模型組予等體積生理鹽水灌胃。

1.5 標(biāo)本處理 治療結(jié)束后各組小鼠眼球取血1 mL，3 000 r/min 離心后分離血清，于-20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆茫惶幩啦⒔馄市∈?，取部分肝臟組織于4%多聚甲醛溶液中固定，取脾臟原發(fā)瘤組織于-80 ℃ 冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

2 觀察指標(biāo)

2.1 小鼠肝轉(zhuǎn)移程度觀察 治療結(jié)束后處死各組小鼠，解剖后觀察肝臟轉(zhuǎn)移情況，測(cè)量肝臟、脾臟重量，將肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織切下并稱重，計(jì)算抑瘤率：腫瘤質(zhì)量抑制率（%）=（1-治療組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重）× 100%。

2.2 ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清IL-6、TNF-α 水平 采用ELISA 法檢測(cè)小鼠血清中IL-6、TNF-α 炎癥因子水平：血清于-20 ℃冰箱取出后室溫靜置1 h，3 000 r/min 離心15 min。加入血清樣品10 μL、樣品稀釋液40 μL 及檢測(cè)抗體 100 μL，于37 ℃恒溫箱中孵育1 h，棄去孔內(nèi)液體，洗滌液洗板6 次后，各孔加入顯色液顯色，于37 ℃恒溫箱中避光孵育15 min，加入終止液50 μL后于酶標(biāo)儀450 nm 下檢測(cè)OD 值，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入各樣本OD 值得出IL-6、TNF-α 水平。

2.3 免疫組化檢測(cè)肝組織中VEGF、CD31 的陽(yáng)性表達(dá) 小鼠肝組織標(biāo)本于多聚甲醛溶液中固定24 h 后，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，作 5 μm石蠟切片。切片經(jīng)脫蠟、透明、脫水后，30%過(guò)氧化氫孵育20 min 以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，抗原熱修復(fù)，BSA 封閉20 min 后，孵育VEGF、CD31 一抗于4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS 沖洗后滴加二抗，37 ℃恒溫箱中孵育20 min，滴加SABC，37 ℃孵育20 min，滴加DAB 顯色后中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，用Image-Pro 6.0 軟件隨機(jī)選取5 個(gè)視野測(cè)定光密度值（IOD）。

2.4 脾臟瘤組織中CXCR4、CXCL12、MMP-9、MMP-2 蛋白表達(dá)檢測(cè) 取小鼠部分瘤組織，于冰上勻漿后加入RIPA 裂解液，提取瘤組織總蛋白，采用BCA 法檢測(cè)樣品蛋白濃度。加入10 μL 蛋白樣品，電泳系統(tǒng)中分離，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加入一抗（1:1 000）4 ℃孵育過(guò)夜，二抗（1:5 000）室溫孵育2 h，顯色劑顯影，凝膠成像后采用Image J 軟件分析結(jié)果。

2.5 脾臟瘤組織中CXCR4、CXCL12、MMP-9、MMP-2 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 取各組小鼠瘤組織50 mg，Trizol 法提取組織總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定總RNA 濃度并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以β-actin 作為內(nèi)參。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)，95 ℃ 變性5 s，60 ℃退火30 s，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min，56 ℃ 30 s，以2-△△Ct法分析相對(duì)mRNA 表達(dá)量。各基因引物序列見(jiàn)表 1。

表1 各基因引物序列

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2 組以上數(shù)據(jù)采用單因素方差分析比較。

3 結(jié)果

3.1 小鼠肝轉(zhuǎn)移情況比較 見(jiàn)表2。

表2 小鼠肝脾質(zhì)量和抑瘤率（ ）

表2 小鼠肝脾質(zhì)量和抑瘤率（ ）

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.2 小鼠血清中IL-6、TNF-α 的水平比較 見(jiàn)表3。

表3 小鼠血清中IL-6、TNF-α 的水平（ ）

表3 小鼠血清中IL-6、TNF-α 的水平（ ）

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.3 小鼠肝組織中VEGF、CD31 表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果可見(jiàn)，模型組小鼠肝臟組織中VEGF 和CD31 的蛋白陽(yáng)性表達(dá)與假手術(shù)組相比顯著增多，光密度值明顯上升（P＜0.01）。小鼠給予希羅達(dá)和白頭翁總皂苷不同劑量治療后，肝組織中VEGF 和CD31 陽(yáng)性表達(dá)均明顯減少，光密度值較模型組明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖 1～圖3。

圖1 小鼠肝組織中VEGF 的蛋白表達(dá)（IHC，×200）

圖2 小鼠肝組織中CD31 的蛋白表達(dá)（IHC，×200）

圖3 小鼠肝組織VEGF、CD31 平均光密度值比較

3.4 小鼠脾臟瘤組織中的蛋白表達(dá) 模型組脾臟瘤組織中CXCR4、CXCR12、MMP-9、MMP-2 的蛋白表達(dá)水平較假手術(shù)組均顯著升高（P＜0.01）。陽(yáng)性對(duì)照組、白頭翁總皂苷低、高劑量組小鼠經(jīng)治療后，瘤組織中CXCR4、CXCR12、MMP-9、MMP-2 的蛋白表達(dá)較模型組均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖 4。

圖4 小鼠脾臟瘤組織中CXCR4、CXCR12、MMP-9、MMP-2 的蛋白表達(dá)

3.5 小鼠脾臟瘤組織中CXCR4、CXCR12、MMP-9、MMP-2 的mRNA 表達(dá) 見(jiàn)表4。

表4 小鼠脾臟瘤組織中CXCR4、CXCR12、MMP-9、MMP-2 的mRNA 表達(dá)（ ）

表4 小鼠脾臟瘤組織中CXCR4、CXCR12、MMP-9、MMP-2 的mRNA 表達(dá)（ ）

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

4 討論

結(jié)直腸癌（colorectal cancer,CRC）是發(fā)生于結(jié)腸或直腸黏膜上皮的常見(jiàn)消化道惡性腫瘤，近年來(lái)隨著人們生活及飲食習(xí)慣的改變，我國(guó)CRC 發(fā)病率和病死率逐年升高，已成為大中城市排名第1 位的消化道惡性腫瘤[7]。CRC 早期癥狀不明顯，約有70% 的患者在就診時(shí)已進(jìn)入晚期，而在晚期確診的患者5 年生存率僅為14%[8]。影響CRC 預(yù)后的主要因素為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，其中肝臟為CRC 轉(zhuǎn)移的主要靶器官[9]。目前手術(shù)切除為CRC 肝轉(zhuǎn)移唯一可行的治療方法，但由于適應(yīng)證和禁忌證的限制，只有10%～20%的患者能夠接受手術(shù)治療，而經(jīng)手術(shù)治療的患者約有65%在5 年內(nèi)仍復(fù)發(fā)[2]。

白頭翁性寒，味苦，入胃經(jīng)、大腸經(jīng)。具有清熱燥濕、涼血止痢之功效，以白頭翁為主要藥味的白頭翁湯在臨床對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎等潰瘍性病變具有明顯療效[10]。白頭翁總皂苷是由白頭翁中提取的主要活性成分，現(xiàn)代藥理研究證明[11]，其具有良好的抗炎、抗菌、抑制腫瘤等作用。羅穎穎等[5-6]研究表明，白頭翁皂苷對(duì)人HT29 結(jié)腸癌細(xì)胞增殖表現(xiàn)出良好的抑制作用，同時(shí)能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)對(duì)肝癌H22 荷瘤小鼠亦具有較強(qiáng)的抑瘤作用。姜成等[12]同樣發(fā)現(xiàn)白頭翁皂苷能夠劑量依賴地抑制HT29 細(xì)胞增殖，提示其作為抗腫瘤潛在藥物值得進(jìn)一步深入研究。

趨化因子是一類存在于靶細(xì)胞表面，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移等各種活動(dòng)的細(xì)胞因子，近年研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子及其受體能夠通過(guò)刺激腫瘤細(xì)胞增值、調(diào)節(jié)血管新生從而參與腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程[13]。趨化因子受體4（CXCR4）為CRC 細(xì)胞中表達(dá)最普遍的趨化因子受體，其高表達(dá)能夠促進(jìn)CRC 轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)，也與CRC 復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高、生存期差相關(guān)[14]。

趨化因子12（CXCR12）是CXCR4 的天然配體，CXCR4 為CXCR12 已知的唯一受體，二者所形成的生物軸系統(tǒng)在包括CRC、前列腺癌、肝細(xì)胞癌及神經(jīng)母細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤的定向轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[15-16]。研究[17]表明，應(yīng)用CXCR4 拮抗劑可抑制CXCL12 所誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，通過(guò)抗CXCR4 抗體阻斷CXCR4 可抑制人CRC 細(xì)胞的黏附、增殖和遷移[3]，提示阻斷CXCR4 和CXCL12 間的相互作用能夠抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移?；|(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類高度保守的含鋅蛋白水解酶，過(guò)量的MMP 能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，破壞基底膜，進(jìn)而導(dǎo)致惡性腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[18]。MMP-9 和MMP-2 是MMPs 家族的主要成員，其在健康組織和良性組織中表達(dá)較低，而在惡性腫瘤組織及轉(zhuǎn)移瘤中有較高表達(dá)。MMP-9 和MMP-2的高表達(dá)常被作為惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的檢測(cè)指標(biāo)[19]。CXCR4 和CXCL12 的相互作用能夠介導(dǎo)MMP-9 和MMP-2 的分泌，使細(xì)胞外基質(zhì)降解加速，進(jìn)而促使腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。此外，CXCR4 與MMP-9 間可能存在協(xié)同作用，二者在 CRC 中的表達(dá)具有正相關(guān)關(guān)系，聯(lián)合檢測(cè)可作為判斷CRC 淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)[20]。

門(mén)靜脈轉(zhuǎn)移為CRC 肝轉(zhuǎn)移的主要途徑，通過(guò)脾內(nèi)注射CRC 細(xì)胞的方式能夠模擬腫瘤細(xì)胞進(jìn)入肝臟發(fā)生轉(zhuǎn)移的過(guò)程[21]。本研究采用脾臟注射CT26 細(xì)胞制備小鼠CRC 肝轉(zhuǎn)移模型，通過(guò)觀察小鼠肝臟、脾臟重量及抑瘤率評(píng)價(jià)白頭翁總皂苷對(duì)CRC 肝轉(zhuǎn)移的治療作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)白頭翁總皂苷不同劑量灌胃干預(yù)后，小鼠肝、脾及肝內(nèi)瘤組織重量均明顯減輕，提示白頭翁總皂苷可顯著抑制CRC 肝臟轉(zhuǎn)移。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）具有引起血管通透性增加，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移從而促進(jìn)血管新生的作用，是體內(nèi)最重要的促血管生成因子，能夠參與惡性腫瘤微環(huán)境的改變，促進(jìn)腫瘤血管新生[22]。內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（CD31）主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，能夠介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移并促進(jìn)血管生成，其異常表達(dá)常用來(lái)評(píng)估腫瘤血管的生成[23]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化法觀察白頭翁總皂苷對(duì)肝轉(zhuǎn)移瘤血管生成的影響，結(jié)果顯示，模型組顯著上調(diào)了肝組織中VEGF 和CD31 的陽(yáng)性表達(dá)，給予白頭翁總皂苷治療后，VEGF和CD31的表達(dá)明顯減弱，提示白頭翁總皂苷能夠通過(guò)下調(diào)VEGF 和CD31 的表達(dá)減弱CRC 細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力，抑制肝轉(zhuǎn)移瘤新生血管生成。促炎性因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF-α）可通過(guò)促進(jìn)炎性反應(yīng)的持續(xù)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增值與侵襲，其在血清中的表達(dá)水平與CRC 病程相關(guān)，IL-6、TNF-α 血清水平較高的CRC患者多預(yù)后較差[24]。ELISA 結(jié)果顯示，給予白頭翁總皂苷可下調(diào)小鼠血清中IL-6 和TNF-α 的水平，提示白頭翁總皂苷能夠減輕IL-6、TNF-α 的促炎作用來(lái)抑制CRC 的侵襲和轉(zhuǎn)移。通過(guò)蛋白和mRNA 水平兩方面檢測(cè)小鼠脾臟瘤組織中CXCR4、CXCR12 和MMP-9、MMP-2 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，白頭翁總皂苷不同劑量作用后均能明顯下調(diào)其表達(dá)的升高，提示白頭翁總皂苷可能通過(guò)下調(diào) CRC 瘤組織中CXCR4 和CXCL12 的表達(dá)，降低 MMP-9 和MMP-2 表達(dá)發(fā)揮對(duì)CRC 肝轉(zhuǎn)移的抑制作用。