信號分子介導藻類細胞程序性死亡的研究進展

黃素珍 張 璐 彭 雪 葛芳杰 劉碧云 周巧紅 吳振斌

(1. 中國科學院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

藻類是水生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分, 在水生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)、生物地球化學循環(huán)和氣候調節(jié)中發(fā)揮著關鍵作用[1]。研究發(fā)現(xiàn), 環(huán)境變化(如水體富營養(yǎng)化)既會導致藻類生物量快速增長而爆發(fā)水華,也會誘導水華的快速消退, 當前的研究認為細胞程序性死亡(Programmed cell death, PCD)可能在藻類快速消亡過程中發(fā)揮重要的作用[1]。

PCD是一種由特定基因參與調控的細胞死亡模式, 是維持多細胞生物體正常發(fā)育和穩(wěn)態(tài)的重要自我調控機制[2]。雖然PCD是多細胞生物常見的一種死亡途徑, 然而, 近年來的研究也發(fā)現(xiàn)環(huán)境脅迫下的藻類細胞在細胞形態(tài)、生理和生化等方面均有類似PCD的響應, 故在很多研究中也使用類PCD來描述藻類的死亡方式。如首先在形態(tài)學上觀察到細胞膜磷脂酰絲氨酸外翻、細胞皺縮、細胞器降解、染色質凝集、核變化和DNA片段化等PCD特征[3—6]; 其次在蛋白質水平上表現(xiàn)出具有啟動細胞PCD功能的caspase-like蛋白[3,7,8]; 并且在分子水平上還證實了藍藻、綠藻、硅藻和甲藻等均廣泛存在與多細胞生物caspase同源的基因[1,3,9—11]。藻類細胞的類PCD在種群調控中發(fā)揮著重要作用,其有可能在營養(yǎng)限制條件下通過部分細胞死亡來釋放出營養(yǎng)物以供其他細胞使用, 減輕營養(yǎng)脅迫壓力; 或是作為消除衰老和/或受損的細胞、增加生物量、限制感染期間病毒的繁殖和調控捕食者種群的策略, 從而達到為同種群其他細胞提供生存機會, 保存種群的目的[1,12—14]。

許多研究表明, 信號分子對PCD具有重要調控作用。到目前為止, 藻細胞內主要有ROS/NO/Ca2+三種信號分子。ROS/NO/Ca2+介導藻細胞類PCD的作用主要取決于其濃度。高濃度的ROS/NO/Ca2+對藻細胞具有損傷和破壞作用, 而低濃度的ROS/NO/Ca2+能夠作為信號分子來減輕環(huán)境脅迫對細胞的壓力。針對信號分子的調控作用, 本文綜述了不同的信號分子介導藻類類PCD的研究進展。

1 ROS/H2O2

活性氧(Reactive oxygen species, ROS)是生物體內正常有氧代謝的副產(chǎn)物, 在生物體的生長、脅迫適應和PCD過程中起著重要作用。高濃度的ROS會導致細胞的氧化損傷, 而低濃度的ROS能作為信號分子誘導細胞程序性死亡[15]。

此外, 在使用水生植物穗花狐尾藻分泌的次生代謝物多酚化感物質焦性沒食子酸處理的原核藍藻Microcystis aeruginosa研究中, 也觀察到了胞內ROS產(chǎn)生, ROS與核仁解體、光合片層破裂、核固縮、空泡形成、DNA斷裂化以及caspase-3-like酶活升高等類PCD的現(xiàn)象存在明顯相關性, 表明了ROS很可能介導了藍藻類PCD的發(fā)生[11]。當M.aeruginosa細胞在受到鹽度, 物理損傷(例如超聲處理), 化學除草劑以及紫外線照射時, 相對于對照,處理組檢測到H2O2濃度顯著增加。通過外源添加微摩爾濃度的H2O2可激活誘發(fā)M. aeruginosa細胞中類PCD發(fā)生的關鍵caspase-like酶, 但當藻細胞與H2O2和過氧化氫酶一起溫育時, caspase-like酶活卻被明顯抑制, 表明H2O2誘導并介導了藍藻M. aeruginosa類PCD的發(fā)生[19]。

盡管當前大部分研究認為ROS產(chǎn)生先于細胞死亡, 從而起到介導細胞的死亡的作用, 但也有研究認為caspase-like酶更早的參與到細胞的死亡[20],而這還需要進一步的證據(jù)證明。

2 NO

近年來, 一氧化氮(Nitric oxide, NO)作為細胞的一種重要信號分子受到了越來越多的關注[21]。NO是一種高活性的氣體自由基, 具有重要的生物學功能。大量的證據(jù)表明, 在多細胞生物中, NO 參與細胞抗逆性作用, 調節(jié)生長、發(fā)育過程, 被認為是誘導PCD的非生物脅迫的重要參與者[22]。一些藻類研究中也發(fā)現(xiàn)藻細胞中的NO可以很好的反映藻細胞的生長狀態(tài), 可以為監(jiān)測水華和赤潮的發(fā)生及消亡機理提供新思路[23—25]。因為NO能夠作為一種可擴散的氣態(tài)分子在細胞間進行傳遞, 并誘發(fā)藻細胞出現(xiàn)類PCD的現(xiàn)象[21,26,27]。

使用兩種不同的NO供體SNAP和SNP處理綠藻M. denticulata, 發(fā)現(xiàn)以上的處理能夠抑制M.denticulata細胞生長, 形態(tài)上表現(xiàn)出次生壁缺失、高爾基體功能受損等類PCD特征, 表明NO可能誘導類PCD的發(fā)生[28]。在綠藻Chlamydomonas reinhardtii細胞中, 黃蜂毒素誘導了NO的產(chǎn)生, 藻細胞生物量明顯降低, 同時藻細胞表現(xiàn)出核濃縮和細胞質收縮等PCD的形態(tài)學特征, 而處理體系中添加NO清除劑cPTIO后, 藻細胞內NO水平顯著降低, 藻細胞死亡率相應降低, 表明NO介導藻細胞的類PCD過程[29]。還有研究發(fā)現(xiàn), 高劑量(2 mg/mL)的反式-2,4-癸二烯醛暴露誘導了海洋硅藻Phaeodactylum tricornutum胞內NO產(chǎn)生, 并導致細胞密度顯著降低。然而, 用亞致死劑量(0.1 mg/mL)的這種醛預處理該藻細胞反而誘導了藻細胞對隨后致死劑量反式-2,4-癸二烯醛的抗性。這種現(xiàn)象可能與NO濃度有關: 低濃度的NO有利于藻細胞的生長,而高濃度的NO則促進藻細胞的死亡[26]。Vardi等[30]還發(fā)現(xiàn), 在反式-2,4-癸二烯醛暴露下, 硅藻P. tricornutum細胞編碼與NO合成相關蛋白的基因PtNOA1的表達水平上升。過量表達PtNOA1可引發(fā)藻細胞內NO濃度升高, 導致質體MnSOD表達被抑制、光合效率和生長速率下降、基因metacaspase表達量上升以及caspase-like活性增加等, 表明了NO在類程序性細胞死亡中的重要作用。在硅藻S. costatum中, 當光系統(tǒng)Ⅱ和光系統(tǒng)Ⅰ之間的電子流被阻斷時, 死亡特異性蛋白ScDSP-1高度表達。當采用NO供體Diethylamine nitric oxide處理后, 也顯著誘導ScDSP-1表達, 并且該誘導型表達可被NO清除劑抑制。此外, 若在光系統(tǒng)Ⅱ和光系統(tǒng)Ⅰ之間的電子流被阻斷前, 使用NO清除劑預處理藻細胞, ScDSP-1的表達被顯著降低。這些研究結果表明NO是指示ScDSP-1表達的關鍵第二信使[31]。由于ScDSP-1具有在藻細胞脅迫適應與類PCD之間進行切換的功能, 推測NO也是作為類PCD關鍵信號分子。熱應激也會導致共生雙鞭毛藻Symbiodinium microadriaticum藻細胞死亡率上升, NO水平增加, caspase-3-like酶活性升高, 但運用caspase-3特異性抑制劑可部分(65%)的抑制caspase-3-like酶活性的上升。此外, 如果在實驗的處理組中補充NO供體SNP和NOC-18, 則可以顯著提高 caspase-3-like酶活性, 但若在添加不同的NO供體之前, 實驗系統(tǒng)用caspase-3特異性抑制劑預處理藻細胞, 則可以完全阻止caspase-3-like酶活性的增加。這些研究結果表明NO可通過介導 caspase 3-like活性的增加在細胞死亡中發(fā)揮作用[32]。

類似的現(xiàn)象在藍藻M. aeruginosa中也觀察到,在化感物質N-苯基-1-萘胺暴露下, 藻細胞NO濃度顯著升高, caspase-3-like酶活性也顯著上升, 且單獨NO溶液或NO外源供體SNP處理均可以引起藻細胞的生長抑制[33]。另一項研究表明外源NO供體SNP誘導了藻細胞NO濃度的增加和caspase-3-like酶活性升高, 但并未檢測到ROS水平升高[34]。這些研究均表明了caspase-3-like酶活性升高與NO濃度有關,NO水平的上升可加劇M. aeruginosa的類程序性細胞死亡。在共培養(yǎng)條件下, 穗花狐尾藻通過釋放次生代謝物化感物質來抑制M. aeruginosa的細胞生長, 誘導藻細胞NO過量產(chǎn)生并上調caspase-3-like酶活性, 進而引發(fā)藻細胞類PCD的發(fā)生[34]。上述結果進一步表明NO在類PCD過程的重要作用。

3 Ca2+

Ca2+是細胞中重要第二信使, 它的生物學功能非常多樣化, 包括了細胞周期、基因表達和細胞程序性死亡等。在高等動植物細胞中, 處于一定濃度水平的ROS與NO可以調控細胞的死亡途徑包括PCD[35]。在正常情況下, 與大多數(shù)多細胞生物一樣,藻細胞的Ca2+水平非常低。但當藻細胞遭受環(huán)境脅迫時, 胞內積累的高濃度游離Ca2+將會影響到藻細胞生長, 且不同的藻細胞受到的影響可能會不一樣。

在類PCD過程中, 藍藻細胞可能具有不同的Ca2+信號轉導途徑。在藍藻Anabaena中, 鹽脅迫(KCl或NaCl)誘導了藻細胞類PCD的發(fā)生, 藻細胞表現(xiàn)出PCD的特征, 包括質膜完整性喪失, 細胞質空泡化, 液泡中的蛋白酶活性增加, DNA含量降低,特異性DNA片段化, 細胞進行解體, 破裂以及隨后的細胞自溶等, 但在實驗系統(tǒng)中補充0.1 mol/L CaCl2的實驗體系中, 活細胞數(shù)量顯著增加, DNA片段化的細胞數(shù)量顯著減少, 且樣品處理的時間越長,Ca2+拮抗鹽脅迫對細胞死亡的影響作用就越顯著。但若在這些實驗中用Mg2+代替Ca2+時, 并未觀察的類PCD現(xiàn)象。這些結果表明, Ca2+可以阻斷或減緩鹽脅迫誘導的細胞程序性死亡[36]。但也有研究發(fā)現(xiàn), Ca2+水平升高在啟動藻細胞類PCD過程中起著關鍵性作用。例如在藍藻M. aeruginosa中, Ca2+引起藻細胞死亡的最低作用濃度為0.1 mol/L; 在Ca2+作用下,M. aeruginosa細胞表現(xiàn)出細胞內含物有規(guī)律、有步驟的降解, 細胞徹底瓦解前只剩下類囊體搭建的細胞框架, 同時, 在細胞死亡過程中還觀測到了DNA斷裂與caspase-3-like酶活性升高[37]。

在真核藻類中, Ca2+信號似乎也與類細胞程序性死亡的緊密相關。在綠藻C. reinhardtii中, 三氯生24h內顯著誘導胞質游離Ca2+水平上升, 這與細胞質膜完整性喪失和去極化、線粒體膜去極化、caspase 3/7酶活性上升以及指示類PCD的metacaspase基因的表達增加等PCD特征的出現(xiàn)密切相關,但外源添加的胞內鈣離子螯合劑BAPTA-AM在較短時間內(1h和4h)完全消除或是在24h后部分(30%)消除了這種胞質游離Ca2+水平的升高, 并抑制了類PCD的發(fā)生, 表明Ca2+可能誘導了類PCD的發(fā)生[38]。在硅藻P. tricornutum中, 反式-2,4-癸二烯醛以劑量依賴的方式觸發(fā)了藻細胞Ca2+的釋放, 持續(xù)數(shù)分鐘后又恢復到基礎水平。該醛引發(fā)藻細胞內Ca2+瞬變和隨后的NO的產(chǎn)生, 進一步導致了細胞死亡的發(fā)生, 表明NO參與調控類PCD過程[26]。

4 信號分子H2O2、NO和Ca2+間的級聯(lián)關系

所有上述研究結果表明了, H2O2/NO/Ca2+在觸發(fā)藻類細胞PCD的過程中起到關鍵信號分子的作用。前期研究表明ROS、NO和Ca2+可以單獨或者相互地在高等動植物細胞死亡過程中發(fā)揮生物學作用, 然而到目前為止它們三者間的關系仍然不明確, 但是研究結果證明它們之間具有十分復雜而靈活的關系[39—41]。與高等動植物細胞一樣, 在藻類細胞受到環(huán)境脅迫時, 一些藻類細胞中的ROS、NO和Ca2+也顯示出復雜的作用關系。

在高等植物細胞PCD研究體系中, 有研究發(fā)現(xiàn)位于H2O2/NO下游的Ca2+水平的變化[42—45], 但在藻類細胞中, 研究發(fā)現(xiàn)Ca2+可以位于H2O2/NO上游。例如三氯生在綠藻C. reinhardtii細胞中促進了ROS的大量產(chǎn)生, 包括超氧陰離子和H2O2, 但在用胞內鈣螯合劑BAPTA-AM預處理時卻可顯著減少ROS含量, 表明Ca2+在由三氯生誘導的藻細胞內ROS過量產(chǎn)生中起作用。通過使用胞質游離Ca2+螯合劑BAPTA-AM和抗氧化劑NAC, 發(fā)現(xiàn)ROS產(chǎn)生和胞質游離Ca2+水平增加之間存在相互聯(lián)系。由于BAPTA-AM的作用較大且明顯抑制了三氯生誘導的ROS, 因此推測三氯生首先上調了藻細胞胞質游離Ca2+水平, 隨后激活了ROS的產(chǎn)生。但是, 由于NAC在一定程度上也抑制了胞質游離Ca2+水平的升高, 表明了ROS的產(chǎn)生可能進一步增加了藻細胞中的Ca2+水平[38]。與機械損傷后的D. vermicularis細胞對比, 將機械損傷之前的D. vermicularis細胞與Ca2+離子載體A23187一起溫育, A23187能夠將H2O2水平提高35%, 而在與100 μmol/L 鈣離子通道阻斷劑methoxyverapamil一起溫育下, H2O2水平降低了20%。這說明Ca2+與H2O2存在著強烈的信號轉導作用, H2O2濃度的增加依賴于Ca2+水平的升高[46]。在海洋硅藻P. tricornutum中, 反式-2,4-癸二烯可顯著誘導鈣離子依賴性一氧化氮合成酶活性上升, 這一結果表明NO可能在信號級聯(lián)中位于Ca2+下游; 如果在P. tricornutum中添加可提高Ca2+濃度的試劑(如nifedipine), 硅藻細胞NO濃度也表現(xiàn)出升高趨勢, 同時藻細胞死亡率提高, 但是, 如果將NO供體DEANO和SNP添加到藻細胞中, 不論是短期或長期處理均未導致藻細胞內Ca2+濃度的增加, 進一步證實NO位于Ca2+下游[26]。

對于環(huán)境脅迫下藻細胞內H2O2產(chǎn)生先于NO,或是NO位于H2O2上游, 目前仍然存在著分歧。在機械損傷的海洋綠藻D. vermicularis中, 檢測到H2O2和NO的產(chǎn)生, 且NO的產(chǎn)生早于H2O2產(chǎn)生(分別為25min和45min)[46]。對綠藻C. vulgaris的研究發(fā)現(xiàn), 除草劑阿特拉津在誘導其藻細胞死亡的過程中, 不同程度促進了H2O2和NO的生成, 通過觀察NO和H2O2到達峰值的時間(分別為14min和6min),推測NO位于H2O2的下游[47]。

目前藻類細胞中信號分子間的級聯(lián)關系的系統(tǒng)性研究很少。在海洋綠藻Ulva compressa中, 亞致死劑量銅誘導的H2O2、NO和Ca2+水平升高, 并且H2O2、NO和Ca2+三者之間存在相互作用: Ca2+可以激發(fā)H2O2和NO的合成, H2O2和NO水平升高也可以導致Ca2+釋放的增加; H2O2可以激活NO合成, 但NO的合成卻并未導致H2O2濃度的變化[48]。信號分子在不同的藻細胞中可能具有不同的級聯(lián)關系, 這些信號分子之間如何合作或獨立地調控藻細胞生理活性, 還需要繼續(xù)開展更多的系統(tǒng)性研究。

5 展望

在一般情況下, 水生態(tài)系統(tǒng)的藻類群落處于一個相對平衡狀態(tài), 但是, 是什么因素誘發(fā)了平衡迅速的打破, 導致水華的快速爆發(fā)或水華消退？這是值得思考的問題, 或許信號分子在此過程中起著重要的作用。針對信號分子在藻細胞PCD過程中尚待揭示的機制, 建議開展以下方面工作:

(1)目前許多研究主要是通過外源供體和抑制和/或清除劑來驗證信號分子介導藻類PCD過程的作用, 但由于信號分子與caspase-like酶上升間隔時間短, 難以區(qū)分先后, 故ROS/NO/Ca2+是否直接作為信號分子觸發(fā)藻細胞的PCD還需進一步的證據(jù)。未來應進一步開展參與PCD過程相關基因和蛋白質的鑒定與表達研究。(2)不同來源途徑的信號分子的研究必將大大的促進信號分子是如何作用于藻類PCD的研究。不同來源途徑的信號分子在藻類中是如何協(xié)作、哪些途徑在特定的位置或者特定的時間起作用, 這些均應是未來重點研究的方向。(3)由于信號分子在藻類生命活動過程中具有重要的作用, 但這取決于其在細胞中的濃度。因此,定量信號分子的胞內濃度對探索信號分子的生理作用具有重要意義。但高精度的測定藻類細胞內信號分子的絕對濃度的技術還有待研發(fā), 這對于認識藻類細胞PCD過程中的信號轉導具有重要意義。(4)在環(huán)境脅迫條件下, 藻類細胞PCD過程中的信號分子間級聯(lián)關系研究較少, 研究也缺乏系統(tǒng)性。加強對藻類特別是單細胞藻類環(huán)境脅迫下信號分子的系統(tǒng)研究, 對揭示藻類消亡和種群演替具有深遠的意義, 也將為人工預防和控制水華藻類提供新的思路。