夏枯草多糖提取純化及其藥理作用研究進展

趙二勞 劉樂 范建鳳 趙三虎

（忻州師范學(xué)院化學(xué)系，忻州 034000）

夏枯草（Prunella vulgarisL.）為唇形科（Labiatae）夏枯草屬植物，為傳統(tǒng)中藥，我國主產(chǎn)于安徽、江蘇、湖南和浙江等地［1-2］，資源豐富。夏枯草性寒，味辛、苦，歸肝膽經(jīng)，具有清肝明目、清熱利尿、散結(jié)消腫之功效，常用于治療肝火郁結(jié)、目赤腫痛、急性肝炎和高血壓等癥［3］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，夏枯草中含有多糖，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫活性、抗病毒及抗腫瘤等藥理作用，在食品、醫(yī)藥、保健品等行業(yè)有良好的應(yīng)用前景［4-6］。研究夏枯草多糖的提取純化及其藥理作用，對于合理開發(fā)應(yīng)用夏枯草多糖、有效拉長夏枯草產(chǎn)業(yè)鏈，提高夏枯草經(jīng)濟價值具有重要的實際意義。但目前未見有關(guān)夏枯草多糖提取純化及其藥理作用的總結(jié)報告?；诖耍疚氖崂砭C述我國關(guān)于夏枯草多糖提取純化及藥理作用的研究進展，并展望其研究方向，旨為夏枯草多糖的進一步研究和開發(fā)利用提供參考。

1 夏枯草多糖提取方法

植物多糖提取方法有多種［7-9］，但目前國內(nèi)有關(guān)夏枯草中多糖提取方法僅有熱水浸提法、超聲輔助提取法和酶提取法的研究報道。

1.1 熱水浸提法

熱水浸提是最常用的多糖提取方法，它根據(jù)多糖易溶于熱水而不溶于高濃度醇溶液的性質(zhì)，采用水提醇沉將多糖提取沉淀出來［10］。熊雙麗等［11］研究了夏枯草多糖的熱水浸提工藝，通過正交試驗發(fā)現(xiàn)影響多糖提取率的因素大小順序：料液比＞提取溫度＞提取時間，優(yōu)化的最佳提取工藝：提取溫度90℃，提取時間4 h，料液比1 ∶35（g/mL）。該工藝條件下，夏枯草多糖提取率達5.39%。張德華［12］以經(jīng)石油醚脫脂、乙醇去醇溶性物質(zhì)的夏枯草為原料，采用正交試驗優(yōu)化的多糖熱水浸提最佳工藝條件：料液比1 ∶20（g/mL），提取溫度90℃，提取時間4 h，提取次數(shù)3 次。夏枯草多糖提取率為14.7%。孔思遠(yuǎn)等［13］研究確定的夏枯草多糖熱水浸提工藝為：第一次加水14 倍，第2、3 次加水12 倍，提取3 次，每次提取時間1.5 h。該工藝下，夏枯草多糖提取量為18.69 mg/g。顯而易見，熱水浸提夏枯草多糖重現(xiàn)性好，操作簡單，成本低廉，對設(shè)備要求低，多糖提取率較高，適于工業(yè)化生產(chǎn)，但也存在提取時間長，產(chǎn)品雜質(zhì)含量多，效益較差等問題。目前熱水浸提法是國內(nèi)夏枯草多糖提取研究的主要方法，但僅限于實驗室研究。

1.2 超聲輔助提取法

超聲輔助提取是在熱水浸提的基礎(chǔ)上，輔以超聲波，其利用超聲波產(chǎn)生的強烈機械、熱學(xué)及空化等效應(yīng)，促進細(xì)胞周圍形成微流，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，提高細(xì)胞通透性，增加溶劑的穿透力和加速多糖釋放、擴散和溶出，提高多糖的提取率［14-15］。目前，國內(nèi)利用超聲輔助提取夏枯草多糖的研究不多，李超［10］研究了超聲輔助提取夏枯草多糖，響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳提取工藝條件：料液比1 ∶25（g/mL），超聲功率210 W，提取溫度70℃，提取時間50 min。在此工藝條件下，夏枯草多糖提取率為2.11%。趙志剛等［16］采用單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面分析的方法，優(yōu)化的超聲輔助提取夏枯草多糖工藝條件：超聲功率90 W，超聲溫度65℃，料液比1 ∶40（g/mL），超聲時間52 min，提取次數(shù)2 次。該工藝下多糖提取率可達4.6%。可見，超聲輔助提取夏枯草多糖具有操作方便，提取溫度低無需專門加熱，提取時間短，成本低廉，提取效益好等優(yōu)勢，但因超聲波會對環(huán)境造成污染，影響人體健康，且放大生產(chǎn)的超聲提取設(shè)備還未解決，夏枯草多糖的超聲輔助提取仍處于實驗室研究的初級階段，尚未實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

1.3 酶提取法

酶提取是近十幾年來發(fā)展的一項生物工程技術(shù)，酶提取夏枯草多糖就是在浸提過程中加入相應(yīng)的酶，分解夏枯草細(xì)胞壁，強化多糖傳質(zhì)過程，加速多糖的釋放，提高提取率［14，17］。目前，國內(nèi)利用酶提取夏枯草多糖的研究不多，僅有文獻1 篇。金辰光等［18］利用復(fù)合酶提取夏枯草多糖，響應(yīng)面優(yōu)化得到對夏枯草多糖提取率的影響因素次序為：酶解pH值＞酶添加量＞酶解溫度＞料液比。最佳提取工藝條件：酶添加量2%（纖維素酶0.4%，果膠酶0.8%，木瓜蛋白酶0.8%），料液比1 ∶50（g/mL），酶解溫度61℃，酶解pH 值6.2。此工藝條件下，多糖得率為11.57%±0.48%。與熱水浸提相比，該法具有提取條件溫和，耗時短，對多糖的結(jié)構(gòu)破壞性較小，多糖提取率較高等優(yōu)點，但也存在提取成本和對設(shè)備要求相對較高，需嚴(yán)格控制提取液pH 值，不適宜工業(yè)化應(yīng)用等問題，目前也僅用于實驗室研究。

綜上夏枯草多糖提取研究現(xiàn)狀，不難發(fā)現(xiàn)，目前國內(nèi)夏枯草多糖的提取研究總體上還處在研究的初級階段，對夏枯草多糖提取研究還不夠深入，而一些現(xiàn)代的天然產(chǎn)物中多糖提取技術(shù)，如微波輔助提取、雙水相體系萃取、超臨界流體萃取等技術(shù)還未見研究應(yīng)用報道。極有必要對已有提取工藝進行深入研究，同時開展對夏枯草多糖的現(xiàn)代提取技術(shù)應(yīng)用研究，優(yōu)選出高效的適于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的夏枯草多糖提取技術(shù)。

2 夏枯草多糖純化技術(shù)

經(jīng)上述工藝提取的夏枯草多糖，一般都含有多種雜質(zhì)，不僅影響產(chǎn)品外觀性狀，而且難以滿足多糖結(jié)構(gòu)和活性研究以及實際應(yīng)用需要，因此必須進一步純化，制備純度較高或相對均一的多糖［19-20］。張敏等［21］對夏枯草粗多糖經(jīng)大孔樹脂吸附后用雙氧水脫色，透析，再經(jīng)過DEAE 凝膠色譜分級（流速6 mL/min 不同洗脫液分別洗脫）純化，得到4 個級分的夏枯草精多糖，經(jīng)HPLC 測定表明其中PPSP3為主要成分，其多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為81.44%，相對分子質(zhì)量為8.3×105。其單糖組成為半乳糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖等。王瑩瑩等［4］對夏枯草粗多糖用HZ-820 大孔吸附樹脂脫色和去蛋白，再經(jīng)DEAE-Sepharose 離子交換柱色譜和Sephades G-50 凝膠柱色譜進一步純化得到高純度酸性多糖，其含有鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖，重均相對分子質(zhì)量為57 234。夏翠等［22］研究了夏枯草粗多糖的脫色純化發(fā)現(xiàn)，3 種大孔吸附樹脂HZ-820、HZ-801 和HZ-806 均有較好的脫色、蛋白去除和總糖保留效果。正交試驗優(yōu)化的最佳純化條件為：HZ-820 樹脂，pH 4.5，溫度35℃。此條件下夏枯草粗多糖脫色率可達86.77%，蛋白質(zhì)去除率89.73%，多糖保留率為60.37%。張霞等［23］研究了夏枯草粗多糖的乙醇分級純化，利用從低到高6種不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液依次醇沉粗多糖，從而獲得6個多糖組成，分析檢驗得出這6 種多糖均為酸性多糖，都含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖等。

綜上，雖然有關(guān)對天然產(chǎn)物中提取的粗多糖純化技術(shù)較多［7，19-20］，但目前國內(nèi)有關(guān)夏枯草多糖的分離純化研究應(yīng)用還不多。采用的純化技術(shù)主要有不同體積分?jǐn)?shù)乙醇分級、大孔樹脂吸附法、離子交換色譜法和凝膠柱色譜法，對所提夏枯草多糖純化主要是去蛋白和脫色。同時也可知，需采用幾種方法聯(lián)合進行，才能達到較為理想的純化效果。真正適于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的夏枯草多糖純化技術(shù)，也僅限于大孔樹脂吸附法的研究。因此，有關(guān)夏枯草粗多糖純化技術(shù)的研究還需繼續(xù)深入。

3 夏枯草多糖的藥理作用

目前國內(nèi)有關(guān)夏枯草多糖藥理作用的研究較少，主要有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤以及抗病毒作用等。

3.1 抗氧化作用

由于內(nèi)源性或外源性原因，人體內(nèi)會產(chǎn)生過量的自由基，會氧化損傷機體細(xì)胞，導(dǎo)致人體器官衰老、病變甚至癌變。許多天然多糖都具有清除自由基、抗氧化作用。目前，國內(nèi)學(xué)者對夏枯草多糖抗氧化作用的研究相對較多，且多以體外作用為主。金辰光［24］研究發(fā)現(xiàn)夏枯草粗多糖和純化多糖對DPPH·的IC50分別為0.91 和0.87 mg/mL；對·OH的IC50分別為1.35 和1.26 mg/mL；對O2-·的IC50分別為0.53 和0.46 mg/mL。表明夏枯草多糖對供試的3 種自由基均具有較強的清除作用，純化多糖的清除作用強于粗多糖。施曉丹等［25］研究發(fā)現(xiàn)夏枯草水溶性多糖對DPPH·、·OH 和O2-·也具有明顯清除作用。張德華［26］研究證明夏枯草多糖不但對·OH 和O2-·具有清除作用，而且對亞硝酸根也具有清除作用，還可有效抑制紅細(xì)胞氧化作用和顯著地抑制·OH 誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化作用。魏明等［27］研究表明純化的夏枯草水溶性多糖具有顯著的DPPH·和·OH 清除活性。王瑩瑩等［28］研究表明純化的夏枯草酸性多糖及其衍生物對ABTS+·和NO2

-·均具有一定的清除作用。熊雙麗等［11］的研究則表明，夏枯草多糖不但對·OH 和DPPH·具有強的清除能力，而且對卵磷脂脂質(zhì)過氧化損傷具有明顯的抑制作用，并呈明顯量效關(guān)系。另外，李超［10］體外抗氧化實驗發(fā)現(xiàn)，夏枯草粗多糖具有良好的DPPH 和ABTS+自由基清除能力及鐵還原抗氧化能力；分離純化的夏枯草3 種多糖組分PVP1、PVP2和PVP3對DPPH、ABTS+、過氧化自由基均具有明顯的清除能力，以及對細(xì)胞具有強的抗氧化作用。體內(nèi)抗氧化實驗研究發(fā)現(xiàn)，夏枯草多糖能夠提高大鼠血清中超氧化歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，表明夏枯草多糖具有體內(nèi)抗氧化作用。綜上可知，體內(nèi)外抗氧化研究均表明，夏枯草多糖具有較強的清除自由基抗氧化作用。但夏枯草多糖提取、純化方法不同，其抗氧化活性明顯不同，這既可能與夏枯草來源有關(guān)，也反映提取純化方法不同，所得多糖的組成、結(jié)構(gòu)不同。因此，對于夏枯草多糖的提取純化方法的選擇，既要考慮多糖的提取純化產(chǎn)率，更要考慮所得多糖的活性。

3.2 調(diào)節(jié)免疫功能

夏枯草中多糖可調(diào)節(jié)免疫功能。陸鷹等［29］研究了環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下模型小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)經(jīng)灌胃夏枯草多糖中、高劑量，能顯著提高免疫功能低下小鼠臟器指數(shù)，增強腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，促進血清溶血素生成及溶血空斑形成，并具有一定的劑量依賴性，顯示夏枯草多糖具有良好的免疫增強活性。張敏等［21］免疫學(xué)實驗證明夏枯草多糖可顯著促進小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，對小鼠的廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)有明顯的促進作用，表明夏枯草多糖對小鼠特異性及非特異性免疫均有顯著促進作用。張瑞［30］研究表明夏枯草多糖能提高HIV-1（人類免疫缺陷病毒）感染者低下的IL-2水平，在一定程度上糾正異常免疫功能狀態(tài)。另外，李超［10］研究表明夏枯草多糖能激活小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.7 分泌細(xì)胞免疫因子，且通過動物體內(nèi)實驗證明，夏枯草多糖能有效提高大鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及血清中免疫細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6 的含量。由上可知，夏枯草多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，提示我們膳食夏枯草多糖可調(diào)節(jié)免疫功能，增強人體免疫功能。

3.3 抗腫瘤作用

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明腫瘤新生血管不但可給腫瘤的發(fā)生、生長提供所需營養(yǎng)物質(zhì)和氧，而且可作為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的通道，所以抑制腫瘤血管的形成、生長就可抑制腫瘤。王雅楠等［31］發(fā)現(xiàn)夏枯草多糖能明顯抑制肝癌細(xì)胞中血管生成因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF），并能減少肝癌組織塊中的微血管密度，認(rèn)為夏枯草多糖通過抑制腫瘤血管生成和生長而抑制腫瘤的發(fā)生或生長。肝組織纖維化也會進一步惡化致癌，抑制肝纖維化可預(yù)防肝癌。付月月等［6］采用CCI4-橄欖油溶液腹腔注射誘導(dǎo)大鼠肝纖維化造模，以及細(xì)胞增殖與活性法研究了夏枯草硫酸多糖對大鼠肝纖維化及TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6 細(xì)胞增殖影響，發(fā)現(xiàn)夏枯草多糖可明顯減輕模型大鼠肝纖維化程度，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6 細(xì)胞增殖，表明夏枯草硫酸多糖具有很好的抗大鼠肝纖維化作用，預(yù)防肝硬化及肝癌。其作用機制可能與抑制肝星狀細(xì)胞活化及抑制膠原合成與沉積、減少細(xì)胞外基質(zhì)的生成并促進其降解有關(guān)。李超［10］研究表明夏枯草多糖對HepG2、SCG-7901和MCF-7 三種癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，并呈劑量依賴關(guān)系，當(dāng)夏枯草多糖濃度為2.0 mg/mL時，對HepG2、SCG-7901 和MCF-7 三種癌細(xì)胞的增殖抑制率分別達51.2%、35.2%和31.8%，而對正常細(xì)胞LO2 的毒性則遠(yuǎn)弱于癌細(xì)胞。綜上所述，國內(nèi)學(xué)者從不同的側(cè)面研究表明，夏枯草多糖具有防癌、抗腫瘤活性，具有作為抗癌藥物臨床應(yīng)用的潛在前景。

3.4 抗病毒作用

孔思遠(yuǎn)等［13］和姜玲海等［32］的抗病毒實驗和免疫學(xué)實驗都發(fā)現(xiàn)夏枯草多糖具有抗單純性皰疹病毒（HSV）的活性，認(rèn)為其作用機制可能不是直接作用于病毒的復(fù)制環(huán)節(jié)，而是通過阻止病毒吸附和穿入宿主細(xì)胞，以及促進淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖和誘生干擾素免疫調(diào)節(jié)等起抗病毒作用。另外，蔡雙璠等［33］采用空斑減數(shù)法研究了夏枯草多糖體外條件下抗單純性皰疹病毒作用，采用建立HSV-1（皮膚）和HSV-2（外陰部）病毒感染豚鼠模型研究了夏枯草多糖體內(nèi)條件下抗單純性皰疹病毒作用，表明在體外和體內(nèi)條件下夏枯草多糖均具有抗單純性皰疹病毒的活性，提示夏枯草多糖具有開發(fā)成為抗單純性皰疹病毒藥物的潛在價值。

4 展望

糖生物學(xué)的發(fā)展，為生物活性多糖的研究提供了機遇和挑戰(zhàn)，使生物活性多糖的研究日益受到人們的關(guān)注。夏枯草多糖作為一種藥理作用廣泛的生物多糖，有重要的臨床應(yīng)用價值和開發(fā)應(yīng)用前景。目前，國內(nèi)對夏枯草多糖提取、純化及藥理作用進行了一定研究，也取得不少成果，但總體而言，既缺乏研究的廣度，更缺乏研究的深度，遠(yuǎn)未達到夏枯草多糖開發(fā)應(yīng)用所需的基本理論要求。因此，未來的研究應(yīng)：深入開展夏枯草中多糖的提取、純化研究，可參考借鑒其它天然產(chǎn)物中多糖的提取純化工藝技術(shù)，創(chuàng)新夏枯草中多糖提取、純化工藝，進而實現(xiàn)夏枯草中多糖的高效提取、純化，為夏枯草多糖分子結(jié)構(gòu)及活性研究創(chuàng)造條件和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)的理論依據(jù)；多角度深入開展夏枯草多糖藥理作用的理論研究和臨床應(yīng)用研究，著力解決夏枯草多糖與藥理作用的構(gòu)效、量效關(guān)系、作用機制，為夏枯草多糖的開發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)?？傮w達到夏枯草多糖的規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，使夏枯草多糖在大健康時代延緩人體衰老、促進人類健康、實現(xiàn)人們對美好生活追求中發(fā)揮更加積極的作用。