不同表型支氣管哮喘患者表皮生長因子及血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)及其臨床意義

穆清爽 古力鮮·馬合木提 努爾阿米娜·鐵力瓦爾地 黎 靜

新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科，新疆烏魯木齊 830063

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞、炎性因子及生長因子參與的慢性炎癥性疾病，我國支氣管哮喘的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重危害患者的健康及生活質(zhì)量[1-2]。支氣管哮喘的表型可根據(jù)主要參與的炎癥細(xì)胞類型進(jìn)行分類，即嗜酸性粒細(xì)胞表型組和中性粒細(xì)胞表型組[3]。不同細(xì)胞表型的支氣管哮喘患者的疾病特點、治療方式及預(yù)后均有所差異，針對兩種表型的不同免疫反應(yīng)、臨床特點進(jìn)行深入研究，有助于臨床對支氣管哮喘患者進(jìn)行更為精準(zhǔn)的診斷及治療。表皮生長因子（EGF）是一種由53 個氨基酸殘基組成的活性多肽，與表皮生長因子受體（EGFR）結(jié)合后，可通過胞內(nèi)激酶區(qū)自身磷酸化調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)。而血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種由二硫鍵交聯(lián)形成的糖蛋白二聚體，主要來源為外周嗜酸性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等。既往研究顯示[4-6]，EGF、VEGF 在支氣管哮喘患者疾病進(jìn)程中的氣道炎癥改變、高敏反應(yīng)及氣道重塑中可能起到了重要的作用，可促進(jìn)表皮細(xì)胞和纖維母細(xì)胞、炎癥細(xì)胞的化學(xué)趨向移動、分化、增殖，在維護(hù)上皮組織完整、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)和細(xì)胞生存均起著重要作用。但在不同表型支氣管哮喘患者中的差異性仍需進(jìn)一步研究，同時能夠指導(dǎo)臨床完善不同表型支氣管哮喘的診治流程。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年8 月～2018 年12 月就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院的急性支氣管哮喘患者90 例為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合2016 年中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘組制訂的《支氣管哮喘防治指南》[7]；②年齡25～74 歲；③處于急性發(fā)作期，入院后經(jīng)過規(guī)范化治療，治療原則參考2016 版《支氣管哮喘防治指南》[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病、肺結(jié)核等其他肺部疾??；②存在心、肝、腎等重要臟器的嚴(yán)重疾?。虎酆喜盒阅[瘤、自身免疫疾??；④妊娠及哺乳期婦女。根據(jù)誘導(dǎo)痰細(xì)胞分型[8]將研究對象分為中性粒細(xì)胞表型組（中性粒細(xì)胞≥61%，24 例）和嗜酸性粒細(xì)胞表型組（嗜酸粒細(xì)胞≥3%，66 例）。

1.2 肺功能測定

采用BTL-08（SpiroBTL Industries Limited）肺功能測量儀測量所有患者第1 秒用力肺活量（FEV1）、FEV1/用力呼氣體積（FVC）、第1 秒用力呼氣容積占預(yù)計值的百分比（FEV1%pred）。所有受試者均行肺功能檢查后FEV1%pred＞65%，進(jìn)行下一步痰誘導(dǎo)。

1.3 痰液及血清標(biāo)本的采集及檢測

所有患者均參照歐洲呼吸協(xié)會誘導(dǎo)痰液指導(dǎo)小組的指南進(jìn)行誘導(dǎo)痰技術(shù)[9]：晨起禁食，吸入沙丁胺醇?xì)忪F劑（上海信誼藥廠有限公司，批號：20161124）200 μg 后吸入超聲霧化4.5%高滲鹽水20 min。并鼓勵患者咳嗽，對咳出的痰液進(jìn)行收集。痰誘導(dǎo)過程中如出現(xiàn)呼吸困難等癥狀立即停止痰誘導(dǎo)。痰液標(biāo)本均在2 h 內(nèi)進(jìn)行處理，采用4 倍體積于痰液標(biāo)本的0.1%二硫蘇糖醇（Genview，批號：20170219）對痰液進(jìn)行液化，搖勻后置于37℃水浴孵育15 min，震蕩離心后取沉淀細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞總數(shù)。對沉淀涂片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，計算嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計數(shù)和百分比。同時將痰液標(biāo)本上清置于-80℃保存待檢。所有患者于清晨空腹抽取靜脈血2 mL，1000 r/min，離心10 min，離心半徑為10 cm，收集上清液于-80℃保存待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測痰液上清液及血清中EGF、VEGF 的水平，所有操作流程均嚴(yán)格依照試劑盒（北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司，批號：20161229）說明操作，檢測儀器為貝克曼庫爾特AU5800 全自動生化分析儀。采用免疫比濁法測量IgE，檢測儀器為貝克曼庫爾特自動免疫化學(xué)分析儀IMMAGE 800。血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血清嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）百分比檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t 檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)表示，采用χ2檢驗。采用Pearson 檢驗進(jìn)行相關(guān)性分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基線資料比較

中性粒細(xì)胞表型組EOS 顯著低于嗜酸性粒細(xì)胞表型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；而年齡、性別、血清IgE 水平、FEV1%pred 在兩組患者中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 兩組患者基線資料比較（）

表1 兩組患者基線資料比較（）

注：EOS：血清嗜酸性粒細(xì)胞；IgE：血清免疫球蛋白E；FEV1%pred：第1 秒用力呼氣容積占預(yù)計值百分比

2.2 兩組患者血清EGF、VEGF 水平比較

嗜酸性粒細(xì)胞表型組血清EGF、VEGF 水平顯著高于中性粒細(xì)胞表型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者血清EGF、VEGF 水平比較（ng/L，）

表2 兩組患者血清EGF、VEGF 水平比較（ng/L，）

注：EGF：表皮生長因子；VEGF：血管內(nèi)皮生長因子

2.3 兩組患者誘導(dǎo)痰EGF、VEGF 水平比較

嗜酸性粒細(xì)胞表型組誘導(dǎo)痰EGF、VEGF 水平顯著高于中性粒細(xì)胞表型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表3。

表3 兩組患者誘導(dǎo)痰EGF、VEGF 水平比較（ng/L，）

表3 兩組患者誘導(dǎo)痰EGF、VEGF 水平比較（ng/L，）

注：EGF：表皮生長因子；VEGF：血管內(nèi)皮生長因子

2.4 血清EOS 與EGF、VEGF 相關(guān)性分析

血清EOS 與血清EGF、VEGF 均呈正相關(guān)（r=0.513，P=0.032；r=0.397，P=0.031），與誘導(dǎo)痰EGF、VEGF 水平呈正相關(guān)（r=0.378，P=0.005；r=0.528，P=0.000）。

3 討論

支氣管哮喘的發(fā)生和發(fā)展可能受到遺傳、環(huán)境、免疫、生活方式等多種因素影響[10]，根據(jù)炎癥類型通常可被分為嗜酸性粒細(xì)胞表型和中性粒細(xì)胞表型。嗜酸粒細(xì)胞表型哮喘被認(rèn)為是哮喘的一種重要亞型，可能與哮喘的嚴(yán)重程度、遲發(fā)性疾病和糖皮質(zhì)激素敏感相關(guān)[11-12]。嗜酸性粒細(xì)胞表型哮喘與變應(yīng)性致敏及Th2 細(xì)胞炎性反應(yīng)有關(guān)[13]，致敏后的活化細(xì)胞進(jìn)入氣道，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)的發(fā)生，提示哮喘病情的惡化。而中性粒細(xì)胞表型哮喘通常對糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)效果較差，常常導(dǎo)致氣道基底膜增厚，急性加重期氣道分泌物中性粒細(xì)胞增多，痰中白細(xì)胞介素（IL）-8 水平升高[3,14]。中性粒細(xì)胞表型哮喘對糖皮質(zhì)激素具有相對的抵抗力[15]。對于不同表型的支氣管哮喘患者有效治療手段具有一定差異[16]，誘導(dǎo)痰細(xì)胞計數(shù)是鑒別不同表型哮喘的“金標(biāo)準(zhǔn)”[11]。然而操作流程復(fù)雜，對肺功能較差的患者具有一定危險性，臨床上迫切需要一種非侵入性、簡便、快捷的方法進(jìn)行分型。而既往研究[17]提示，生長因子在支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展中可能起著重要的作用，不同表型的支氣管哮喘患者血清及誘導(dǎo)痰中生長因子可能存在一定差異。

EGF 是一種促生長細(xì)胞因子，而EGFR 是EGF細(xì)胞增殖、信號傳導(dǎo)的受體，在氣道上皮細(xì)胞、腺體及平滑肌組織中廣泛表達(dá)。既往研究[18]已應(yīng)用EGFR 抑制劑AG-1478 研究了EGF 及EGFR 在短期哮喘模型中的作用，AG-1478 治療可降低氣道高反應(yīng)率、杯狀細(xì)胞化生、氣道膠原沉積和嗜酸性粒細(xì)胞流入。提示EGFR 信號在哮喘患者上皮細(xì)胞增生、杯狀細(xì)胞化生、嗜酸性粒細(xì)胞聚集、平滑肌過度增殖中起到重要作用。本研究結(jié)果顯示，EGF 在嗜酸性粒細(xì)胞表型哮喘組血清及誘導(dǎo)痰中顯著高于中性粒細(xì)胞表型組，可能的機(jī)制為EGF 及EGFR 信號通路能夠調(diào)控巨噬細(xì)胞極化，對嗜酸性粒細(xì)胞的趨化有一定的作用，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。嗜酸性粒細(xì)胞的顯著升高通常提示自身免疫性疾病的發(fā)生[19]，EGF 在嗜酸性粒細(xì)胞表型組的過度表達(dá)則提示在這種氣道炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮了重要的促進(jìn)作用。由于嗜酸性粒細(xì)胞表型哮喘或者血清中EGF 顯著升高，擴(kuò)散至體液中，在誘導(dǎo)痰中同樣表達(dá)升高。VEGF 是一種肝素結(jié)合蛋白，主要來源為外周嗜酸粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等。既往研究報道[5]，VEGF 濃度升高是新生血管形成的生物標(biāo)志物，提示可能與哮喘患者氣道重塑和不可逆支氣管收縮有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，VEGF在嗜酸性粒細(xì)胞表型哮喘組的血清及誘導(dǎo)痰中均顯著高于中性粒細(xì)胞表型組，與既往研究結(jié)果相一致[20]，提示可能與外周血以及誘導(dǎo)痰中增高的嗜酸粒細(xì)胞及所致炎性反應(yīng)密切相關(guān)。VEGF 可以上調(diào)Th2 細(xì)胞，而Th2 細(xì)胞主要參與嗜酸性粒細(xì)胞哮喘的免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶-9 的表達(dá)，趨化嗜酸性粒細(xì)胞，導(dǎo)致氣道炎性反應(yīng)。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，EOS 與血清及誘導(dǎo)痰中EGF、VEGF 均呈正相關(guān)。提示EGF 及VEGF 可能與嗜酸性粒細(xì)胞所致的氣道炎性反應(yīng)增高相關(guān)，與病情嚴(yán)重程度具有一定相關(guān)，EGF 及VEGF 水平越高，病情可能越嚴(yán)重。此外，本研究對兩組患者基線資料比較未見顯著差異，排除了性別、年齡、肺功能及IgE 對EGF 和VEGF 的影響。然而，本研究尚未對正常人群和哮喘患者EGF、VEGF 的差異進(jìn)行比較，擬進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)研究。

綜上所述，嗜酸性粒細(xì)胞表型哮喘患者血清及誘導(dǎo)痰EGF、VEGF 水平顯著高于中性粒細(xì)胞表型支氣管哮喘患者，并且與血清EOS 水平有相關(guān)性。在臨床中，對血清EGF 及VEGF 進(jìn)行檢測可簡化支氣管哮喘患者的分型及診療流程，并為不同表型支氣管哮喘的治療提供幫助。