α-細(xì)辛醚對秦嶺滑蜥斷尾后芽基形成時期細(xì)胞增殖的影響

趙 禹 李 琳 寇曌婷 高燕燕 邵曉忠 楊 純*

(1.山西師范大學(xué)現(xiàn)代文理學(xué)院，臨汾，041004；2.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨汾，041004)

許多蜥蜴類爬行動物在受到攻擊時尾部能夠主動斷離作為一種逃避手段，隨后進(jìn)行完整的形態(tài)再生和功能恢復(fù)，其中包括皮膚、肌肉、軟骨和脊髓等組織或細(xì)胞的重構(gòu)，是極具潛力的爬行動物的再生模型[1-2]，可為我們深入理解物種再生能力的演化提供重要的線索[3]。細(xì)辛醚為天南星科(Araceae)植物金錢蒲(Acorusgramineus，異名石菖蒲Acorustatarinowii)揮發(fā)油中的主要成分之一，包括α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚和γ-細(xì)辛醚3個同分異構(gòu)體[4]，具有抑菌、鎮(zhèn)靜、降血脂、抗炎、神經(jīng)保護(hù)等作用[5]。金錢蒲及其組分細(xì)辛醚能夠通過調(diào)控ERK蛋白激酶的級聯(lián)反應(yīng)直接促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和神經(jīng)發(fā)生[6]。注射α-細(xì)辛醚是否會影響蜥蜴斷尾再生過程，值得探討。

中國特有的卵胎生蜥蜴秦嶺滑蜥(Scincellatsinlingensis)的相關(guān)研究主要集中于部分器官、系統(tǒng)的組織形態(tài)學(xué)[7-9]。秦嶺滑蜥具有斷尾再生能力，其斷尾再生過程包括4個時期，涉及傷口愈合、芽基形成、細(xì)胞分化和尾生長，并依據(jù)其再生持續(xù)時間可細(xì)分為7個階段。在整個3—5階段中細(xì)胞繼續(xù)增殖，隨著芽基細(xì)胞大小的增加，新血管的發(fā)育和室管膜管的生長與之匹配[10]。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)首次發(fā)現(xiàn)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血清中，在DNA合成和損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控中具有重要作用，可標(biāo)記增殖細(xì)胞[11]。在豹紋守宮(Eublepharismacularius)斷尾后的傷口表皮下聚集的高度增殖的間充質(zhì)樣細(xì)胞形成芽基，由其進(jìn)一步分化出不同的替換性組織。斷尾再生過程中 PCNA 和pSMAD2共定位表明大量芽基細(xì)胞增殖并對TGF β/activin作出積極相應(yīng)[12]。本實驗旨在研究α-細(xì)辛醚對秦嶺滑蜥斷尾后芽基形成過程中細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

秦嶺滑蜥采自山西省臨汾市太岳山七里峪(36°21′—36°45′N，110°40′—112°21′E)，于透明玻璃箱中飼養(yǎng)，通風(fēng)良好并輔以光照。提供黃粉蟲及自來水，確保其自由飲食，以維持機(jī)體健康。

1.2 取樣與處理

隨機(jī)選取大小相近且健康的秦嶺滑蜥27只，48.08 mm≤SVL≤57.08 mm，2.13 g≤BW≤2.74 g，雌雄兼有，隨機(jī)分為3組?？瞻捉M為同等飼喂條件的原尾組。對照組為擠壓斷尾組。實驗組為擠壓斷尾并腹腔注射α-細(xì)辛醚組(10 mg/ kg，連續(xù)注射2 W)。實驗蜥蜴分別于斷尾后15 d、18 d和20 d取材，每批每組3只。將斷尾后樣品切成約0.5 cm放入4 %的多聚甲醛溶液中，以備制作切片。

1.3 冰凍切片準(zhǔn)備

將所取材料放入4 %多聚甲醛中固定1—3 d后于脫鈣液中脫鈣3 d。隨后依次在10 %、20 %、30 %蔗糖溶液中沉降后用OCT包埋劑包埋。徠卡CM-1850冰凍切片機(jī)25 μm連續(xù)切片，用于免疫組織化學(xué)染色。

1.4 免疫組織化學(xué)染色切片準(zhǔn)備

多聚甲醛后固定30 min。PBS緩沖液洗3×5 min/次。3% 過氧化氫封閉，室溫孵育20 min。PBS緩沖液洗3×5 min/次。用濾紙將切片周圍的PBS緩沖液吸干。BSA封閉液封閉30 min滴加一抗，4℃冰箱孵育48 h。PBS緩沖液洗3×5 min/次。加二抗，37 ℃孵育4 h。PBS緩沖液洗3×5 min/次。加SABC試劑，室溫孵育1 h。PBS緩沖液洗3×5 min/次。DAB顯色，室溫避光孵育至棕黃色。蒸餾水終止顯色 10 min。水溶性封片劑封片，光學(xué)顯微鏡下觀察顯色結(jié)果并拍照。

1.5 數(shù)據(jù)測量及統(tǒng)計

取空白組、對照組、實驗組中15 d、18 d、20 d材料應(yīng)用ImageJ軟件，分別測得在脊髓、皮膚和肌肉中PCNA陽性細(xì)胞的平均灰度值，所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用SPSS 23.0進(jìn)行單因素方差分析(one way ANOVA)，檢測組間差異性，以P<0.05表示有顯著性差異[13]。

2 實驗結(jié)果

2.1 PCNA陽性細(xì)胞的分布特點

秦嶺滑蜥空白組原尾和再生時間為15 d(圖1 A、B、C)、18 d(圖2 A、B、C)和20 d(圖3 A、B、C)的再生尾外形極其相似，橫切面呈圓形或卵圓形，但顯微結(jié)構(gòu)差異明顯?？瞻捉M、對照組和實驗組的皮膚、肌肉、神經(jīng)、骨胳組織中均可觀察到PCNA陽性細(xì)胞。以脂肪細(xì)胞和皮膚組織中陽性細(xì)胞數(shù)量多，陽性強呈深棕色。

對照組斷尾后15 d(圖1 D、E、F)、18 d(圖2 D、E、F)和20 d(圖3 D、E、F)和斷尾后注射α-細(xì)辛醚實驗組15 d(圖1 G、H、I)、18 d(圖2 G、H、I)和20 d(圖3 G、H、I)的橫切面可觀察到大量PCNA陽性細(xì)胞。其中注射α-細(xì)辛醚20 d實驗組(圖3 H、I)芽基的皮膚與肌肉中的PCNA陽性細(xì)胞較同期對照組更明顯(圖2 D、E、F)。

2.2 PCNA表達(dá)強度變化

在空白組、對照組和實驗組，PCNA陽性反應(yīng)的灰度值在皮膚、肌肉和脊髓中各不相同(圖4，圖5，圖6)。所有空白組的上述組織中PCNA陽性反應(yīng)的灰度值均顯著高于實驗組(P<0.05)，其中以20 d實驗組脊髓陽性反應(yīng)最強，其灰度值低至123.10±2.91。在皮膚，15 d和18 d的對照組與實驗組PCNA灰度值差異不顯著，而20 d實驗組灰度值為125.23±2.89，明顯低于對照組145.61±3.77。肌肉中PCNA灰度值強度變化與皮膚類似，僅20 d實驗組灰度值顯著低于對照組。在脊髓，實驗組的PCNA灰度值均顯著低于對照組，表明α-細(xì)辛醚對再生脊髓細(xì)胞增殖促進(jìn)作用明顯。

圖1 α-細(xì)辛醚注射后15 d再生尾PCNA陽性細(xì)胞分布Fig.1 Distribution of PCNA-positive cells in the regenerated tails after 15 days of α-asarone injection 注：A、B、C示空白組；D、E、F示對照組；G、H、I示實驗組。de，真皮；at，脂肪組織；no，脊索；sc，脊髓；mu，肌肉；ce，中心椎體；my，肌隔；cc，軟骨椎；ep，表皮；rm，再生肌肉；rd，再生真皮；re，再生表皮；bv，血管。(圖2，圖3同) Notes：A，B，C showing blank group.D，E，F(xiàn)showing control group.G，H，I showing experimental group.de，dermis.at，adipose tissue.no，notochord.sc，spinal cord.mu，muscle.ce，central vertebral.my，myoseptum.cc，cartilage cone.ep，epidermis.rm，regenerative muscle.rd，regenerative dermis.re，regenerated epidermis.bv，blood vessel.(Figure 2，3 is the same)

3 討論

低等脊椎動物的再生模型集中在魚類、兩棲類，而在系統(tǒng)進(jìn)化上更靠近哺乳動物的蜥蜴類爬行動物的再生機(jī)制研究相對滯后[14]，加強后者再生機(jī)制的研究則更有借鑒意義。國內(nèi)學(xué)者對于快步麻蜥(Eremiasvelox)[15]，胎生蜥蜴(Lacertavivipara)[16]和南草蜥(Takydromussexlineatus)[17]等的斷尾再生現(xiàn)象進(jìn)行了觀察。斷尾再生的組織形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)等方面的基礎(chǔ)資料主要來自對綠色安樂蜥(Anoliscarolinensis)[18]和豹紋守宮[19-20]為代表的蜥蜴亞目6科30余種蜥蜴的持續(xù)研究，為探究斷尾再生分子機(jī)制奠定了堅實基礎(chǔ)[3]。蜥蜴類在斷尾后可進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)的再生和功能的恢復(fù)。秦嶺滑蜥再生尾與原尾外觀形態(tài)相似，顯微結(jié)構(gòu)明顯不同[10]。

圖2 α-細(xì)辛醚注射后18 d再生尾PCNA陽性細(xì)胞分布Fig.2 Distribution of PCNA-positive cells in the regenerated tails after 18 days of α-asarone injection

圖3 α-細(xì)辛醚注射后20 d再生尾PCNA陽性細(xì)胞分布Fig.3 Distribution of PCNA-positive cells in the regenerated tails after 20 days of α-asarone injection

圖4 秦嶺滑蜥皮膚中PCNA陽性細(xì)胞灰度值Fig.4 Column chart of gray value of PCNA positive cells in skin of Scincella tsinlingensis

圖5 秦嶺滑蜥肌肉中PCNA陽性細(xì)胞灰度值Fig.5 Column chart of gray value of PCNA positive cells in muscle of Scincella tsinlingensis

圖6 秦嶺滑蜥脊髓中PCNA陽性細(xì)胞灰度值Fig.6 Column chart of gray value of PCNA positive cells in spinal cord of Scincella tsinlingensis 注：上標(biāo)不同字母表示組間差異顯著(P<0.05) Note：Different letters means significant difference between groups(P<0.05)

同一物種不同組織器官的再生可能采用了不同的細(xì)胞來源途徑，而某一器官的再生在不同動物模型中可通過相似或多樣化的機(jī)制實現(xiàn)再生器官的重建[21]。蜥蜴斷尾再生可分為傷口愈合期、芽基形成期、細(xì)胞分化期和成熟期4個時期。芽基的細(xì)胞來源于原尾大部分組織的細(xì)胞增殖和遷移。豹紋守宮的原尾與再生尾表皮、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等中都可觀察到PCNA陽性細(xì)胞，而且豹紋守宮再生尾的新生血管、神經(jīng)組織、肌肉、再生上皮和軟骨等部位PCNA的表達(dá)都有所不同[22-23]。在綠色安樂蜥大量組織的強烈增殖維持?jǐn)辔苍偕?。斷尾后用BrdU標(biāo)記細(xì)胞，在再生14 d和21 d的芽基、傷口表皮和再生鱗片中仍有分布[24]。傷口表皮基底層BrdU標(biāo)記細(xì)胞已更多的遷移到再生表皮的中間層和外層，支持再生尾部的表皮擴(kuò)張過程。在秦嶺滑蜥斷尾后芽基形成期的15 d、18 d和20 d，主要處于芽基形成和細(xì)胞分化階段，經(jīng)歷新生血管的形成和脊髓再生，其皮膚、肌肉和脊髓中均有PCNA陽性細(xì)胞分布，細(xì)胞增殖較原尾活躍。在實驗組，上述3種組織中PCNA陽性反應(yīng)的灰度值均明顯低于對照組(P<0.05)。在皮膚，PCNA均勻分布于整個表皮，表明大部分不規(guī)則鱗片尚未分化出明顯的外表面和內(nèi)表面。15 d和18 d的對照組與實驗組PCNA灰度值差異不顯著，而20 d對照組灰度值為145.61±3.77顯著高于實驗組的125.23±2.89。肌肉中PCNA表達(dá)強度與皮膚類似，僅20 d實驗組灰度值顯著低于對照組。

蜥蜴斷尾后脊髓再生的形態(tài)和功能重建中涉及的神經(jīng)再生能力引人注目。蜥蜴脊髓再生過程中，去分化和再分化形成膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元是神經(jīng)再生的關(guān)鍵，涉及相關(guān)干細(xì)胞或者前體細(xì)胞的增殖、遷移及分化。神經(jīng)發(fā)生是多疣壁虎(Gekkojaponicus)尾部脊髓再生期間的早期事件，其成體脊髓中干細(xì)胞數(shù)量較高等動物多，神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的比例更高，斷尾后神經(jīng)干細(xì)胞最早出現(xiàn)在2 W[25]。豹紋守宮原始脊髓的室管膜層貯存的神經(jīng)干/祖細(xì)胞在斷尾再生期間被激活[20]。在秦嶺滑蜥，注射α-細(xì)辛醚的實驗組，再生脊髓PCNA細(xì)胞呈強陽性、灰度值均顯著低于對照組，20 d實驗組脊髓陽性反應(yīng)灰度值低至123.10±2.91，神經(jīng)組織細(xì)胞增殖最為活躍。這表明細(xì)辛醚不僅對大鼠的神經(jīng)再生有促進(jìn)作用[26-27]，也能促進(jìn)秦嶺滑蜥的再生脊髓細(xì)胞增殖。蜥蜴斷尾再生與炎癥或低水平免疫細(xì)胞活化相關(guān)[28]。α-細(xì)辛醚的抗炎作用很可能降低了秦嶺滑蜥斷尾再生早期階段的炎性反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、利于斷尾再生。