scRNA-seq技術(shù)及其在動(dòng)物研究中的應(yīng)用與進(jìn)展

趙敏蝶 吳 盡 趙宇卓 劉學(xué)東 鄭 冬 梁冬瑩

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

細(xì)胞是生物體的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，因細(xì)胞類型、環(huán)境以及內(nèi)部調(diào)節(jié)的不同，轉(zhuǎn)錄組信息的變化呈多樣性。轉(zhuǎn)錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)，揭示特定生物學(xué)過(guò)程以及疾病發(fā)生過(guò)程中的分子機(jī)理。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組的研究主要是在器官或者組織水平上測(cè)序，即轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)，忽略了單個(gè)細(xì)胞在遺傳方面的特殊性。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(single cell RNA-seq，scRNA-seq)是在單個(gè)細(xì)胞水平對(duì)mRNA進(jìn)行高通量測(cè)序的一項(xiàng)新技術(shù)，將分離的單個(gè)細(xì)胞的微量全轉(zhuǎn)錄組RNA擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測(cè)序，從單細(xì)胞水平上獲得全轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)譜[1-3]。scRNA-seq能夠以高通量和單分子分辨率研究單個(gè)細(xì)胞表達(dá)譜，揭示復(fù)雜細(xì)胞群體的異質(zhì)性，避免單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)信號(hào)被群體的平均值所掩蓋。scRNA-seq更加精準(zhǔn)，最終得到的是每個(gè)細(xì)胞型的表達(dá)量，從而可以幫助理解組織異質(zhì)性，鑒定罕見的細(xì)胞類型，檢測(cè)細(xì)胞組分的變化，在人類的癌癥異質(zhì)性、胚胎發(fā)育、細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞分型、差異表達(dá)通路等方面都發(fā)揮重要作用[4-7]。本文對(duì)scRNA-seq技術(shù)原理及其在動(dòng)物研究中的應(yīng)用與進(jìn)展進(jìn)行綜述。不僅可以了解動(dòng)物不同發(fā)育時(shí)期組織細(xì)胞之間的特性，為動(dòng)物研究提供科學(xué)參考，針對(duì)野生動(dòng)物的研究也能提供一個(gè)新的方向。

1 scRNA-seq技術(shù)的發(fā)展歷史及其在生物學(xué)研究中的作用

1990年Brady等首次描述了一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的單細(xì)胞cDNA擴(kuò)增方法[8]。幾乎同時(shí)，Eberwine等提出了另外一種基于體外轉(zhuǎn)錄的線性擴(kuò)增方法[9]。隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展，2002年起多篇文章報(bào)道了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的基因芯片分析[10-13]。2009年，Tang等首次報(bào)道單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的深度測(cè)序分析[3]，并于2010年再次發(fā)表相關(guān)研究工作[14]。至今，scRNA-seq已成為生物學(xué)研究中應(yīng)用熱門之一。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究能夠在單個(gè)細(xì)胞水平上揭示細(xì)胞內(nèi)整體水平的基因表達(dá)狀態(tài)和基因結(jié)構(gòu)信息，準(zhǔn)確反映細(xì)胞間的異質(zhì)性，深入理解其基因型和表型之間的相互關(guān)系[15]。scRNA-seq作為一種針對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序的技術(shù)，隨著其發(fā)展，人們將會(huì)對(duì)細(xì)胞的認(rèn)識(shí)更加全面豐富。在生物學(xué)研究中，scRNA-seq可以研究基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，基因表達(dá)的異質(zhì)性與隨機(jī)性，基因表達(dá)水平，監(jiān)測(cè)新的基因(包括新的蛋白質(zhì)編碼基因和非編碼RNA基因，尤其是低表達(dá)基因)，定量研究基因的突變情況等。scRNA-seq技術(shù)主要用于大規(guī)模細(xì)胞圖譜構(gòu)建[16-20]、細(xì)胞亞群細(xì)化和稀有細(xì)胞類型鑒定[19，21]、腫瘤方向研究[22]、干細(xì)胞發(fā)育及分化研究[23]、免疫方向研究[24-27]、神經(jīng)科學(xué)研究[28]、發(fā)育生物學(xué)[3-4，16-19，29-38]等。這些研究為人類認(rèn)識(shí)和了解生物機(jī)體和各種功能提供了重要的方法和途徑。同樣，scRNA-seq在動(dòng)物的研究中也得到推廣和應(yīng)用。

2 scRNA-seq在動(dòng)物研究中的方法

近年來(lái)，隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，許多研究人員利用該技術(shù)對(duì)動(dòng)物的某些單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行研究，初步實(shí)現(xiàn)在單個(gè)細(xì)胞水平上對(duì)動(dòng)物機(jī)體的了解，確定了scRNA-seq技術(shù)在動(dòng)物研究中的適用性。具體的研究方法通常分為以下幾部分。

2.1 單細(xì)胞分離

首先，研究者要對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分離以獲得單細(xì)胞樣品。分離單個(gè)細(xì)胞，常用技術(shù)：連續(xù)稀釋法、顯微操作法、微流控芯片(microfluidics)、熒光激活細(xì)胞流式分選(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)、磁性激活細(xì)胞分選(magnetic-activated cell sorting，MACS)、轉(zhuǎn)錄組體內(nèi)分析法(transcriptome in vivo analysis，TIVA)以及激光捕獲顯微切割法(laser capture microdissection，LCM)等。研究人員根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和目的對(duì)單細(xì)胞的分離采取不同的方法。例如汪俊幫等人在顯微鏡下分離出了小鼠(Musmusculus)胚胎二細(xì)胞期的細(xì)胞[39]。

2.2 建庫(kù)及數(shù)據(jù)獲得

scRNA-seq數(shù)據(jù)的獲得通常包括細(xì)胞裂解、mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA、cDNA擴(kuò)增、文庫(kù)構(gòu)建4個(gè)步驟。首先加入緩沖液使細(xì)胞降解，獲得mRNA，去除蛋白質(zhì)和DNA等雜質(zhì)，純化mRNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，一般使用oligo-dT引物和SuperscriptⅡ或Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈，并通過(guò)模板轉(zhuǎn)換，合成cDNA的第二條鏈。再對(duì)已逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA進(jìn)行PCR或者IVT擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行純化測(cè)序。

單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的總RNA含量約為10 pg，其中mRNA約為0.1—0.5 pg，而目前高通量測(cè)序文庫(kù)需要至少數(shù)十納克DNA，因此單細(xì)胞RNA-seq的文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程需將起始核酸進(jìn)行數(shù)十萬(wàn)倍擴(kuò)增[40]。根據(jù)合成第二條cDNA鏈時(shí)使用的酶，可將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的cDNA擴(kuò)增方法分為PCR法、體外轉(zhuǎn)錄法和Phi29 聚合酶法。將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行純化后，一般采用高通量測(cè)序技術(shù)(high-throughput RNA sequencing)對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行不同深度測(cè)序分析，得到大量原始的讀長(zhǎng)(reads)，初步得到單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

2.3 分析

對(duì)scRNA-seq數(shù)據(jù)的處理首先要進(jìn)行質(zhì)量控制、表達(dá)量估計(jì)以及數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化。獲得scRNA-seq原始reads后，需要對(duì)原始reads，對(duì)齊reads及不同批次細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量控制，以剔除低質(zhì)量數(shù)據(jù)。質(zhì)量評(píng)估后，采用不同的數(shù)據(jù)表達(dá)方式來(lái)代表表達(dá)水平。但這些方法不適用于直接比較細(xì)胞間的表達(dá)量差異，對(duì)于大多數(shù)下游分析，均需要先將不同細(xì)胞的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。scRNA-seq實(shí)驗(yàn)中存在的各種噪聲，會(huì)對(duì)后續(xù)分析造成影響，所以，也需對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估和調(diào)整實(shí)驗(yàn)誤差，來(lái)減少技術(shù)或生物來(lái)源造成的scRNA-seq實(shí)驗(yàn)的噪聲。根據(jù)所調(diào)查的生物問題有許多分析方法，本文從細(xì)胞水平分析和基因水平分析兩個(gè)方面進(jìn)行介紹。

2.3.1 細(xì)胞水平分析

細(xì)胞水平分析包括可視化、聚類分析、細(xì)胞發(fā)育階段推斷和排序等[18，31-33]。處理單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)這樣一個(gè)高維的數(shù)據(jù)時(shí)，一個(gè)常用的策略是將這些細(xì)胞投影到低維的空間上，達(dá)到可視化分析，也就是降維技術(shù)，通過(guò)僅考慮二維或三維空間，可視化提供了定性地探索數(shù)據(jù)的平均值。聚類分析用于識(shí)別細(xì)胞亞型(如細(xì)胞異質(zhì)性、細(xì)胞分化周期的判定等)，提供了通過(guò)相似性對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組的機(jī)制。scRNA-seq能夠提供單個(gè)細(xì)胞全基因表達(dá)譜，利用scRNA-seq數(shù)據(jù)，結(jié)合計(jì)算機(jī)技術(shù)可將非同步細(xì)胞群中單個(gè)細(xì)胞的分化路徑排序。細(xì)胞發(fā)育階段推斷和排序分析是通過(guò)降維和基于圖論的原則，將處于不同分化階段的細(xì)胞進(jìn)行排序。Monocle、PQ-trees等方法的使用使得scRNA-seq數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成細(xì)胞所處的不同分化階段，可以確定基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。

2.3.2 基因水平分析

基因水平分析包括高變異基因的鑒定、差異表達(dá)基因和標(biāo)記基因的識(shí)別、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析等。對(duì)于高變異基因的鑒定，Brennecke等首先利用插入分子估計(jì)了技術(shù)噪音，并建立了均值-方差關(guān)系模型來(lái)識(shí)別高度可變的基因[41]；Kim等提出了一個(gè)基于生成模型的統(tǒng)計(jì)框架，將總方差分解為技術(shù)和生物方差，這將有助于識(shí)別可變基因[42]；貝葉斯模型可聯(lián)合模擬尖峰和內(nèi)源性基因，并提供生物變異程度的后驗(yàn)分布[43]。在scRNA-seq研究中識(shí)別亞群的差異表達(dá)基因和標(biāo)記基因是一個(gè)簡(jiǎn)單但重要的分析。MAST、M3Drop等scRNA-seq實(shí)驗(yàn)方法通過(guò)混合模型或簡(jiǎn)單統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)識(shí)別差異表達(dá)。標(biāo)記基因的識(shí)別是通過(guò)差異分析來(lái)識(shí)別每個(gè)cluster下的標(biāo)記基因，將該cluster下的細(xì)胞作為一組，其他cluster下的細(xì)胞作為另一組，然后進(jìn)行差異分析。scRNA-seq研究的一個(gè)重要應(yīng)用是識(shí)別基因的共調(diào)控模塊和利用基因與基因表達(dá)相關(guān)性構(gòu)建的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究人員已經(jīng)鑒定了許多共表達(dá)基因的功能模塊，可以描述小鼠的每個(gè)胚胎發(fā)育階段。scRNA-seq研究中推斷的網(wǎng)絡(luò)是無(wú)向的；也就是說(shuō)，它們不能在基因之間提供直接的調(diào)節(jié)關(guān)系。為了揭示哪個(gè)基因位于調(diào)控級(jí)聯(lián)的上游/下游，通常需要進(jìn)行擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)(例如敲除目的基因)。

3 scRNA-seq在動(dòng)物研究中的應(yīng)用

3.1 早期胚胎發(fā)育

在胚胎發(fā)育的早期階段，受精卵會(huì)經(jīng)歷廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和表觀遺傳重編程過(guò)程。早期胚胎發(fā)育階段的細(xì)胞數(shù)量極為稀少，其轉(zhuǎn)錄組分析尤其需要scRNA-seq技術(shù)。2009年，Tang等首次應(yīng)用scRNA-seq于單個(gè)小鼠卵裂球，檢測(cè)到比微陣列技術(shù)多75%的基因表達(dá)，并識(shí)別出1 753個(gè)以前未知的剪接連接；對(duì)于卵母細(xì)胞，與野生型對(duì)照相比，1 696和1 553個(gè)基因分別異常上調(diào)[3]。2013年，小鼠和人類著床前胚胎的高精度單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜陸續(xù)完成[16-17]。利用scRNA-seq篩選出影響盤羊(Ovisammon)卵母細(xì)胞成熟的關(guān)鍵基因，并結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行定量驗(yàn)證，即從分子水平研究卵母細(xì)胞成熟的調(diào)控機(jī)制，以此來(lái)提高羔羊卵母細(xì)胞發(fā)育后期胚胎的潛力[29]。蘭道亮等對(duì)野牦牛(Bosgrunniens)GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序和數(shù)據(jù)對(duì)比分析，篩選出了4 767個(gè)差異表達(dá)基因[30]。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的時(shí)間序列可以揭示細(xì)胞分化途徑的動(dòng)態(tài)特征。研究人員用scRNA-seq技術(shù)分別在斑馬魚(Daniorerio)和非洲爪蟾(Xenopuslaevis)早期胚胎發(fā)育過(guò)程中建立了基因表達(dá)動(dòng)態(tài)圖譜，將相關(guān)數(shù)據(jù)以幾分鐘到幾小時(shí)的時(shí)間間隔組合在一起，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行逐個(gè)描述，并觀察胚胎最終形成的過(guò)程，揭示了單個(gè)細(xì)胞構(gòu)建整個(gè)生物體的完整過(guò)程[31-33]。這些研究為野生動(dòng)物早期胚胎發(fā)育的研究提供了新的途徑。

3.2 組織器官發(fā)育

組織器官發(fā)育是scRNA-seq技術(shù)應(yīng)用的另一個(gè)重要領(lǐng)域。多種組織器官(包括肺[4]、腦[34]、心臟[35]、腎臟[36]、小腸[37]等)發(fā)育過(guò)程中的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析已被報(bào)道。2018年，研究人員對(duì)來(lái)自小鼠20個(gè)器官和組織的約10萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果揭示了之前研究中從未完整展示的基因表達(dá)圖譜，并且能直接比較不同組織和細(xì)胞類型的基因表達(dá)，最終建立了一個(gè)名為Tabula Muris的儲(chǔ)存小鼠細(xì)胞信息的開源數(shù)據(jù)庫(kù)[39]。DeLaughter等從小鼠胚胎發(fā)育的7個(gè)不同階段提取心臟細(xì)胞樣本，利用scRNA-seq技術(shù)檢測(cè)了單個(gè)細(xì)胞基因活性隨時(shí)間的變化，提供了一個(gè)時(shí)間和空間的圖譜，描繪了心臟不同細(xì)胞群的發(fā)展[35]。scRNA-seq技術(shù)可以通過(guò)分析單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組精細(xì)地識(shí)別出各種細(xì)胞類型，同時(shí)能夠發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型以及標(biāo)記基因。Carter等研究得到了來(lái)自12個(gè)關(guān)鍵發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的小鼠小腦單細(xì)胞圖譜，鑒定了主要的小腦細(xì)胞亞群，確定了有助于小腦發(fā)育的亞群[18]。Pandey等將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組與腦解剖相結(jié)合，得到了約13 000個(gè)斑馬魚松果體韁細(xì)胞，確定了18種神經(jīng)元類型和幾十種標(biāo)記基因，創(chuàng)建了全面的斑馬魚松果體韁單細(xì)胞圖譜[19]。scRNA-seq技術(shù)鑒定細(xì)胞類型和識(shí)別標(biāo)記基因的特點(diǎn)將有力推動(dòng)發(fā)育生物學(xué)的研究。

3.3 免疫系統(tǒng)

免疫細(xì)胞對(duì)抗原物質(zhì)的應(yīng)答反應(yīng)具有復(fù)雜和不均一性的異質(zhì)性特點(diǎn)，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)有望在此方面揭示豐富的未知信息。先天性淋巴細(xì)胞(ILCs)是動(dòng)物免疫應(yīng)答和體內(nèi)平衡的重要介質(zhì)。Hernández等利用scRNA-seq獲得了組織穩(wěn)態(tài)期間和免疫攻擊后斑馬魚淋巴細(xì)胞的綜合圖譜，從野生型斑馬魚的腸道以及rag1突變(缺少T和B細(xì)胞)的斑馬魚中共收集14 080個(gè)單細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了ILC樣細(xì)胞[24]。應(yīng)用scRNA-seq可以獲得斑馬魚特異性免疫細(xì)胞類型的第一個(gè)轉(zhuǎn)錄組并對(duì)其進(jìn)行表征。差異表達(dá)分析揭示了新的免疫細(xì)胞特異性基因，為免疫系統(tǒng)的進(jìn)化提供了更多的線索[25]。在其他研究中，scRNA-seq揭示了斑馬魚中存在Th2和調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Tregs)，進(jìn)一步證實(shí)了哺乳動(dòng)物和硬骨魚在免疫生物學(xué)上的相似性[26-27]。

3.4 其他

scRNA-seq技術(shù)可作為一種新的腫瘤細(xì)胞鑒定技術(shù)，更加精準(zhǔn)地判定腫瘤類型以及揭示相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Puram等采用scRNA-seq的方法分析了來(lái)自頭頸鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞。他們通過(guò)分析構(gòu)建出頭頸癌中存在的所有不同細(xì)胞的圖譜[22]。scRNA-seq還可用于大腦細(xì)胞圖譜繪制。Carter等研究得到了來(lái)自12個(gè)關(guān)鍵發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的小鼠小腦單細(xì)胞圖譜，利用已知的譜系標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，表明單細(xì)胞數(shù)據(jù)能準(zhǔn)確概括小腦的發(fā)育。最后，創(chuàng)建了名為Cell Seek的數(shù)據(jù)集[18]。Davie等研究構(gòu)建了全面的成年果蠅(Drosophilamelanogaster)大腦細(xì)胞圖譜；開發(fā)了SCENIC果蠅數(shù)據(jù)庫(kù)，能映射出果蠅大腦中神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)類細(xì)胞的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；繪制了大腦衰老過(guò)程中的細(xì)胞狀態(tài)變化，利用機(jī)器學(xué)習(xí)的方法，根據(jù)細(xì)胞的基因表達(dá)譜來(lái)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)細(xì)胞的年齡[20]。除此之外，Gerber等針對(duì)東方蠑螈(Cynopsorientalis)肢體再生的問題，聯(lián)合使用Cre-loxP報(bào)告基因譜系跟蹤和scRNA-seq，追蹤了CT細(xì)胞譜系的再分化軌跡及肢體再生過(guò)程中特殊譜系的分子重建步驟[44]。Feregrino等利用發(fā)育中的紅原雞(Gallusgallus)的足趾作為研究脊椎動(dòng)物模式形成的范例，使用scRNA-seq，對(duì)來(lái)自雞自噬模式3個(gè)關(guān)鍵發(fā)育階段的17 628個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)序[45]。結(jié)果顯示鑒定了23個(gè)具有不同轉(zhuǎn)錄譜的細(xì)胞群，檢測(cè)出稀有細(xì)胞類型，推斷出在發(fā)育過(guò)程中與不同組織類型相一致的基因共表達(dá)模塊。Foster等研究小海膽(Hakiacorbularis)胚胎時(shí)利用scRNA-seq分析揭示了胚胎發(fā)育過(guò)程中存在的細(xì)胞類型、抑制各種信號(hào)通路導(dǎo)致的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的變化，以及這些通路在影響發(fā)育軌跡方面的選擇性[46]。非洲爪蟾蝌蚪具有很高的再生潛力，為了描述這種再生反應(yīng)，Aztekin等人在尾部截肢后進(jìn)行了scRNA-seq[47]。轉(zhuǎn)錄譜分析顯示，再生組織細(xì)胞分泌與關(guān)鍵再生途徑相關(guān)的配體，向祖細(xì)胞發(fā)出信號(hào)，以重建丟失的組織。

4 展望

隨著第三代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，scRNA-seq技術(shù)也逐漸得到重視。近年來(lái)，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)取得了較為明顯的發(fā)展，被應(yīng)用到諸多領(lǐng)域，隨著方法學(xué)的成熟，scRNA-seq技術(shù)在未來(lái)動(dòng)物研究中將會(huì)得到更加廣泛地應(yīng)用?？赡馨▽?duì)各種組織器官的發(fā)育過(guò)程進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型等；與基因組編輯技術(shù)結(jié)合，對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行單細(xì)胞分辨率分析；與細(xì)胞成像技術(shù)結(jié)合，揭示基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)引起細(xì)胞差異以及進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控的作用機(jī)制提供檢測(cè)方法等。目前，scRNA-seq在野生動(dòng)物保護(hù)研究中的應(yīng)用并不廣泛。野生動(dòng)物保護(hù)研究主要集中在棲息地保護(hù)、環(huán)境資源保護(hù)、人為干擾等方面，對(duì)個(gè)體與基因?qū)哟蔚难芯坎⒉簧钊?。scRNA-seq在小鼠、果蠅、雞等實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣?dòng)物或家畜以及蠑螈、非洲爪蟾、斑馬魚等的應(yīng)用研究證明了該技術(shù)可應(yīng)用于野生動(dòng)物的個(gè)體和基因?qū)哟蔚谋Ｗo(hù)研究中。未來(lái)，如果將scRNA-seq技術(shù)更多的應(yīng)用到野生動(dòng)物研究中，在單細(xì)胞水平上研究野生動(dòng)物不同組織的基因表達(dá)情況，包括基因突變、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等，構(gòu)建個(gè)體不同組織的細(xì)胞圖譜，研究個(gè)體干細(xì)胞發(fā)育及分化等內(nèi)容，從早期胚胎發(fā)育到組織器官發(fā)育、免疫系統(tǒng)等多個(gè)領(lǐng)域，可以更加充分地從個(gè)體和基因方面了解野生動(dòng)物的發(fā)育生長(zhǎng)，對(duì)更好地保護(hù)和利用野生動(dòng)物具有重要意義。