基于糞便DNA技術(shù)的鳥類物種鑒定體系研究

秦 啼 王東權(quán) 曲寧新 劉帥齊 李 波，2* 柴洪亮

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2.國家林業(yè)和草原局野生動植物檢測中心，哈爾濱，150040)

利用糞便DNA技術(shù)對鳥類進(jìn)行物種鑒定，對了解鳥類在繁殖地和越冬地的種類分布、研究其遷徙路線等具有重要意義[1]。鳥類糞便可以通過非損傷性采樣技術(shù)獲得，其DNA含量大，是分子生態(tài)學(xué)中廣泛應(yīng)用的檢材[2-3]。物種鑒定中常用的分子標(biāo)記有限制性片段長度多態(tài)(RFLP)、擴(kuò)增片段限制性長度多態(tài)(PCR-RFLP)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)(AFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增片段長度多態(tài)(RAPD)和物種特異性引物擴(kuò)增[4]。近年來，DNA條碼技術(shù)因原理簡單、操作便捷等優(yōu)點被廣泛關(guān)注和使用[5-8]。基于鳥類糞便的物種鑒定體系通常如下：首先，從單一的糞便樣本中提取總DNA，并擴(kuò)增目標(biāo)物種的Cytb基因、COI基因或D-loop片段等特定序列片段，而后測序；其次，將測得序列與已知的同源序列進(jìn)行比對，即利用BLAST比對法確定來源物種[1]。由于鳥類中近緣物種DNA序列的高度相似性，時常導(dǎo)致不能得到單一物種的鑒定結(jié)論[9]。在哺乳動物、無脊椎動物的物種鑒定中，常用的序列分析方法還包括：遺傳距離法、ABGD劃分法及系統(tǒng)發(fā)育樹法[10]。因此，本研究嘗試在鳥類糞便DNA分析的基礎(chǔ)上結(jié)合多種序列分析方法，構(gòu)建一套完整的、標(biāo)準(zhǔn)明確的鳥類物種鑒定體系。

本研究以野外雁形目(Anseriformes)鳥類的糞便為對象，通過擴(kuò)增、測定糞便DNA D-loop區(qū)序列，并與NCBI基因庫中同源性序列進(jìn)行比對分析。在此基礎(chǔ)上，比較了常用序列分析方法的鑒定標(biāo)準(zhǔn)、分析了基于不同的堿基替換類型在計算遺傳距離及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時的優(yōu)劣性，以期得到高效、可信的鳥類物種鑒定體系。

1 材料與方法

1.1 材料

于青海湖附近采集76份雁形目鳥類的糞便，儲存于國家林業(yè)與草原局動植物檢測中心。

1.2 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增與測序

利用糞便DNA基因組提取試劑盒(QIAamp DNA Stool Mini Kit，Germany)提取鳥類糞便基因組DNA。選取引物L(fēng)438：5′-TCACGTGAAATCAGCAACCC-3′，H1248：5′-CATCTTCAGTGCCATGCTTT-3′[11]擴(kuò)增mtDNA D-loop區(qū)部分片段。利用梯度PCR儀(Effendorf，Germany)篩選引物的最佳退火溫度。PCR反應(yīng)在9700型PCR儀(GeneAmp，USA)中完成。擴(kuò)增反應(yīng)體系(50 μl)是：2×EasyTaqPCR SuperMix 25 μl，10 μM引物各0.5 μl，DNA模板10 μl，加滅菌去離子水至50 μl。擴(kuò)增程序為：94℃/3 min，(94℃/30 s，59℃/30 s，72℃30 s)35 cycles，72℃/10 min。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后送至北京擎科生物有限公司哈爾濱分公司進(jìn)行純化回收和雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用DNAstar軟件包的SeqMan對測得序列核對、拼接，刪除兩端引物得到目的片段。采用GenBank數(shù)據(jù)庫 BLAST工具搜尋與糞便樣品D-loop序列相似度高的同源序列。下載相似度98%以上的同源序列，涉及物種和登錄號分別為灰雁(Anseranser)(EU601724、EU601725、EU601729、EU601732、EU601728)；鴻雁(Ansercygnoid)(KT427472、KT427463、KJ124555、KJ778677)；白額雁(Anseralbifrons)(EU601720、EU601721)；小天鵝(Cygnuscolumbianus)(JQ282800、KF800698)；大天鵝(Cygnuscygnus)(KR821135、KP981363)；鳳頭潛鴨(Aythyafuligula)(JQ422475)；針尾鴨(Anasacuta)(HM063478)；琵嘴鴨(Spatulaclypeata)(HM063479)；斑嘴鴨(Anaszonorhyncha)(KF751616)；綠頭鴨(Anasplatyrhynchos)(KJ778676)；綠翅鴨(Anascrecca)(JX138088)(表1)。利用Mega 7.0中的Clustal W對測得和下載序列進(jìn)行排列，并使用Gblock軟件(http：//www.phylogeny.fr/one_task. cgi？task_type=gblocks)選擇保守區(qū)，參數(shù)設(shè)置為系統(tǒng)默認(rèn)。采用DNAsp5分析單倍型及變異位點，利用Mega 7.0基于不同的堿基替換類型(transition，Ts、transversion，Tv、Ts+Tv)計算種內(nèi)、種間的Kimura雙參數(shù)(K2P)遺傳距離。將上述序列K2P遺傳距離矩陣提交到ABGD網(wǎng)站(https：//bioinfo.mnhn.fr/abi/public/abgd/abgdweb.html)，參數(shù)P(prior intraspecific divergence)設(shè)為0.005—0.01，參數(shù)X(minimum relative gap width)為1.0。以家雞同源序列(AP003318、AP003317、AP003580)作為外群，基于Ts+Tv利用K2P模型采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)樹分支的置信度用自展法(bootstrap analysis，BP)進(jìn)行1 000次重復(fù)檢驗。然后比較系統(tǒng)發(fā)育樹與ABGD劃分結(jié)果。

表1 控制區(qū)單倍型 和Blast比對結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 序列比對

測序獲得雁形目鳥類糞便樣本D-loop序列76條(683—757 bp)，包含236個變異位點、其中簡約信息位點209個，可劃分為20個單倍型(表1)。與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知同源序列的相似度為98.07%—100%，涉及11種雁形目鳥類。其中，單倍型H1—H7、H13—H20檢測為單一物種，而單倍型H8—H12檢測為非單一物種、與已知灰雁、鴻雁同源序列都有著較高相似度(98.11%—99.60%)。

2.2 遺傳距離、系統(tǒng)發(fā)育分析與ABGD的劃分

利用Gblock選擇的保守區(qū)長度為473 bp?；赥s、Ts+Tv計算K2P種內(nèi)和種間遺傳距離(表2，表3)，種內(nèi)遺傳距離分別為0—0.002、0—0.015，種間遺傳距離分別為0.002—0.628、0.023—1.602，平均遺傳距離為0.291、0.681。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫相似度檢測為單一物種的單倍型，其基于Ts+Tv計算的種間遺傳距離明顯大于基于Ts種間遺傳距離。單倍型H16—H18與已知大天鵝和小天鵝的Ts遺傳距離分別為0.002、0.003，而Ts+Tv遺傳距離分別為0.037、0.004。前者難以作為物種鑒別依據(jù)；后者種間遺傳距離與種內(nèi)遺傳距離差異明顯，可以得到可信的鑒定結(jié)果。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫相似度檢測為非單一物種的單倍型也顯示出類似的結(jié)果。單倍型H8—H12與已知灰雁和鴻雁的Ts遺傳距離差異都極小(0 —0.001)，而單倍型H8—H10的Ts+Tv遺傳距離分別為0.023、0.015，單倍型H11—H12的為0.013、0.029。這表明單倍型H8—H10屬于鴻雁，單倍型H11—H12屬于灰雁。

基于D-loop單倍型構(gòu)建的雁形目鳥類NJ系統(tǒng)發(fā)育樹呈現(xiàn)出清晰的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：包括外群的44條序列聚類后沒有出現(xiàn)交叉、嵌套現(xiàn)象(圖1)。待鑒別的單倍型分別與11種已知雁形目鳥類構(gòu)成單系。利用ABGD軟件以0.005—0.01的先驗值P區(qū)間對包括外群的44個序列進(jìn)行劃分，結(jié)果包括了初始劃分和遞歸劃分兩種情況(圖2)。其中，初始劃分較為穩(wěn)定，包括外群的44個序列均被劃分12個組，遞歸劃分將樣本劃分成8—14組，波動較大。因此選擇比較穩(wěn)定的初始劃分與系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類結(jié)果進(jìn)行比較，表明系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類結(jié)果與每個分組呈逐一對應(yīng)關(guān)系(圖1)。

3 討論

D-loop片段為線粒體DNA的非編碼區(qū)，進(jìn)化速率較快，適用于親緣關(guān)系較近的物種鑒別[12-13]。本研究利用GenBank數(shù)據(jù)庫BLAST工具分析了雁形目鳥類糞便D-loop序列單倍型，結(jié)果包括5個單倍型(25%)為非單一物種。它們與已知雁形目鳥類同源序列的相似度皆大于98%，高于95%的相似度鑒定標(biāo)準(zhǔn)[14]。由于分子標(biāo)記的序列長度有限及近緣物種的序列相似性很高，使得部分結(jié)果為非單一物種、無法得出明確的鑒定結(jié)論。因此，BLAST比對法的序列分析結(jié)果對物種鑒定有一定的參考價值，但涉及近緣物種時需要結(jié)合其他分析方法得出鑒定結(jié)論。

表2 基于Ts計算的控制區(qū)單倍型K2P遺傳距離

Tab.2 K2P-distances for haplotypes of D-loop computed based on Ts

表3 基于Ts+Tv計算的控制區(qū)單倍型K2P遺傳距離

Tab.3 K2P-distances for haplotypes of D-loop computed based on Ts+Tv

物種鑒定中常用的遺傳距離法是依據(jù)種間最小遺傳距離大于種內(nèi)最大遺傳距離的原則，利用閾值法或最小距離法得到鑒別結(jié)果[15]。計算遺傳距離時，需要考慮不同的堿基替代類型，包括Ts、Tv、Ts+Tv、Ts/Tv比率等[16-17]。對于特定序列，使用不同替換類型計算的遺傳距離會有差異[18]。利用COI和Cytb基因鑒別雀形目(Passeriformes)鳥類時，Ts是最有效的堿基替代類型[18]。本研究比較Ts、Ts+Tv計算K2P種內(nèi)和種間遺傳距離，結(jié)果表明基于Ts+Tv計算遺傳距離能更好地實現(xiàn)物種分辨。這種差異主要是源于分子標(biāo)記的不同。COI和Cytb基因作為編碼基因受到自然選擇壓力影響，經(jīng)過長期的適應(yīng)性進(jìn)化后Tv常被自然選擇所淘汰，而Ts則容易保留下來。D-loop區(qū)作為非編碼基因不受自然選擇壓力影響，Ts和Tv保留的幾率是相同的。因此，基于D-loop計算遺傳距離時，Ts+Tv是最佳的堿基替換類型。而且，NJ系統(tǒng)發(fā)育樹呈現(xiàn)出清晰的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，待鑒別的單倍型與11種已知雁形目鳥類分別構(gòu)成單系。這符合系統(tǒng)發(fā)育樹法的判別標(biāo)準(zhǔn)：同種個體聚成單系分支[19]。另外，ABGD方法是基于遺傳距離在先驗值P的一定范圍自動檢測序列間的“barcoding gap”[20]，某種程度上減低了閾值法或最小距離法界定的人為因素，提高了遺傳距離法的可信度[21-22]。本研究中，ABGD劃分結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類結(jié)果完全吻合，因此，ABGD劃分法可作為遺傳距離法的補(bǔ)充或再處理。

綜上所述，利用糞便DNA技術(shù)鑒別鳥類時，需根據(jù)物種間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近選擇合適的分子標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增和測序；其次，在序列分析方法上，BLAST比對法作為最基本的序列分析方法，可以為物種鑒定提供參考。遺傳距離法、ABGD劃分法和系統(tǒng)發(fā)育樹法可進(jìn)一步檢驗BLAST比對結(jié)果，并鑒別親緣關(guān)系較近的物種。以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了一套標(biāo)準(zhǔn)明確的鳥類物種鑒定體系(圖3)。相比以前單一的BLAST比對法，該鑒定體系集成遺傳距離法和系統(tǒng)發(fā)育樹法等多種序列分析方法，可以得到更加可信的鑒定結(jié)果。該體系使得鳥類物種鑒定體系更具系統(tǒng)性、規(guī)范性，可以推廣應(yīng)用于其他物種鑒定領(lǐng)域。

圖1 基于控制區(qū)單倍型構(gòu)建的雁形目鳥類鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbor-Joining phylogenetic trees for Anserimormes birds based on haplotypes of D-loop注：左側(cè)為NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，右側(cè)為ABGD軟件的初始劃分結(jié)果Note：The Neighbor-Joining phylogenetic tree for Anseriformes birds is on the left.The results of initial partition by ABGD soft are on the right

圖2 ABGD軟件對雁形目鳥類的劃分結(jié)果Fig.2 The automatic partition results of Anseriformes birds ABGD soft

圖3 物種鑒定體系Fig.3 The system of species identification