耐高糖酵母的篩選及其在黃酒中的應用研究

潘惠麗，李曉珺，曹龍輝，邱淑嫻，歐永康，姚燕婷

（1.廣東第二師范學院生物與食品工程學院，廣東廣州 510303；2.廣東環(huán)境保護工程職業(yè)學院，廣東佛山 528216）

黃酒是中國最古老的釀造酒，廣東黃酒是我國黃酒的一個重要分支。廣東黃酒主要采用優(yōu)質糯米和紅曲釀造而成，是嶺南一帶客家人釀造的傳統(tǒng)發(fā)酵型黃酒，具有獨特的風味。傳統(tǒng)的廣東黃酒糖度偏高，不符合人們對保健養(yǎng)生的追求，而新型的低糖型黃酒口感清淡、糖度較低，更能順應時代發(fā)展的需求。傳統(tǒng)黃酒的釀造主要依靠添加外源白酒控制糖化和發(fā)酵平衡，酵母無法在耐高滲的環(huán)境中生長，導致發(fā)酵醪液中糖類物質的轉化率不高，酒精產(chǎn)率較低[1]。因此，篩選出一株耐高糖酵母菌株對解決黃酒偏甜膩問題具有十分重要的意義。

目前，耐高糖酵母的選育采用高糖選擇性富集技術，為此可以初步篩選出具有耐糖度的酵母菌株，再通過搖瓶發(fā)酵試驗[2]、梯度馴化[3]、紫外誘變[4-5]、復合誘變[6]等技術手段進行耐高糖酵母菌株的選育，但現(xiàn)有的耐高糖酵母的研究均是針對其耐高糖酵母菌株發(fā)酵特性及發(fā)酵產(chǎn)物性質，將篩選出的耐高糖酵母應用于實際生產(chǎn)的研究并不多見，而酵母菌發(fā)酵性能的優(yōu)異對黃酒的風味、口感起重要作用，因此篩選得到的具有優(yōu)良發(fā)酵性能的酵母菌株可作為理想的發(fā)酵劑用于黃酒的釀造生產(chǎn)中[7]。

試驗從蜂蜜、葡萄、面包[8-10]中提取天然酵母菌，通過梯度馴化和紫外誘變選育，最終得到耐高糖的酵母菌株，對其耐受特性和發(fā)酵性能進行研究，并將其初步用于黃酒釀造中，以期提高糖類物質的轉化率、降低黃酒偏甜膩的口感，為廣東低糖型黃酒的釀造工藝提供了一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棗花蜂蜜，產(chǎn)自福建省福州市；牛油排包，產(chǎn)自廣東省深圳市；黑夏葡萄，產(chǎn)自云南省建水市；葡萄糖（固體）、瓊脂粉、生理鹽水、無菌水、酒精。

YEPD培養(yǎng)基（酵母浸出粉胨葡萄糖肉湯培養(yǎng)基）[11]：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，pH值6.5±0.2，于115℃下高壓滅菌20 min。如用固體培養(yǎng)基，則加入20 g的瓊脂。

高糖液體培養(yǎng)基[12]：分別配制10，20，30，35，40，50，60°Bx的YEPD培養(yǎng)基（只改變培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度），于115℃下滅菌20 min，冷卻待用。

TTC上層培養(yǎng)基[13]：葡萄糖5 g/L，瓊脂15 g/L，TTC 0.5 g/L。

TTC下層培養(yǎng)基[13]：葡萄糖10 g/L，蛋白胨2 g/L，酵母粉1.5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，硫酸鎂0.4 g/L，瓊脂20 g/L，pH值5.5～5.7，于115℃下滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[4]：葡萄糖200 g/L，酵母粉10 g/L，硫酸銨1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂1 g/L，于115℃下滅菌20 min。

1.2 儀器

顯微鏡，重慶奧特光學儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平，常州市衡正電子儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司產(chǎn)品；電熱爐，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司產(chǎn)品；分光光度計，上海佐科儀器儀表有限公司產(chǎn)品；手持折光儀，上海電物理光學儀器有限公司產(chǎn)品；高壓滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母的提取

取適量的3種樣品，經(jīng)過適當處理后，分別裝入已滅菌的含有60～75 mL的糖度為10°Bx葡萄糖液的250 mL錐形瓶內，靜置于28℃條件下培養(yǎng)3 d，3 d后取下層液體20 mL轉接入含新鮮的10°Bx葡萄糖液的錐形瓶，同等條件下培養(yǎng)相同時間，完成第2次酵母富集，同理完成第3次酵母富集[3]。

取3個樣品的第3次的富集液，分別做10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7等 7 個稀釋度，取10-3，10-4，10-5，10-6稀釋度的試管中的液體，移液接入YEPD瓊脂培養(yǎng)基中涂布稀釋，每個稀釋度共做3組平行試驗并進行空白對照，倒置平板，放置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，觀察酵母菌形態(tài)，并用顯微鏡觀察細胞特征。

1.3.2 酵母菌的梯度馴化

選取11個符合酵母菌形態(tài)特征且菌落生長狀況較好的酵母菌菌落，在YEPD瓊脂培養(yǎng)基上進行平板劃線分離，每個樣品做3組，劃線后的菌株置于28℃下培養(yǎng)48 h，觀察菌株的形態(tài)與生長情況。

在劃線分離培養(yǎng)的菌株中篩選出10個生長狀況良好的菌種進行劃線分離，重復劃線至生長出單個菌株后接入YEPD斜面固體培養(yǎng)基，于28℃下培養(yǎng)48 h，低溫保藏備用[14]。

采用逐步提高培養(yǎng)液糖濃度的方法進行梯度馴化。將平板篩選階段挑取的單菌落轉接入含10°Bx葡萄糖的YEPD液體試管培養(yǎng)基中，置28℃條件下培養(yǎng)3 d，3 d后從各試管中分別吸取0.1 mL的菌懸液，再次轉接入新鮮的含10°Bx葡萄糖的YEPD液體培養(yǎng)基試管中，28℃條件下培養(yǎng)3 d，如此重復3次。10°Bx糖濃度馴化試驗結束后，同樣步驟先后在20～60°Bx的YEPD液體培養(yǎng)基中進行酵母菌的馴化處理[3，12]。

1.3.3 梯度馴化后還原糖含量的測定

采用李環(huán)等人[15]測定還原糖含量的DNS法對梯度馴化后的YEPD液體培養(yǎng)基中還原糖含量進行測定，可得到準確性符合分析要求的還原糖含量，于波長520 nm處測定馴化后培養(yǎng)基中還原糖含量[16]，初步得到一批耐高糖度的酵母菌株，保藏菌種待用。

1.3.4 酵母的紫外誘變

選取初步得到的耐高糖酵母菌株，在90 mm無菌培養(yǎng)皿中加入5 mL制備好的酵母菌懸液進行紫外誘變處理。誘變參數(shù)[4]為紫外燈15 W，照射距離20 cm，處理時間為30，40，50，60，70 s。

1.3.5 誘變后耐高糖酵母的篩選

（1）耐糖試驗。取誘變后的酵母菌懸液，分別接種于 35，40°Bx的YEPD培養(yǎng)基與 35°Bx的YEPD瓊脂培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)3～4d，觀察誘變后菌株的形態(tài)與生長情況。用手持折光儀測其殘?zhí)橇?，篩選出生長狀況良好且殘?zhí)橇康偷慕湍妇N。

（2） 產(chǎn)酒精特性測定。接種上述YEPD培養(yǎng)基中的菌液劃線至TTC下層培養(yǎng)基，于28℃恒溫箱中培養(yǎng)1 d，倒入TTC上層培養(yǎng)基，繼續(xù)黑暗培養(yǎng)2～3 h后觀察平板菌落顏色。TTC能與酵母代謝產(chǎn)物結合發(fā)生顯色反應，顏色由淺紅色至深紅色，產(chǎn)酒精能力越強的菌株顏色越紅[13]。利用TTC平板顯色反應可以初步判定酵母菌的產(chǎn)酒精能力，選擇菌落顏色為深紅的酵母菌株用于下一步試驗。

（3）產(chǎn)氣能力測定。將上述篩選出的菌株按5%的接種量接種到帶有杜氏小管的YEPD培養(yǎng)基試管中，于28℃恒溫箱中恒溫培養(yǎng)，每隔2 h觀察1次杜氏小管內充氣情況，當氣體填滿杜氏小管時停止觀察，選擇出氣體充滿杜氏小管時間較短的的菌株[4]。

（4） CO2失重測定。將經(jīng)過產(chǎn)氣能力測定的菌種，接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，于28℃恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔1 d稱量并記錄數(shù)值。計算培養(yǎng)基發(fā)酵液減少的質量，當前后2 d培養(yǎng)基發(fā)酵液的質量差值小于0.2 g時，可以判斷為發(fā)酵完成，停止培養(yǎng)[4]。

1.3.6 酵母菌株的耐受性試驗

（1）酒精耐受性能測定。在每根滅菌后冷卻至室溫的YEPD培養(yǎng)基試管中分別加入乙醇，使培養(yǎng)基的酒精度分別為6%，8%，10%，12%，14%，16%Vol，再分別將最終篩選的待試菌株接種到試管中，于28℃下恒溫培養(yǎng)，經(jīng)過36 h后測定并記錄OD600nm值。

（2）耐酸性能測定。將YEPD培養(yǎng)基中pH值分別調至1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，滅菌后冷卻至室溫，再分別將最終篩選的待試菌株接種到培養(yǎng)基中，放置在28℃恒溫箱中恒溫培養(yǎng)，36 h后測定并記錄OD600nm值。

（3）高糖耐受性能測定。將YEPD培養(yǎng)基滅菌后冷卻至室溫，將培養(yǎng)基中葡萄糖質量分數(shù)分別調至30%，35%，40%，45%，50%，55%，再分別將最終篩選的待試菌株接種到試管中，放置在28℃恒溫箱中恒溫培養(yǎng)，36 h后測定并記錄OD600nm值。

1.3.7 耐高糖酵母發(fā)酵性能試驗

黃酒生產(chǎn)的一般流程如下：選擇糯米為原料→洗米、浸米→蒸飯→攤飯→加入紅曲、麥曲、酒藥拌曲搭窩→加入水、酵母等進行前發(fā)酵處理→后發(fā)酵→過濾澄清→煎酒→滅菌→成品黃酒。

按照上述工藝完成黃酒前發(fā)酵流程，在前發(fā)酵第2天分別加入0.5g傳統(tǒng)黃酒酵母與誘變菌種，測定糖度和酒精度；發(fā)酵第7天后再次測定其糖度和酒精度，進行對比。

2 結果與分析

2.1 天然酵母鏡檢的形態(tài)觀察

篩選10個菌株的顯微鏡觀察形態(tài)見表1。

表1 篩選10個菌株的顯微鏡觀察形態(tài)

經(jīng)過富集培養(yǎng)篩選出菌落生長狀況良好的培養(yǎng)基，得到10個符合酵母菌生長特點的培養(yǎng)基。其中從葡萄中提取的菌落為乳白色，邊緣整齊規(guī)則，有明顯隆起，菌落面積?。粡拿姘c蜂蜜中提取的菌株菌落為乳白色，邊緣不整齊，有微小波浪形曲折，無明顯突起，菌落面積大。挑取上述菌落進行顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，3種來源的菌株呈卵圓形或圓形，符合酵母菌細胞的形態(tài)特征。該形態(tài)分析結果與王昌魁、李偉安等人[3，12]對酵母菌形態(tài)分析的結果相同，由此可以判斷3種來源的菌株為酵母菌株。

2.2 酵母菌梯度馴化結果

將篩選出的10株酵母菌株，10-3面包、10-4面包、10-3葡萄1.1、10-3葡萄1.2、10-4葡萄2.1、10-4葡萄2.2、10-5葡萄、10-6葡萄、10-4蜂蜜3.1、10-4蜂蜜3.2，將其分別編號為MB-1.1，MB-2.1，PT-1.1，PT-1.2，PT-2.1，PT-2.2，PT-3.1，PT-4.1，F(xiàn)M-1.1，F(xiàn)M-1.2。梯度馴化后，在糖度為10，20，30°Bx的培養(yǎng)基中均有酵母菌的生長，在40°Bx的培養(yǎng)基中酵母菌生長緩慢，菌落面積小，且測得的殘?zhí)桥c原培養(yǎng)液中糖度相差不大甚至不變，而在糖度為50，60°Bx的培養(yǎng)基中酵母菌基本不生長。因此，通過梯度馴化可以得到耐受糖度為30°Bx的酵母菌株。

通過DNS法測得的殘?zhí)橇俊Ｆ咸烟堑臐舛扰c吸光度存在一定的線性關系，測定得到的葡萄糖標準溶液其回歸方程為Y=11.446X-0.011 3，R2=0.999 2，線性關系良好。

葡萄糖標準溶液見表2，葡萄糖標準曲線見圖1。

表2 葡萄糖標準溶液

按1.3.3測定殘?zhí)?，得到?的數(shù)據(jù)?？傻玫礁鱾€樣品溶液的吸光值與所測得的還原糖含量，原培養(yǎng)液中的還原糖含量為0.138 2 mg/100 mg，各個樣品酵母菌株分解葡萄糖能力為52.5%～92.9%，其中PT-2.2的還原糖含量為0.009 8 mg/100 mg，含糖量最低，因此該菌株的還原糖分解利用率最高。根據(jù)測定所得樣品的還原糖含量，發(fā)現(xiàn)FM-1.1，MB-1.1，MB-2.1，PT-1.2，PT-2.2這5個菌株具有較低的還原糖含量。因此，篩選得到耐糖度較高的FM-1.1，PT-2.2及MB-1.1這3個酵母菌株，用于下一步的紫外誘變育種篩選。

樣品溶液的吸光度與還原糖含量見表3。

表3 樣品溶液的吸光度與還原糖含量

2.3 耐糖與產(chǎn)酒精特性試驗結果

紫外誘變后的酵母菌株經(jīng)過耐糖性試驗，可在35°Bx的YEPD培養(yǎng)基和YEPD瓊脂培養(yǎng)基內生長，而在40°Bx的YEPD瓊脂培養(yǎng)基上酵母菌的生長情況較差；在產(chǎn)酒精試驗中，得到的菌種均為深紅色，無明顯差別，即菌株都有較好的產(chǎn)酒精性能。對35°Bx的YEPD培養(yǎng)基中酵母菌進行糖度測定。

不同菌種35°Bx培養(yǎng)基的殘?zhí)橇恳姳?。

表4 不同菌種35°Bx培養(yǎng)基的殘?zhí)橇?g·L-1

由表4可看出，PT-2.2紫外馴化40 s，F(xiàn)M-1.1紫外馴化40 s，MB-1.1紫外馴化50 s的菌種殘?zhí)橇孔钌伲贤庹T變的最優(yōu)時間為40～50 s。將上述3個殘?zhí)橇孔钌俚木攴謩e編號為PT-2.2-40，F(xiàn)M-1.1-40，MB-1.1-50，用于下一步酵母菌株發(fā)酵特性檢測試驗。

2.4 產(chǎn)氣能力測定結果

產(chǎn)氣能力見圖2。

由圖2可知，按5 h的產(chǎn)氣量排序，順序大小為FM-1.1-40＞PT-2.2-40＞MB-1.1-50，且 3 個菌株都可在10 h充滿小管。根據(jù)排氣量測定結果，F(xiàn)M-1.1-40與PT-2.2-40這2個酵母菌株的產(chǎn)氣能力更強。

2.5 CO2最大失重的測定結果

CO2最大失重見圖3。

由圖3可知，CO2失重隨時間變化呈增長趨勢，各酵母菌株的CO2最大失重依次為 FM-1.1-40＞PT-2.2-40＞MB-1.1-50，其中前3 d，每日的CO2最大失重呈線性相關，其斜率可以反映失重的速度，因此每日CO2最大失重速率的菌株依次為FM-1.1-40，PT-2.2-40，MB-1.1-50，最終發(fā)酵結束后各個菌株的失重依次為4.8，4.6，4.5 g?？梢姼鱾€菌株的CO2最大失重相差不大，同時用于下一步的耐受性試驗。

2.6 酒精耐受性測定結果

酵母耐酒精試驗見圖4。

由圖4可見，酵母菌的生長活力受酒精度的影響，隨著酒精度的提高而逐漸下降，當酒精度大于10%Vol時 FM-1.1-40，PT-2.2-40，MB-1.1-50 菌株的生長均受到了抑制，而FM-1.1-40菌株的抑制程度略小于PT-2.2-40菌株和MB-1.1-50菌株，因此其耐酒精的能力比其他2個菌株要高，在酒精度為7%Vol時3個菌株的耐受度都表現(xiàn)良好。

2.7 耐酸性能的測定結果

酵母耐糖試驗見圖5。

酵母菌最適pH值一般在4.5～5.5，此范圍的酸性環(huán)境下酵母菌有著較強的發(fā)酵能力，但當酵母菌在過低pH值的情況下其生長會受到抑制作用。

由圖5可知，PT-2.2-40菌株，F(xiàn)M-1.1-40菌株，MB-1.1-50菌株在pH值2.5～4.0時均能正常生長，但當pH值≤2.0時，其生長受到一定的抑制，幾乎停止生長，而FM-1.1-40受抑制程度會比其他2個菌株的低，因此其耐酸性的能力較強。

2.8 高糖耐受性測定結果

酵母耐糖試驗見圖6。

由圖6可知，PT-2.2-40菌株，F(xiàn)M-1.1-40菌株，MB-1.1-50菌株在含糖量為25%時生長速度是比較快的，當葡萄糖質量分數(shù)增加時各菌種的生長均會受到一定的抑制，糖度越高，生長速度越慢，F(xiàn)M-1.1-40菌株在葡萄糖質量分數(shù)升高的過程中受到抑制的程度略小于其他2個菌株。當葡萄糖質量分數(shù)達到45%的時候，菌株停止生長。綜合上述結果，最終通過篩選得到FM-1.1-40酵母菌株作為黃酒釀造過程中的發(fā)酵菌株。

2.9 誘變菌種與傳統(tǒng)菌種黃酒發(fā)酵試驗的對比結果

葡萄糖質量濃度對比見表5，酒精度對比見表6。

表5 葡萄糖質量濃度對比

表6 酒精度對比

將篩選出的FM-1.1-40酵母菌株與傳統(tǒng)酵母同時應用到黃酒釀造過程，對比發(fā)現(xiàn)前發(fā)酵第7天FM-1.1-40酵母菌株利用糖發(fā)酵產(chǎn)生酒精的能力比傳統(tǒng)酵母的能力要高，可知馴化的酵母較傳統(tǒng)酵母具有更優(yōu)的降糖產(chǎn)酒精能力，后期將繼續(xù)探究耐高糖酵母菌株應用于黃酒的釀造工藝的研究，進而生產(chǎn)一批低糖黃酒產(chǎn)品。

3 結論

以蜂蜜、葡萄、面包3種原料進行酵母菌富集菌株，通過梯度馴化與紫外誘變相結合的手段選育耐高糖且發(fā)酵特性優(yōu)良的酵母菌株，經(jīng)過相關性能研究獲得具有耐高糖性能的酵母菌株FM-1.1-40，其最大耐受糖度為40%，耐受酒精度為10%Vol，可在pH值1.5的條件下生長。將篩選出的耐高糖酵母菌株應用到黃酒釀造過程中，糖類物質轉化率提高11%，酒精度提高0.5%。因此，耐高糖酵母在黃酒降糖關鍵技術方面具有良好的應用價值，可考慮進一步應用于黃酒工業(yè)化的釀造過程。