CRISPR /Cas9基因編輯技術在山羊和綿羊中的應用研究進展

宋紹征 陸睿 張婷 何正義 吳趙曼秋 成勇 周鳴鳴

（1. 無錫太湖學院護理學院，無錫 214000；2. 江蘇食品藥品職業(yè)技術學院，制藥工程學院，淮安 223003；3. 揚州大學獸醫(yī)學院 江蘇省轉基因動物制藥工程研究中心，揚州 225009）

基因編輯技術是指對生物體基因組特定DNA進行精確敲除、定點插入或突變等，使被編輯的生物體性狀定向改變且能夠穩(wěn)定遺傳的技術，現(xiàn)被廣泛地應用于生物醫(yī)藥、基因工程和動植物分子精準遺傳育種等領域研究［1-3］。該技術經(jīng)歷了同源重組、RNA干擾、鋅指核酸酶（ZFNs）、轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs）和成簇規(guī)律間隔短回文重復序列/相關蛋白9（CRISPR/Cas9）技術等幾代發(fā)展。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種新型的第三代基因定點編輯技術，只需改變較短的sgRNA序列便可引導Cas9蛋白進行定點精準編輯，相比于其它傳統(tǒng)的基因編輯技術，具有簡化構建過程、高效、精準、特異等良好特點，受到國內外眾多科學研究者的青睞，尤其是在畜牧業(yè)遺傳育種領域中已成功地用于多種動物的基因改造和物種性狀改良［2］。

山羊和綿羊不僅是重要的經(jīng)濟家畜，而且也成為重要的實驗動物，國內外早已有羊體細胞克隆和基因修飾的報道，被廣泛地應用于生物醫(yī)學和動物遺傳育種等研究領域。由于羊具有性情溫順，肉質鮮嫩，繁殖率高、適應性強的特點，對其進行基因編輯可培育優(yōu)良品種，提高動物生產(chǎn)性能，獲得優(yōu)質的肉、奶和羊絨等農(nóng)副產(chǎn)品［3］。CRISPR/Cas9基因編輯技術出現(xiàn)后，便快速地應用于羊的基因編輯研究。本文重點對CRISPR /Cas9基因編輯技術及在羊乳“人源化”改造、提高肉品質、改善絨毛纖維品質等方面的應用研究進展及前景作簡要闡述。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術

1.1 CRISPR/Cas9的概述

CRISPR/Cas9是基于古生菌和細菌抵御外來質體或病毒的遺傳物質防御系統(tǒng)，該系統(tǒng)中CRISPR相關酶（Cas）在序列識別處可切割外源基因組DNA［4］。用于基因編輯，由sgRNA序列引導Cas9內切酶特異性地識別靶基因位點，從而剪切雙鏈DNA，通過非同源末端連接和同源重組的修復獲得基因突變體，是近年興起的一項新型基因編輯技術，現(xiàn)廣泛應用于動植物轉基因、基因敲除及基因打靶等個體或細胞組織的基因定點修飾［5-6］。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)于1987年，由日本大阪大學的Ishino等［7］在K12型大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的一段特殊DNA回文序列，但是當時并未闡釋這段序列的功能。2002年，Jansen 等［8］將上述序列正式命名為“成簇規(guī)律間隔短回文重復序列（CRISPR）”。直到2008年，CRISPR/Cas系統(tǒng)對DNA的精準切割機理才逐漸被人們所認識［9］。2013年，張峰［5］和 Church等［6］首次利用CRISPR/Cas系統(tǒng)介導小鼠和人類細胞基因編輯研究，成功實現(xiàn)了哺乳動物基因組的定點修飾，該技術得到了廣泛應用和推崇，連續(xù)兩年被Science雜志評為“年度十大科學突破之一”。2015年，麻省理工學院McGovern腦研究所和哈佛醫(yī)學院Broad研究所通過設計改造CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，大大地降低了該系統(tǒng)的“脫靶”效應，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)得到了進一步完善和改進［10］。此后，CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術迅速成為國內外研究的熱點，眾多的研究成果被各種相關文獻報道和轉載［11-14］。

1.2 CRISPR/Cas9的作用機理

CRISPR/Cas系統(tǒng)是由3'端的重復間隔序列（CRISPR）和5'端的編碼Cas蛋白操縱子兩部分組成［3］。該系統(tǒng)具有切割DNA的能力，分為獲取間隔序列、基因座表達、切割外源DNA三個階段。獲取間隔序列階段是指外源物質入侵細菌時，利用Cas蛋白復合物將外源基因切割加工成一種新的重復間隔序列，從而整合到CRISPR重復序列簇內儲存“記憶”?；蜃磉_階段是指細菌轉錄形成precrRNA，反式編碼小RNA（tracrRNA）與Cas蛋白相互作用形成雙鏈RNA，進一步被核酸內切酶剪切成為小的成熟RNA（crRNA）。切割外源DNA階段是指crRNA、tracrRNA和Cas蛋白結合形成三聚復合體，特異性識別PAM序列，從而切割斷裂DNA雙鏈，引發(fā)機體內基因修復機制［4］。

目前的CRISPR/Cas9系統(tǒng)經(jīng)人工改造后是一種應用更簡單、適用性更廣泛的基因編輯技術，由tracr RNA、crRNA 和 Cas9三 種 成 分 構 成［6］。將crRNA和tracrRNA組合為一條嵌合的引導序列RNA（sgRNA），從而進一步簡化為僅含sgRNA和Cas9這兩部分組成的新型系統(tǒng)，不需要在體外應用RNaseⅢ切割DNA。sgRNA引導Cas9蛋白識別靶標基因片段上的PAM序列，其中一段約20 bp的RNA序列可以和目標基因序列特異互補配對，Cas9蛋白的Ruv C和HNH位點區(qū)域分別切割互補鏈和非互補鏈，導致DNA雙鏈斷裂，再經(jīng)同源重組或非同源末端連接兩種修復途徑對發(fā)生斷裂的DNA雙鏈進行修補，最終實現(xiàn)對靶基因的定向精確編輯功能［10］。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術在山羊和綿羊中的應用

2.1 羊乳“人源化”改造

山羊乳成分更接近人乳，已成為牛奶的重要補充乳品，尤其適用于牛乳過敏癥體質者。但是，羊乳中存在β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，BLG）等致敏原，能夠引起人體過敏反應。羊乳的人源化改造是通過體細胞基因打靶技術，定點敲除基因的同時在山羊BLG基因座中敲入hα-LA或hLF等人營養(yǎng)蛋白的功能基因，既可以去除山羊乳中的過敏原，又能增加羊乳中的營養(yǎng)成分，從而提高羊乳的品質，使其更適合于嬰幼兒飲用［11］。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的基因編輯技術可提高BLG基因座定點敲除BLG或用人乳蛋白基因靶向導入的效率，加快乳蛋白基因改造和羊乳“人源化”的研究的進程。

2016年，劉暢［15］在山羊β-酪蛋白基因第二外顯子序列中設計了CRISPR/Cas9介導hfat-1基因打靶載體定點導入山羊胎兒成纖維細胞，經(jīng)G418篩選、PCR檢測后共獲得45株中靶細胞，打靶效率高達74.29%，明顯優(yōu)于TALENs介導的基因打靶，這為高效編輯羊乳蛋白基因和羊乳“人源化”改造提供了有力的研究價值。2017年，Zhou等［1］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功地敲除奶山羊的BLG雙等位基因，為羊乳“人源化”改造的分子精準遺傳育種提供了可能性；同年，南京農(nóng)業(yè)大學的張艷麗團隊［16］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導人乳鐵蛋白在山羊BLG基因座的打靶研究，高效率地獲得了BLG-/hLF+基因打靶細胞株，該項研究主要是針對山羊BLG第一外顯子序列設計構建了CRISPR/Cas9載體（pCas9-sg BLG）和BLG基因座的hLF基因打靶載體（p BHA-hLF-NIE），共轉染導入山羊耳成纖維細胞中，篩選檢測后，成功地獲得了大量的基因打靶細胞，打靶效率達到36.69%；值得一提的是，在這項研究中首次利用RAD51蛋白激活劑（RS-1）能夠顯著地提高外源基因敲入的效率，在今后的工作中值得借鑒。揚州大學動物基因工程實驗室利用CRISPR/Cas9這把鋒刃的“利器”［17］，在奶山羊BLG基因座定點靶向敲入hLF基因，獲得了BLG基因座人乳鐵蛋白編碼序列定點整合山羊胎兒成纖維細胞系，并用于山羊體細胞克隆。該實驗室針對山羊BLG基因第一外顯子序列構建sgBLG/Cas9載體，電轉染導入山羊胎兒成纖維細胞，以中靶細胞作為體細胞核移植的供核細胞來制備轉基因山羊，移植受體母羊后，剖宮產(chǎn)獲得3只35日齡打靶克隆胎兒，經(jīng)鑒定為BLG-/hLF+基因型，并建立了細胞系，打靶效率高達51.4%，這為培育羊乳中富含功能營養(yǎng)成分和低致敏原的轉基因山羊新品系提供了實驗依據(jù)。

由于牛奶的巨大商業(yè)應用和在乳品中的地位，也有學者提出對牛奶的人乳化改造。2015年，西北農(nóng)林科學大學張涌團隊［18］首次通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)對牛胎兒成纖維細胞β-酪蛋白基因進行編輯，打靶效率為9.7%，這為牛β-酪蛋白基因座定點打靶hLF基因和改造動物乳成分奠定了基礎，也為后續(xù)羊乳“人源化”改造提供了科學依據(jù)。阿根廷學者Alessio等［19］通過CRISPR/Cas9和轉座子系統(tǒng)在牛的BLG基因座定點導入多不飽和脂肪酸（ω-3和ω-6）基因，有效地提高了人類食用牛乳的營養(yǎng)價值。

2.2 提高羊肉品質

肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）基因是一種骨骼肌生長負調控基因，研究表明，哺乳動物中的MSTN 可通過減少肌衛(wèi)星細胞的更新和肌纖維蛋白的合成，從而限制肌細胞的過度增長，抑制動物骨骼肌的生長［20］。MSTN基因突變可導致動物的成肌細胞數(shù)量增加，從而引起家畜的臀、肩、大腿等部位的肌肉群尤其發(fā)達而呈現(xiàn)“雙肌”性狀，這對于提高動物產(chǎn)肉性能具有較高的應用價值，一直是廣大育種科研者追求的目標［12］。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除基因部分編碼序列或對個另氨基酸的定點精準突變，可以培育出MSTN-/-基因編輯動物，由于該基因的變異而呈現(xiàn)“雙肌”表型，達到提高動物瘦肉率、改善肉品質的遺傳育種目標。

2014年，連正興團隊［21］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導綿羊的MSTN基因靶向修飾，通過胚胎顯微注射的方式成功獲得了2只MSTN基因突變羔羊，基因編輯的效率為5.7%，這是首例將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應用于綿羊MSTN基因編輯；同年，陳創(chuàng)夫等［22］首次將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應用于山羊MSTN基因的編輯，通過核移植的方式獲得了3只MSTN基因編輯山羊。2015年，Crispo等［12］根據(jù)綿羊的MSTN基因位點設計并構建了CRISPR/Cas9表達載體，通過受精卵胞質顯微注射的方式獲得了22只新生綿羊，經(jīng)鑒定有10只為MSTN基因突變綿羊，對其性狀進行研究發(fā)現(xiàn)，MSTN基因編輯綿羊的體重明顯大于野生型綿羊，表現(xiàn)出典型的“雙肌”表型性狀；進一步研究分析，其中有8只為MSTN雙等位基因突變羔羊（含5只雜合子），這一研究證實了CRISPR/Cas9可在綿羊上高效敲除MSTN基因，是一種行之有效的基因編輯工具。此后，關于山羊和綿羊的MSTN基因敲除研究不斷涌現(xiàn)。2016年，Wang等［23］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導獲得了MSTN基因編輯綿羊，通過組織切片技術對MSTN基因突變綿羊和野生型綿羊的肌肉組織對比分析顯示，MSTN基因敲除能促進綿羊的肌肉生長發(fā)育，其肌肉發(fā)育程度、肌纖維長度均明顯高于普通野生型綿羊。2018年，于鴻浩等［24］和魏海霞等［20］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導分別獲得了MSTN基因突變山羊和綿羊，且突變效率得到了大大的提高，甚至高達100%編輯效率。Aiello和Patel等［25］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導MSTN基因突變也大大地促進了羊肉品質的提高。揚州大學動物基因工程實驗室于寶利和梅珺琰等［26-27］根據(jù)山羊MSTN基因外顯子Ⅲ設計了sgRNA序列，并通過受精卵顯微注射的方式成功獲得2只MSTN基因突變山羊。經(jīng)測序比對，一只山羊為雜合子雙等位基因突變（一條MSTN基因缺失12 bp，同時替換1 bp；另一條MSTN基因缺失3 bp），而另一只山羊則為單等位基因突變，僅一條MSTN基因缺失26 bp。兩只MSTN基因突變山羊胎兒均呈現(xiàn)明顯的“雙肌”表型，體重和體長顯著增加，組織切片顯示肌束橫截面及肌纖維密度均顯著增大。

2.3 改善羊毛纖維品質

隨著生活水平的不斷提高，人們對羊絨等動物纖維服飾產(chǎn)品的需求也越來越大。絨山羊屬于異質毛被，含有初級毛囊和次級毛囊兩種，其中次級毛囊生成的毛纖維便是羊絨，屬于無髓毛，而初級毛囊生成的則是有髓的粗毛［28］。研究發(fā)現(xiàn)，具有調控毛發(fā)生長功能的基因主要有成纖維生長因子（Fibroblast growth factor 5，F(xiàn)GF5）和血管內皮生長因子（Vascular endothelial cell growth factor，VEGF）兩種，F(xiàn)GF5基因變異或VEGF基因轉入可導致毛囊生長期延長，促進毛發(fā)生長，從而提高羊絨產(chǎn)量、改善絨品質［28-30］。因此，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對絨山羊的FGF5和VEGF基因進行定向精準編輯，在絨山羊體內突變FGF5基因和導入VEGF基因將是提高絨山羊產(chǎn)絨量和改善絨毛品質的一種有效的精準分子育種途徑。

2015 年，Wang 等［23］通過 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)胚胎注射獲得了21只FGF5靶向編輯的陜北白絨山羊，對獲得的FGF5編輯羊 0-120 d 的絨長性狀檢測結果表明，F(xiàn)GF5基因靶向編輯的絨山羊的絨毛長度和密度等指標顯著高于野生型絨山羊，但此時獲得的FGF5基因編輯絨山羊存在脫靶效應。2016年，西北農(nóng)林科技大學王小龍、陳玉林課題組［29］在絨山羊的毛囊特異性啟動子KAP6.1的3'UTR非編碼區(qū)域設計sgRNA引導序列并構建CRISPR/Cas9載體，與VEGF基因打靶載體共轉染絨山羊胎兒成纖維細胞，結果表明sgRNA與Cas9介導VEGF定點敲入效率為15.7%-27.6%，外源VEGF基因有表達功能，且不影響原KAP6.1基因的正常表達，這為后期制備高產(chǎn)優(yōu)質轉基因絨山羊奠定了基礎。2017年，Hu等［3］和Li等［13］也應用類似的方法分別獲得了FGF基因敲除轉基因綿羊個體，進一步加快了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在絨山羊基因組中編輯修飾的進程。此外，內蒙古大學劉東軍團隊［30-31］利用CRISPR/Cas9基因編輯技術于2018年成功地制備了VEGF基因在FGF5和CCR5基因座定點打靶羔羊，在導入促進毛囊生長基因的同時敲除沉默部分不利基因，這為培育產(chǎn)絨量高、品質好的絨山羊新品種提供了科學依據(jù)，在改良毛發(fā)基因分子遺傳育種上起到了一舉兩得的作用。

2.4 其它相關性狀基因的挖掘和應用

由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)在動物基因組編輯中顯示的巨大優(yōu)勢，育種工作者已將重點鎖定在與動物表型相關的功能基因選擇作為基因編輯的目標，培育出優(yōu)良性狀的新品種，適應市場需求。目前在綿羊和山羊中已挖掘出了一大批表型相關基因［24］，主要有高原適應相關基因（P53、EPAS1、IFNGR2、MAPK4、NOX4、SLC2A4、PDK1、SOCS2）、毛纖維性狀相關基因（FGF5、VEGF、Tβ4、PRL、LCE7A、MOGAT2、MOGAT3、ASIP）、產(chǎn)奶性狀相關基因（Casein、α-Lactalbumin、β-Lactoglobulin、ACACA、SCD、LPL、DGAT1、SSCP、gGH、SATA5A）、 沙漠 干 旱 適 應 相 關 基 因（GPX3、ANAX6、GPX7、PTGS2、CPA3、ECE1）、繁殖和生長性狀相關基因（BMP15、GDF9、LTBP-1、BMPR1B、B4GALNT2、INHBA、MTNR1B、MSTN）、角型相關基因（RXFP2）、瘤胃功能相關基因（TCHHL2、PRD-SPRRII）等。通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)對這些相關基因精準編輯來制備和選育多種性狀優(yōu)良的動物，是羊基因編輯分子育種潛在的研究熱點。

劉明軍團隊［14］利用CRISPR/Cas9 技術成功獲得了6只ASIP基因編輯綿羊的研究表明，該基因可作為綿羊毛色篩選的標記基因。Niu等［32］應用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對綿羊和灘羊的ASIP、BCO2和GDF9基因進行編輯的研究，成功地獲得了有表型的基因編輯動物個體。內蒙古大學郝斐［33］通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)和體細胞核移植技術制備了EDAR基因打靶絨山羊，觀察結果顯示EDAR基因打靶絨山羊出現(xiàn)頭頂沒有毛發(fā)、皮膚和毛囊異常等特征。南京農(nóng)業(yè)大學郭日紅等［34］首次利用CRISPR/Cas9介導敲除山羊CLPG1基因保守位點來研究“美臀”現(xiàn)象，為今后該基因的表達調控機制研究奠定了實驗基礎。此外，還有Wu等［35］關于Rosa26基因的研究、Zhang等［36］關于fat-1基因的研究和Li等［37］關于Tβ4基因的研究，這些大量的相關基因研究為人們培育優(yōu)良性能的羊及其它動物的奠定了基礎，也為基因編輯分子精準遺傳育種提供了可靠的保障。

3 展望

基因編輯技術使人類可以對生物體基因組進行精準的編輯（插入、缺失、突變等），從而定向改變其性狀。CRISPR/Cas9系統(tǒng)自問世以來，就有著其它傳統(tǒng)基因編輯技術無可比擬的優(yōu)勢，在生物醫(yī)學和遺傳育種領域創(chuàng)造了一批批科研奇跡，更被認為是生物體中最有效、最便捷的基因編輯“利器”［38］。羊是一種重要的經(jīng)濟家畜動物，也是一種常用的實驗動物。研究羊的基因編輯對生物制藥、基因治療、物種性狀改良等領域具有重要意義。

此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在羊基因組編輯的其它方面也表現(xiàn)出較大的應用前景。在遺傳育種中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術避免了傳統(tǒng)育種技術的種間生殖隔離、不良基因連鎖以及多代雜交、不可精準控制等局限，可根據(jù)需求輕易引入新的優(yōu)良性狀基因，加快育種進程［24］；在基因組學研究中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可對各種基因組序列進行精準的編輯修飾，研究多個基因的協(xié)同作用或代償作用，構建關鍵基因文庫，使功能基因的研究更加簡單有效［32］；在疾病動物模型中，通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建了各種白化病、血友病、帕金森綜合癥、肺癌、糖尿病、心臟病、精神分裂癥以及器官移植相關基因的其它動物模型［39］，這為今后開展羊的相關疾病模型提供了有效途徑；在疫病防控中，通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)可對羊炭疽病、羊結核病、羊痘等內源致病相關基因進行精準改造，從而預防該疾病的發(fā)生；同時，通過基因編輯技術還可以對外源致病細菌或病毒的靶基因進行切割滅活，從而殺滅該細菌和病毒以治療某些傳染性疾?。?0］。

目前雖然在羊乳“人源化”改造、提高肉品質和改善毛纖維品質等方面取得了一定的成果，但是，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在羊的基因編輯研究中還存在一定的局限性。例如，如何避免脫靶效應和嵌合體突變動物的產(chǎn)生；如何提高轉基因動物個體的存活率和健康成長率；如何確保轉基因遺傳育種及轉基因副產(chǎn)品的生物安全；如何縮短研發(fā)階段與產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的差距等。因此，這些羊基因編輯相關問題今后有必要進一步研究，掃清障礙。

綜上所述，由于CRISPR/Cas9基因編輯技術具有編輯效率高、構建簡單、特異性強、精準性高以及序列要求低等獨特的優(yōu)勢，深受人們的信賴，為羊及其它動物的遺傳育種、基因組學研究、疾病動物模型和疫病防控等方面提供了新的方法和思路。同時，應加大研發(fā)投入，充分發(fā)揮CRISPR/Cas9系統(tǒng)的巨大潛能，不斷優(yōu)化，爭取獲得更多振奮人心的研究成果，向產(chǎn)業(yè)化和市場化進軍，推動社會經(jīng)濟發(fā)展。