生物技術生產丁酸的研究進展

王杰明, 石雅麗,2*, 劉安禮, 劉占英,2, 蘭輝, 郝健霞, 姚梽鵬, 張清翠

1.內蒙古工業(yè)大學化工學院食品與生物工程系, 呼和浩特 010051;

2.內蒙古自治區(qū)發(fā)酵產業(yè)節(jié)能減排工程技術研究中心, 呼和浩特 010051

丁酸(butyric acid)作為一種重要的化工原料,已經大量的應用于民生行業(yè)中。在食品領域，丁酸及其衍生物作為食品添加劑可直接添加到食品中，以增強食品的風味，比如，丁酸酯可以產生誘人的香味，在食品中被廣泛用作香料；丁酸鈉是一種新型的飼料添加劑，正在逐步替代傳統(tǒng)的抗生素類添加劑[1]。在醫(yī)藥領域，丁酸作為一種短鏈脂肪酸，它是人類和其他許多哺乳動物腸道上皮細胞的首選能源物質，因此它對維持和促進腸道正常功能起著重要作用，所以丁酸對腸炎有很好的治療作用；同時，丁酸能阻止組蛋白脫去乙酞基團，所以它可以防止癌細胞的擴增，具有抗癌的作用。此外丁酸因微生物對其不具備抵抗力故有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的土壤熏蒸劑[2]。

目前，工業(yè)上生產丁酸主要以石油為原料進行化學合成，但由于當今世界原油供應存在不穩(wěn)定性和不可持續(xù)性的問題，使得丁酸生物技術發(fā)酵法引起了人們的密切關注。與化學法相比，生物發(fā)酵法的優(yōu)勢有以下幾點：所使用的原材料比較廣泛，發(fā)酵過程屬于典型的厭氧過程，低能耗、對環(huán)境的污染較低，以及可持續(xù)加料生產丁酸等。因此，使用微生物發(fā)酵生產丁酸日益受到重視[1]。

1 丁酸的性質

丁酸，化學結構式為CH3CH2CH2COOH，分子量為88.11 g·mol-1，熔點為-7.9 ℃，沸點為163.5 ℃，無色至淺黃色透明油狀液體，有刺激性氣味，屬于典型的低級揮發(fā)性脂肪酸。因為丁酸可溶于水和部分有機物，可伴隨水蒸氣揮發(fā)，而且能與水形成共沸物，因此可以用液相色譜法對其進行定性及定量檢測。

2 產丁酸菌株的特點

目前，產丁酸菌至少有10個屬，其中有7個屬已進入工業(yè)應用，它們都是厭氧微生物。其中，梭菌屬(Clostridium)菌株在工業(yè)上生產丁酸應用最廣泛，這其中研究較為深入的產丁酸菌株有：丁酸梭菌(C.butyricum)[3-6]、土丁梭菌(C.tyobutyricum)[7-10]和熱丁烯梭菌(C.thermobutyricum)[11-14]。丁酸梭菌和土丁梭菌生長環(huán)境的溫度一般在25～37 ℃，熱丁烯梭菌的最適生長溫度是55 ℃；培養(yǎng)基的pH范圍是4.0～9.8，培養(yǎng)基pH差異通常會導致乙酸鹽和丁酸鹽這兩種產物的比例變化。土丁梭菌生長時可被利用的碳源有葡萄糖、木糖和果糖[15-16]，熱丁烯梭菌生長時可被利用的碳源有單糖(但不能利用阿拉伯糖、半乳糖)、二聚糖、低聚糖和多聚糖[13]。目前產丁酸的菌株主要是丁酸梭菌，又叫作酪酸梭菌，主要有直立和彎曲兩種形態(tài)，厭氧菌可單個或成組出現，菌體有鞭毛，能通過鞭毛運動，孢子繁殖，孢子圓狀，菌體膨大后會呈現不同形態(tài)，主要為梭形[17]，乳白色菌落，直徑在1～3 mm間，表面有光澤。丁酸梭菌生長環(huán)境需要嚴格厭氧，溫度在30～37 ℃和pH在5.0～7.5最為適宜[18]。丁酸梭菌在進行發(fā)酵時絕大部分的可溶性碳水化合物和醇都能被利用，但是不能利用衛(wèi)矛醇、山梨醇以及鼠李糖。丁酸梭菌的代謝產物主要是丁酸、乙酸、甲酸和丙酮，有些也產生乳酸、琥珀酸和丁醇[19]。在自然界中可以很容易獲取該菌株，比如動物的排泄物。

3 微生物發(fā)酵產丁酸的細胞代謝途徑及其調控

利用分子生物學手段對微生物菌株進行遺傳改造，目的是提高菌株的生產性狀，這種方法目前已經應用于工業(yè)微生物中，但關于丁酸產生菌改造的研究報道很少。高效的遺傳改造依賴于相關代謝途徑在分子水平上調控機制的闡明，這為選育高生產效率的菌株奠定了基礎。

通過微生物發(fā)酵生產丁酸的細胞代謝過程是：首先，產丁酸菌通過糖酵解途徑將碳水化合物變?yōu)楸?PA)，丙酮酸與輔酶A形成乙酰輔酶A，再通過飽和脂肪酸合成途徑將乙酰輔酶A變?yōu)槎□］o酶A。當丁酸激酶存在時部分丁酰輔酶A會直接轉變?yōu)槎∷幔€有部分丁酰輔酶A與乙酰輔酶A轉移酶結合形成丁酰輔酶A:乙酰輔酶A轉移酶，這種轉移酶在一定的條件下可以產生丁酸，以及乙酰輔酶A。有部分乙酰輔酶A生成乙酸[20]。一般認為，丁酸激酶是丁酸菌的丁酸途徑中對丁酸生成起主要作用的酶，然而近年隨著大量的實驗研究數據顯示，丁酰輔酶A:乙酰輔酶A轉移酶很有可能是主要生產丁酸的酶[21-25]。

產丁酸菌株在合成丁酸和乙酸時生長條件基本相同，而且當這類菌株生長緩慢時，還會產生乳酸。同時，當發(fā)酵液pH和未離解酸的量發(fā)生變化，以及菌株生長期改變時，這類菌還能產生丁醇和丙酮，所以丁酸型發(fā)酵過程中通常不會僅獲得丁酸一種產物。因此，如何獲得單一的丁酸產物是對產丁酸菌株進行遺傳改造的一個重要方向。

4 發(fā)酵法生產丁酸的工藝運行方式

微生物發(fā)酵生產丁酸的主要問題是產物抑制，這導致微生物發(fā)酵法生產丁酸收率低且經濟效益差，因此選擇合適的生產工藝對發(fā)酵法產丁酸的生產效率有很大的影響。

4.1 丁酸的發(fā)酵工藝途徑

目前工業(yè)上采用的連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)是一種開放的發(fā)酵培養(yǎng)方式，這種培養(yǎng)方式可以使微生物在一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)下進行連續(xù)生長，從而提高生產效率，因此與分批發(fā)酵和補料分批發(fā)酵相比，連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)中丁酸產率較高，更適合丁酸發(fā)酵。連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)可以根據需要進行人為控制，使微生物在生長曲線中的某個階段發(fā)生代謝速率的改變，從而提高丁酸產量[26]。連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)技術可以延長有機體指數相，維持營養(yǎng)和細胞數(生物量)波動較小的生長環(huán)境[27]。連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)產生的丁酸濃度往往要高于分批發(fā)酵培養(yǎng)，所以通過使用連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)可以獲得更高的生產力。但是，當出現過量碳源、下游處理比較復雜以及最終產物抑制等操作問題時，建議采用在線分離或在線分離與原位產物分離相結合的補料分批發(fā)酵工藝。

4.2 采用固定化細胞反應器生產丁酸

固定化細胞是在不溶于水的特殊載體上將細胞固定，使細胞在一定的空間下進行生命活動。固定化細胞的生物反應器有如下優(yōu)點：首先，在固定化細胞系統(tǒng)中可以獲得較高的細胞密度；其次，生物反應器的結構比較簡單，當發(fā)酵完成后，細胞很容易從中分離，使下游工藝簡單化；再次，成本較低。此外，固定化細胞生物反應器可以提高反應器的生產效率(提高效率包括改進反應速率和簡化產品分離)[28-29]。細胞固定化可以有效地應用于厭氧過程，這種方式可使丁酸生產率高于普通連續(xù)過程。在使用固定化細胞的發(fā)酵過程中，通過脈沖添加不同的維生素，可以實現丁酸生產速率的提高。

流化床生物反應器、填料床生物反應器和橫流膜系統(tǒng)是目前應用最廣泛的固定化細胞生物反應器。這類反應器有很多優(yōu)勢：比表面積大、制造成本低、使用強度高和滲透性好等特點[30]。纖維床生物反應器就是一種典型的填料床生物反應器，固定化細胞處于纖維基質填料上，此反應器已成功用于丁酸的生產，與其他生物反應器的結構相比，此反應器的生產率、最終產品收率和濃度都顯著提高，可連續(xù)且無重復地進行接種，穩(wěn)定性好，而且下游產品的加工也簡單化[31]。

4.3 單獨提取及萃取

萃取時有機相的選擇很重要，需要選擇一種有效的具有生物相容性的萃取劑。向有機相中加入反應物或載體，也應該是生物相容的，從而增大分配系數。這種有機相如是Alamine 336(三辛胺)或Hostarex 327(三辛基氧化膦)與油醇的混合物，則采用液體膜的效果比簡單的提取更好，同時液體膜(有機相)可以再生，產物可以濃縮。第一階段是發(fā)酵液，第二階段是有機相，第三階段是水溶液剝離液，這些組合工藝已成功應用于丁酸的萃取。

目前有一種特別的分離方法是絡合萃取，在分離過程中溶液的分離相會與絡合劑的萃取溶劑反應，所生成的絡合物隨后再被轉移到萃取溶劑相中分離出來；再通過溫度或者pH的變化，反應逆向進行，實現再循環(huán)。因為低的pH會使丁酸分配系數增大，所以一般發(fā)酵液pH為2～3。稀釋劑也會影響丁酸的分配系數，主要用的稀釋劑是正辛醇或油醇，二者相比，用正辛醇可以縮短平衡時間[32]。

5 發(fā)酵法生產丁酸的影響因素

影響微生物發(fā)酵法生產丁酸的因素主要有pH、碳源、氮源、底物和終產物、預處理方法以及氧化還原電位。

5.1 pH對發(fā)酵法產丁酸的影響

由于發(fā)酵法生產丁酸都是利用微生物，而微生物生長有最適pH，同時發(fā)酵的產物也會影響發(fā)酵液的pH，因此發(fā)酵時必須考慮pH的影響。因為丁酸型發(fā)酵液的pH會逐漸下降，導致發(fā)酵類型發(fā)生轉化，所以需要人為補加一些能提高pH的料液[19]。同時研究發(fā)現在丁酸型厭氧發(fā)酵過程中，初始pH為4.0時，隨著pH升高酸產量明顯提高；當發(fā)酵初始pH為5.0時，丁酸產量達到最高，隨后進一步提高pH，丁酸產量反而會呈現下降的趨勢，但始終高于初始4.0時丁酸的產量。pH為初始4.0時丁酸的產量最低，可能是由于pH為4.0時酸分子所解離出的氫離子可以自由進出細胞膜，一旦過多的氫離子進入細胞后引起細胞質酸化，就會使得介導微生物細胞跨膜轉運質子梯度降低，即通常所說的酸堿度下降，最終使依賴于pH梯度的微生物細胞放熱反應和轉運系統(tǒng)解耦，從而抑制甚至毒害微生物的生長[33-34]。因此，pH對產酸相的最終產物有影響，這是產酸相最終產物的限制性因素之一。

5.2 碳源對發(fā)酵法產丁酸的影響

在微生物生長過程中碳源一直是重要的影響因素，生物發(fā)酵產丁酸的量和碳源有著密切的關系，一般葡萄糖的效果最好，其次是蔗糖和果糖[23]，但考慮到成本可以聯用蔗糖和丁二酸鈉作為復合碳源代替?zhèn)鹘y(tǒng)的單一碳源培養(yǎng)基[35]，這樣既能節(jié)約成本，又大大的提高了產丁酸的量。

5.3 氮源對發(fā)酵法產丁酸的影響

氮源分為無機氮源和有機氮源，二者對不同的微生物菌種的作用不同。通常無機氮源常用硫酸銨作為氮源；相比于使用單一氮源，有機氮源的產丁酸效果比無機氮源的效果更為顯著，其中以酵母膏的效果最好[36]。

5.4 底物和終產物對丁酸產量的影響

許多代謝途徑都會受到它們自身終產物的抑制。在利用梭狀芽孢桿菌發(fā)酵產丁酸的過程中，丁酸、乳酸、乙酸、丁醇、乙醇和丙酮都會影響丁酸的產量[35-36]。例如丁醇會改變膜的流動性、膜功能和細胞內ATP水平致使丁酸的產量降低，因此丁酸發(fā)酵也受到底物的抑制。未分解的丁酸通過細菌細胞膜進入胞內并最終被分解，它影響跨膜pH梯度并減少了微生物生長所需的能量[36]。在生產過程中為了使丁酸濃度保持在抑制水平以下，曾經用高稀釋率來降低丁酸濃度，但是，這不利于下游產物的純化，所以及時移出產物盡可能的降低丁酸濃度是非常重要的。

5.5 益生素對發(fā)酵法產丁酸的影響

益生素是一種含有多種對微生物有益物質的復合型生物制劑，因為它不會對微生物產生毒殺效應，且長期使用不會引起微生物產生抗性，因此益生素成為一種理想且綠色的可以替代傳統(tǒng)抗生素的添加劑[37]。

5.6 預處理方法對發(fā)酵法產丁酸的影響

在微生物發(fā)酵時，為了提高底物的利用率，常對底物進行預處理。目前常用的低成本預處理方法主要有加熱預處理和化學預處理，化學預處理又包括酸法預處理和堿法預處理。

5.6.1加熱預處理對發(fā)酵法產丁酸的影響 加熱預處理是常用于厭氧發(fā)酵的一種物理預處理手段。生物細胞一旦被熱處理后，細胞的狀態(tài)就會發(fā)生一定的改變，例如結合水和蛋白質等會透過膜釋放到胞外并水解。細胞在受到不同的預處理溫度加熱后,受損的細胞位置也不一樣：當處理溫度在45～65 ℃時，細胞膜會遭到破壞，同時核糖體RNA也會降解；50～70 ℃時的熱預處理將使DNA變性；65～90 ℃時細胞壁瓦解導致細胞死亡；70～95 ℃高溫處理時蛋白質分解成小分子肽段且易溶于水,成為很好的緩沖劑，讓被處理系統(tǒng)有較好的適應pH變化的能力[38]。伴隨著不同的熱處理溫度，細胞在厭氧發(fā)酵中所產丁酸的量也會明顯不同。進一步研究熱處理時間對細胞厭氧發(fā)酵產酸的影響，在80 ℃高溫下分別進行了15、30、45、60 min的丁酸厭氧發(fā)酵：當放置時間為15 min時發(fā)酵產酸量很低,隨著放置時間的逐漸延長,細胞發(fā)酵產酸量明顯上升，當放置時間進一步延長至30或45 min時發(fā)酵液中丁酸濃度急劇上升，當放置時間上升至45 min后,酸的產量開始呈現出下降的趨勢，當放置時間為15和60 min時發(fā)現產丁酸的量非常低[33]。熱處理時間太短會使得胞內有機物不能被完全破壞溶解且還會影響細胞的破壁從而導致破壁緩慢甚至不徹底,預處理時間過長則會使有機物質狀態(tài)發(fā)生改變或變質，因此實驗過程熱預處理時間可選擇30 min。

5.6.2酸法預處理對發(fā)酵法產丁酸的影響 酸式預處理是一種化學預處理方法。在厭氧發(fā)酵反應前加入強酸浸泡后的培養(yǎng)基底物，使細胞通透性增加，這樣胞內生物大分子降解為小分子物質后可釋放到胞外供產丁酸微生物利用。丁酸的厭氧發(fā)酵生產pH為4和5時,發(fā)酵液的丁酸濃度明顯提高,但pH為2和3時,發(fā)酵液中丁酸的濃度明顯低于pH為4和5時，原因是細胞處于強酸性條件時細胞中的有機物被大量破壞[33]。因此用酸對培養(yǎng)基進行預處理可以使細胞的厭氧發(fā)酵能力增強,而且最優(yōu)條件為pH 4～5。

5.6.3堿法預處理對發(fā)酵法產丁酸的影響 堿法預處理也屬于化學預處理方法。用堿性溶液調節(jié)細胞到特定的pH,可使細胞壁上蛋白質的電荷性質發(fā)生改變，從而改變細胞壁的通透性，釋放出生物小分子物質[39]，提高產丁酸菌利用底物的效率，進而促進厭氧發(fā)酵。

5.7 氧化還原電位對產丁酸的影響

自然界中不同種類的微生物使用的氧化還原電位(ORP)也不相同。大部分需氧微生物的ORP在300～400 mV，而ORP在100 mV以上需氧微生物就能生存；既好氧又厭氧的微生物在ORP是100 mV以上時是需氧的，ORP 在100 mV以下時是厭氧的；ORP為-250～-200 mV是保證全厭氧微生物生存的最低限度，全厭氧的產甲烷細菌需要ORP達到-600～-300 mV。經實驗驗證，丁酸型厭氧發(fā)酵過程需要的ORP值是-420～-350 mV[19]。

6 產丁酸菌株及其代謝產物的生理功能

丁酸梭菌常被用作醫(yī)藥、食品添加劑以及飼料添加劑等，丁酸梭菌代謝產物對人體有很多有益的作用。

6.1 維持腸道微生態(tài)平衡

腸道系統(tǒng)在長期進化中已形成一種獨特的微生物平衡，而在一定程度上機體的健康程度與腸道菌群的平衡息息相關，因此維持或調節(jié)腸道菌群平衡具有重要意義。作為腸道微生物的丁酸梭菌，就為腸道微生態(tài)平衡做出很多貢獻，它在腸道中可以通過產生超氧化物歧化酶和NADH/NADPH氧化酶抑制無益菌的生長[40]，保障或修復有益菌群適宜生長的環(huán)境，從而達到促進腸道中微生物種類和數量的快速平衡。丁酸梭菌代謝的產物如短鏈脂肪酸、抗菌物質、各種酶、維生素和氣體都發(fā)揮著它們特有的功效來保護著腸道。例如，由丁酸梭菌產生的纖維素酶等酶類可以降解纖維素等難以利用的有機物，繼而產生有益細菌可利用的低聚糖，使得有益菌在腸道中更好的生長。對于腸上皮細胞來說丁酸還是一種重要的能源物質，能促進腸道系統(tǒng)中結腸段細胞的再生和修復，對于改變腸道黏膜結構和提高腸道抗氧化能力的作用也十分顯著。因此，由于丁酸梭菌在調節(jié)腸道健康方面有著非常顯著的效果使得其產生的各種短鏈脂肪酸的研究也成為熱點。

6.2 增強機體免疫功能

研究發(fā)現丁酸梭菌可使機體小腸粘膜IgA的量明顯升高，抑制微生物的附著[41-43]。因此，丁酸梭菌可增強機體的體液免疫能力。

6.3 抗癌方面

目前，防治腫瘤是醫(yī)學研究的熱點，在這種趨勢下出現了一種新型的治療方法，即利用對機體有益的微生物群落聯用防治腫瘤，而丁酸梭菌防癌的原理就是基于此。丁酸梭菌能產生一種特殊酶類，這種酶可分解為激肽，激肽分解后癌組織中大多數毛細血管的通透性和循環(huán)能力減弱，癌細胞就會由于缺乏營養(yǎng)補給而死亡，也就是丁酸梭菌可以和癌細胞產生拮抗效應達到抑癌作用[44-47]；而且丁酸梭菌的分泌物具有一定的抗癌作用，可以消除某些致癌物，如丁酸可以消除亞硝銨的致癌活性而達到抗癌效果。同時，由于丁酸梭菌在腫瘤組織中具有一定的定植性和選擇性[48]，所以可以通過遺傳工程的改造使其分泌治療性蛋白質，如腫瘤壞死因子等。

7 展望

由于石油能源日趨緊張和農業(yè)廢棄物造成的環(huán)境污染等問題日益突出，農業(yè)種植廢棄物是生產液體燃料的理想原料，可生產各種有機化學品，包括乙醇、乳酸、丁醇和丁酸等，有機化學品的可持續(xù)生產可以改善許多與石油消費相關的問題。由于丁酸能夠廣泛應用于醫(yī)藥和食品等行業(yè)，因此，利用生物技術方法生產丁酸具有很大的市場潛力。

利用生物質原料生產有機化學品的主要障礙是成本問題，其中將纖維素水解成單糖和二聚糖的費用較高，因此，對丁酸產生菌酶學和生理學的研究是現階段的研究熱點，通過誘變和基因重組技術提高丁酸產生菌的酶活力和丁酸產量是研究者們的努力方向。同時，由于發(fā)酵培養(yǎng)基的成本對發(fā)酵產丁酸的成本影響很大，這還涉及到再生能源如農業(yè)廢棄物作為發(fā)酵底物是否可以有效利用以及生產工藝的優(yōu)化等問題。因此，微生物發(fā)酵生產丁酸還有很長的路要走。