IFN-γ在早孕母胎界面對(duì)吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)表達(dá)的正性調(diào)節(jié)研究

涂媛媛 喻海芬 趙淑云 翁宇紅 王 珺 李仕祥 錢志瑤 黃官友

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,貴陽(yáng) 550004)

胎兒如何逃脫母體免疫系統(tǒng)的攻擊，具體機(jī)制尚不明確。母胎界面由母體的蛻膜組織及胚胎的滋養(yǎng)細(xì)胞組成，胚胎作為半同種移植物不被母體排斥，與母胎界面的免疫耐受狀態(tài)相關(guān)。干擾素(interferon-γ，IFN-γ)由分泌蛋白質(zhì)組成，存在于各種脊椎動(dòng)物體內(nèi)，具有抗病毒、抗細(xì)胞增殖、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種活性[1]。吲哚胺-2，3雙加氧酶(indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO)是沿犬尿酸途徑中分解代謝催化色氨酸的限速酶，存在于哺乳動(dòng)物的組織與細(xì)胞中，在淋巴組織和胎盤中廣泛表達(dá)，正常狀態(tài)下呈低水平表達(dá)，在炎癥過(guò)程或感染中，IDO表達(dá)顯著增加，另外IFN-γ和脂多糖(lipopolysacch-arides，LPS)也可誘導(dǎo)IDO表達(dá)[2,3]。雌激素是一種性激素，對(duì)生殖發(fā)育至關(guān)重要，主要有三種類型：雌酮、雌二醇、雌三醇。當(dāng)雌二醇水平逐漸升高約100倍時(shí)，雌三醇水平從早期妊娠到晚期妊娠增加約1 000倍，產(chǎn)后則急劇下降[4]。在懷孕期間，胎盤細(xì)胞產(chǎn)生性激素，特別是雌激素。雌激素在免疫系統(tǒng)中也有作用，但其機(jī)制尚不完全清楚。雌激素主要通過(guò)影響胸腺的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及細(xì)胞因子表達(dá)而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，此外雌激素還可促使自身免疫性B細(xì)胞增多而克服免疫耐受，通過(guò)改變細(xì)胞因子來(lái)誘導(dǎo)B細(xì)胞活化，降低B細(xì)胞凋亡。由于Th1型細(xì)胞因子參與急性同種移植排斥反應(yīng)，Th2型細(xì)胞因子參與免疫耐受。傳統(tǒng)理論認(rèn)為母胎界面中Th1/Th2的平衡向Th2偏倚有利于母胎免疫耐受，向Th1偏倚與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等密切相關(guān)。近年的研究表明，胚胎植入部位有包括IFN-γ在內(nèi)的高水平的Th1型細(xì)胞因子[5,6]，而妊娠期有一個(gè)非常顯著的特征是胎盤組織通過(guò)產(chǎn)生大量的IDO來(lái)維持母胎耐受。在免疫微環(huán)境中，早期IDO的表達(dá)可能與IFN-γ有關(guān)，而晚期可能與TGF-β有關(guān)[7]。由于Th1型細(xì)胞因子參與急性同種移植排斥反應(yīng)，Th2型細(xì)胞因子參與免疫耐受。傳統(tǒng)理論認(rèn)為母胎界面中Th1/Th2的平衡向Th2偏倚有利于母胎免疫耐受，向Th1偏倚與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等密切相關(guān)[8-13]。本文分析早孕絨毛和脫膜組織中IFN-γ上調(diào)IDO表達(dá)的可能性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本 選擇2015年10月至2017年6月，在貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的接受人工流產(chǎn)治療的孕6～9周正常妊娠婦女38例及人工流產(chǎn)獲得的絨毛及蛻膜組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：健康正常妊娠婦女；妊娠6～9周；妊娠期間未接受過(guò)藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并全身性疾病者；接受稽留流產(chǎn)或孕酮和米非司酮人流前處理者。研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且患者均簽署知情同意書(shū)。

1.1.2主要試劑 細(xì)胞裂解緩沖液(RIPA)(BL502A)和蛋白酶抑制劑(P8340)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；一抗和二抗去除液(HCY055)、三羥甲基氨基甲烷-甘氨酸電泳液粉劑(56-40-6)及BCA-100蛋白定量試劑盒(P0012)均購(gòu)自碧云天公司(877-616-CELL2355)、(D3H2)XP?Rabbit mAb、10×TBST(T1081)、IFN-γ(877-616-cell 2355)和兔抗IDO抗體均(86630)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；PVDF膜(IPVH00010PCRE)、ECL試劑(c_311032402_10)和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(M_25420100_10)均購(gòu)自PerkinElmer公司；預(yù)染蛋白相對(duì)分子質(zhì)量Marker(BL706A)和5×SDS-PACE蛋白上樣緩沖液(BL502A)均購(gòu)自美國(guó)Biosharp公司；兔抗GAPDH抗體(A01020美國(guó)Gnne Tex公司)；SDS-PACE制備試劑盒(325OGR500)(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1IFN-γ和IDO在早孕絨毛及蛻膜中的表達(dá) 用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌早孕絨毛和蛻膜殘留的紅細(xì)胞，取絨毛和蛻膜組織各100 mg，置于研缽并加入適量液氮，碾碎組織成粉末，加入蛋白酶抑制劑的裂解液充分裂解，置于4℃離心機(jī)，3 000 r/min離心30 min，取上清并采用BCA檢測(cè)蛋白濃度。加緩沖液煮沸變性，將變性的樣本加入聚丙烯酰胺凝膠中電泳，轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，封閉，孵育一抗，4℃過(guò)夜，洗膜加二抗，孵育1 h，ECL顯影，圖片瀏覽軟件(Imagel J)處理圖片，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，IFN-γ和IDO的表達(dá)采用目的蛋白條帶與內(nèi)參吸光度值的比值表示(標(biāo)準(zhǔn)：Western blot實(shí)驗(yàn)得到的目的蛋白灰度值，除以GAPDH內(nèi)參灰度值得到的目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量)。

1.2.2Western blot檢測(cè)不同濃度IFN-γ培養(yǎng)對(duì)IDO蛋白表達(dá)的影響 無(wú)菌收集絨毛和蛻膜組織后，立即放入0.1 m無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline pH7.2，PBS pH7.2)中且15 min內(nèi)在盒內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，然后用PBS洗滌去除紅細(xì)胞。在Western blot分析前，將組織標(biāo)本保存在-80℃處，或切成小塊(濕重≤1 mg)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)樣品在收集后40 min內(nèi)進(jìn)行處理。將小塊絨毛和蛻膜用F-12/DMEM(21041025加拿大Invitrogen公司)沖洗2次，離心5 min后，在培養(yǎng)基中加入10%FBS(10100147吉布科；澳大利亞)和1%青霉素，在37℃溫箱(美國(guó)Thermo公司)與5% CO2共同孵育。給予不同濃度的IFN-γ(1、10、100 ng/ml)分別以48 h、72 h培養(yǎng)胚胎絨毛組織與蛻膜組織，對(duì)照組用PBS水替代，Western blot檢測(cè)IDO在兩種組織中的表達(dá)情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，t檢驗(yàn)和雙變量的直線相關(guān)性分析IFN-γ和IDO在早孕絨毛及蛻膜組織中的表達(dá)等計(jì)量資料，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1IFN-γ、IDO在早孕絨毛及蛻膜組織中的表達(dá)及相關(guān)性 Western blot檢測(cè)顯示早孕絨毛組織和蛻膜組織中(圖1A)均可見(jiàn)分子量為46 kD和17 kD的蛋白條帶，與人的IDO和IFN-γ蛋白分子量大小一致，提示絨毛和蛻膜中均有IDO和IFN-γ的表達(dá)。分別對(duì)IDO、IFN-γ在兩種組織中的表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，IDO與IFN-γ蛋白在絨毛組織中呈正相關(guān)表達(dá)，如圖1B所示(r=0.987 1，P<0.05)；IDO與IFN-γ蛋白在脫膜組織中呈正相關(guān)表達(dá)，如圖1C所示(r=0.979 1，P<0.05)。分別以IDO、IFN-γ在絨毛組織與蛻膜組織中的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，如圖2，結(jié)果顯示，IDO在蛻膜組織中的表達(dá)高于在絨毛組織中的表達(dá)(P=0.002)；IFN-γ在蛻膜組織中的表達(dá)同樣高于在絨毛組織中的表達(dá)(P=0.001)。圖3為各數(shù)據(jù)匯總統(tǒng)計(jì)分析圖。

2.2IFN-γ誘導(dǎo)絨毛和蛻膜中IDO的表達(dá) 通過(guò)IFN-γ誘導(dǎo)絨毛和蛻膜中IDO的表達(dá)，以確定IFN-γ是否能影響IDO的表達(dá)。將絨毛和蛻膜分別切成小塊，孵育6 h，然后加入不同濃度(1、10、100 ng/ml)的IFN-γ，培養(yǎng)48 h和72 h后分別進(jìn)行Westren blot分析，以檢測(cè)IDO的表達(dá)。根據(jù)IDO、IFN-γ擴(kuò)增帶灰度值與GAPDH帶灰度值的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)為平均值±Se,相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次后選取1例為文章示例圖。圖2、3表示在IFN-γ濃度分別為1、10、100 ng/ml時(shí)，對(duì)絨毛組織孵育48、72 h時(shí)， IDO表達(dá)情況與不同IFN-γ濃度之間的關(guān)系，P值分別為0.048、0.036，r值分別為0.952 1，0.964 1；圖4、5為IFN-γ濃度分別為1、10、100 ng/ml時(shí)，對(duì)蛻膜組織孵育48、72 h時(shí)，IDO表達(dá)情況與不同IFN-γ濃度之間的關(guān)系，P值分別為0.036、0.034，r值分別為0.964 1、0.966 4。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的絨毛和蛻膜組織中加入IFN-γ培養(yǎng)48 h及72 h后，IDO蛋白有較高表達(dá)，均高于對(duì)照組，且隨著IFN-γ濃度的升高而增加(圖2～5)。由此可知，IFN-γ可上調(diào)母胎界面中IDO的表達(dá)來(lái)維持免疫耐受。

圖1 IDO與IFN-γ在絨毛、蛻膜組織中的表達(dá)Fig.1 IDO and IFN-γ expression in chorionic villi and deciduaNote:Samples of Numbers 1-8.***.P<0.001,**.P<0.01,*.P<0.05.

圖2 絨毛組織中不同IFN-γ濃度48 h IDO的表達(dá)情況Fig.2 Expression of IDO with IFN-γ added in cultured chorionic villi for 48 h

圖3 絨毛組織中不同IFN-γ濃度72 h IDO的表達(dá)情況Fig.3 Expression of IDO with IFN-γ added in cultured chorionic villi for 72 h

圖4 蛻膜組織中不同IFN-γ濃度48 h IDO的表達(dá)情況Fig.4 Expression of IDO with IFN-γ added in cultured decidua for 48 h

圖5 蛻膜組織中不同IFN-γ濃度72 h IDO的表達(dá)情況Fig.5 Expression of IDO with IFN-γ added in cultured decidua for 72 h

3 討論

本研究結(jié)果表明，在早孕絨毛和蛻膜組織中，IFN-γ和IDO的表達(dá)均呈正相關(guān)，提示在該組織中，IFN-γ上調(diào)IDO的可能性較大； 在培養(yǎng)的早孕絨毛和蛻膜組織中加入不同濃度的IFN-γ，發(fā)現(xiàn)所加入的IFN-γ的濃度與IDO的表達(dá)均呈正相關(guān)，揭示在早孕絨毛和蛻膜組織中，IFN-γ上調(diào)IDO的表達(dá)。Kudo等[14]曾報(bào)道在培養(yǎng)的人胎盤絨毛組織中加入不同濃度的IFN-γ，發(fā)現(xiàn)所加入的IFN-γ的濃度與IDO mRNA的表達(dá)呈劑量依賴關(guān)系，但該文的研究?jī)H限于mRNA水平，且僅限于細(xì)胞培養(yǎng)(只研究培養(yǎng)的胎盤絨毛，未研究蛻膜組織)，并沒(méi)有報(bào)道未培養(yǎng)的早孕絨毛和蛻膜組織中IFN-γ和IDO的表達(dá)的關(guān)系。我們?cè)贙udo 等報(bào)道的基礎(chǔ)上做了進(jìn)一步的研究。本研究結(jié)果表明，不僅僅是絨毛組織，蛻膜組織亦可通過(guò)IFN-γ上調(diào)IDO的表達(dá)來(lái)致免疫耐受。

IFN-γ誘導(dǎo)的一氧化氮敏感性效應(yīng)機(jī)制有可能是誘導(dǎo)IDO的作用機(jī)制之一[15，16]。IFN-γ的抗衣原體活性超越色氨酸耗竭，包括干擾細(xì)胞能量代謝，導(dǎo)致后代減少，但也降低了細(xì)胞的抗菌敏感性[17]。IFN-γ通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1的激活，顯著增加IDO的表達(dá)[18]。IFN-γ能顯著激活角質(zhì)形成細(xì)胞的IDO表達(dá)，而非成纖維細(xì)胞[19]。Sakural等[20]發(fā)現(xiàn)IFN-γ在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎發(fā)病的臨床前期達(dá)到高峰，緩解期降低。而IDO的升高在時(shí)相上正好在IFN-γ之后。IFN-γ誘導(dǎo)IDO表達(dá)的特點(diǎn)是表達(dá)強(qiáng)度較高及表達(dá)持續(xù)的時(shí)間較為短暫。因而，IFN-γ誘導(dǎo)IDO的表達(dá)有助于宿主限制微生物的生長(zhǎng)及預(yù)防急性炎癥對(duì)宿主潛在的損害，但I(xiàn)FN-γ誘導(dǎo)IDO表達(dá)的特點(diǎn)不能解釋IDO在體內(nèi)的長(zhǎng)期效應(yīng)，即維持包括妊娠和自身耐受等免疫穩(wěn)態(tài)[2]。

眾所周知，母胎界面有Th1 型細(xì)胞因子和Th2 型細(xì)胞因子。Th1 型細(xì)胞因子包括IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-2及IL-12。Th2型細(xì)胞因子，包括IL-4、IL-5、IL-6 及IL-10。正常情況下,母胎界面的細(xì)胞因子向Th2 型偏倚，即母胎界面Th2 型細(xì)胞因子較Th1 型細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì)[21]。傳統(tǒng)認(rèn)為，受孕后，母體對(duì)胎兒的識(shí)別及妊娠的維持是通過(guò)占優(yōu)勢(shì)的Th2 型細(xì)胞因子來(lái)實(shí)現(xiàn)的，母胎界面的Th2 型細(xì)胞因子是維持同種異體耐受的核心，Th2 型偏倚的重要意義在于維持妊娠和抑制母體和胎兒之間的排斥反應(yīng)，即維持母胎耐受[22，23]。我們的研究結(jié)果提示，Th1 型細(xì)胞因子(IFN-γ)亦可通過(guò)調(diào)節(jié)IDO的表達(dá)致母胎耐受，從而保護(hù)胎兒免受母體的排斥。因而，本研究進(jìn)一步完善了母胎耐受的機(jī)制。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)早孕絨毛和蛻膜組織中IFN-γ和IDO的表達(dá)呈正相關(guān)，并在體外培養(yǎng)的該組織中發(fā)現(xiàn)IFN-γ可上調(diào)IDO的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，在早孕母胎界面IFN-γ可通過(guò)上調(diào)IDO的表達(dá)來(lái)致母胎耐受。