端粒和端粒酶調(diào)控植物生長發(fā)育的研究進(jìn)展

劉立盤,鐘永達(dá),楊愛紅,陳彩慧,李彥強(qiáng),余發(fā)新

(江西省科學(xué)院生物資源研究所江西省觀賞植物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國江西南昌330096)

端粒是位于線性真核生物染色體末端的特殊染色質(zhì)結(jié)構(gòu),是由重復(fù)DNA序列和蛋白質(zhì)組成的復(fù)雜核蛋白結(jié)構(gòu)[1]。端粒相關(guān)蛋白質(zhì)可以通過調(diào)控端粒酶的通路或調(diào)節(jié)DNA復(fù)制機(jī)制來控制端粒長度。端粒DNA分為雙鏈DNA(double-stranded DNA,dsDNA)和單鏈DNA(single-stranded DNA,ssDNA),與蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合形成端粒蛋白復(fù)合體(shelterin),該復(fù)合體主要由TRF1/2(telomeric repeat binding factor 1/2)、POT1(protection of telomeres 1)、TIN2(TRF1-interacting nuclear protein 2)、RAP1(repressor activator protein 1)以及 TPP1(telomere binding protein POT1-interacting protein 1)構(gòu)成[2]。TRF1、TRF2和特異性端粒dsDNA的連接通過Myb(v-myb avian myeloblastosis viral onco-gene homolog)結(jié)構(gòu)域的LKDKWRT氨基酸基序介導(dǎo)[3]。DNA-TRF1、TRF2和ssDNA結(jié)合蛋白POT1之間的連接通過TIN2和TPP1蛋白的寡糖/寡核苷酸介導(dǎo)[4]。RAP1蛋白是端粒蛋白復(fù)合體的最后一個(gè)組成部分,它與TRF2相互作用,并控制端粒DNA長度[5]。

二十多年前,Riha等[6]報(bào)道了一種基于Southern blotting技術(shù)測量端粒長度的末端限制性片段(terminal restriction fragment,TRF)方法。此后,其他測量端粒長度的方法相繼被報(bào)道,包括定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative PCR,qPCR)、定量熒光原位雜交(quantitative fluorescence in situ hybridization,Q-FISH)、流式-熒光原位雜交(flow cytometry-fluorescence in situ hybridization,Flow-FISH)及單鏈端粒長度分析(single telomere length analysis,STELA)[7～8]。其中,TRF 方法可提供端粒的絕對(duì)長度和異質(zhì)性數(shù)據(jù),仍然被認(rèn)為是測量端粒長度的金標(biāo)準(zhǔn)[9]。端粒酶活性的檢測有直接和間接兩種方法,直接檢測方法包括:端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(telomeric repeat amplication protocol,TRAP)、TRAP-銀染法、TRAP-酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)和雜交鏈?zhǔn)叫盘?hào)放大反應(yīng)結(jié)合磁分離技術(shù)法；間接檢測方法包括:亞甲藍(lán)(methylene blue,MB)作為G-四聯(lián)體結(jié)合探針法、石墨烯雜化比色法和依賴無標(biāo)記分子信標(biāo)的級(jí)聯(lián)放大DNA機(jī)制法。其中,TRAP法比較靈敏、迅速且重復(fù)性好,應(yīng)用最廣[10]。本文將對(duì)端粒、端粒酶及其相關(guān)基因在植物中的調(diào)控研究進(jìn)展進(jìn)行闡述,為端粒的進(jìn)一步研究提供參考。

1 端粒的結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)

端粒具有重要的生物學(xué)功能,它可以防止染色體的降解和融合,以及DNA復(fù)制過程中末端序列的丟失[11～12]。幾乎所有高等植物的端粒都是由七核苷酸擬南芥(Arabidopsis thaliana)端粒重復(fù)序列(TTTAGGG)n組成[13～14]。但是天門冬目(Asparagales)中的幾個(gè)單子葉植物含有6個(gè)人類端粒重復(fù)序列(TTAGGG)n[14]。近期研究顯示,植物中的端粒序列存在多樣性。Tran等[15]報(bào)道,螺旋貍藻屬(Genlisea)的一些物種存在兩種混合變異序列(TTCAGG和TTCAGG),這種變異是由種內(nèi)進(jìn)化產(chǎn)生的。此外,人們?cè)诿o夜香樹(Cestrum elegans)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特異的端粒序列(TTTTTTAGGG)[16]。Fajkus等[17]發(fā)現(xiàn)在蔥屬(Allium spp.)中也存在一個(gè)獨(dú)特的端粒序列(CTCGGTTATGGG)。在整個(gè)植物家族,除了陸地植物,還包括紅藻(Rhodophyta)、綠藻(Chlorophyta)和灰藻(Glaucophytes)等藻類及其他低等生物,它們都存在著不同的端粒重復(fù)序列類型。

1988年,端粒序列在擬南芥中首次成功克隆[18]。受遺傳和發(fā)育兩方面的控制,端粒長度會(huì)在一定范圍內(nèi)變化。目前在植物中發(fā)現(xiàn),端粒DNA在小立碗蘚(Physcomitrella patens)中的最短長度可至500 bp[19],在煙草(Nicotiana tabacum)中的長度可為160 kb[20],而且在美花煙草(Nicotiana sylvestris)中的長度可達(dá)200 kb[21]。植物端粒長度在不同屬或種之間存在顯著差異,在物種發(fā)育或生態(tài)型水平上也存在差異,例如:擬南芥的端粒長度根據(jù)不同的生態(tài)型從2 kb到9 kb不等[22]；在灰葉劍麻(Agave fourcroydes Lem)和韋伯龍舌蘭(A-gave tequilana Weber)莖段組織培養(yǎng)過程中,端粒長度的變化范圍分別為22.8～50.8 kb和27.8～37.8 kb[23]。另外,在長壽樹種歐洲白樺(Betula pendula Roth)中,不同基因型的端粒長度最短變化范圍為 5.9～9.6 kb,最長變化范圍為 15.3～22.8 kb[24]。

2 端粒酶的結(jié)構(gòu)

端粒酶是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶,對(duì)端粒的延長和維持起著重要的催化作用[25]。端粒酶能以自身的RNA亞基作為模版,在端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)的作用下在端粒的3′端添加串聯(lián)的七核苷酸重復(fù)序列以保持染色體的穩(wěn)定性[26]。

端粒酶由線性染色體3′末端的核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)組成[27],具有端粒酶RNA(telomerase RNA,TER)和TERT兩個(gè)核心亞基。TER由1個(gè)單一的長鏈非編碼RNA序列組成。TERT亞基在進(jìn)化中形成了保守的一級(jí)結(jié)構(gòu),在大多數(shù)生物體中可進(jìn)一步分為N-末端域(telomerase essential N-terminal,TEN)、TR結(jié)合域(TR binding domain,TRBD)、中心逆轉(zhuǎn)錄酶域(reverse transcriptase,RT)和C-末端延長域(C-terminal extension,CTE)[28～29]。端粒酶在各個(gè)亞單位的協(xié)作下精確調(diào)控端粒的延長和縮短過程。從分子水平看,端粒長度的保持主要通過端粒酶修復(fù)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)[30]。端粒酶能夠延長端粒序列和拉長染色體末端端粒長度,可以補(bǔ)償端粒在染色體復(fù)制過程中所產(chǎn)生的持續(xù)性丟失,起著維護(hù)染色體穩(wěn)定性的作用[2,31]。

3 植物生長發(fā)育過程中端粒長度和端粒酶活性的變化

在林木中,端粒及端粒酶對(duì)銀杏(Ginkgo biloba L.)發(fā)育和衰老的調(diào)控研究報(bào)道較多。Liu等[32]指出銀杏葉片隨著樹齡的增加,其端粒長度增加趨勢明顯,而且不同銀杏組織端粒長度的順序?yàn)?小樹枝＞葉片＞胚愈傷組織＞小孢子。該研究還建立了端粒長度與樹齡相關(guān)性的理論模型,結(jié)果表明長壽銀杏的端粒長度可以在營養(yǎng)生長期間有效地保持?jǐn)?shù)千年。另有研究報(bào)道,從胚到幼苗的不同發(fā)育階段,銀杏的端粒長度呈現(xiàn)周期性變化[33]。相關(guān)研究顯示,銀杏4個(gè)樹齡(10、20、70±10和700±100)的端粒長度從4月到8月沒有明顯變化(P＞0.05),但從9月到10月顯著下降(P＜0.05)[34],說明銀杏端粒長度的變化與季節(jié)相關(guān)。進(jìn)一步對(duì)銀杏的端粒酶展開研究發(fā)現(xiàn),隨著樹齡(10～700年)的增加,葉片端粒酶活性呈下降的趨勢[35～36]；銀杏不同組織(胚性愈傷組織、小孢子和葉片)的端粒酶活性存在差異,其中胚性愈傷組織的端粒酶活性最高；在全年生長周期中,端粒酶活性在4月最高,表明銀杏的端粒酶活性也具有季節(jié)性變化[36]。此外,研究人員在刺果松(Pinus longaeva)中也發(fā)現(xiàn)了端粒長度與樹齡的相關(guān)性。研究顯示,2 000～5 000年樹齡的刺果松根系的端粒長度比400～500年和100～200年的都要長,表明端粒長度和端粒酶活性與刺果松樹齡有著直接或間接的關(guān)系[26]。近年來,其他樹種的端粒長度和端粒酶活性與季節(jié)變化的關(guān)系也有報(bào)道。例如:油松 (Pinus tabulaeformis Carr.)端粒長度的變化與月平均溫度的變化趨勢相似(正相關(guān)),而端粒酶活性的變化與月平均溫度的變化趨勢相反(負(fù)相關(guān)),因此,油松的端粒長度和端粒酶活性隨季節(jié)性變化而變化[37]；青梣(Fraxi-nus pennsylvanica Mars.var.subintegerrima[Vahl.]Fern.)和旱柳(Salix matsudana Koidz.)的端粒長度、端粒酶活性也與季節(jié)的變化相關(guān),但端粒長度和端粒酶活性的變化沒有相關(guān)性[38]。

在植物生長發(fā)育過程中,端粒的伸長和縮短與細(xì)胞復(fù)制、分化及再生有關(guān)。研究人員對(duì)0～200年樹齡的歐洲赤松(Pinus sylvestris L.)的不同組織(未成熟的胚胎、形成層、芽和成熟樹木的針葉)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)端粒長度隨著組織分化程度的增加而縮短,其中未成熟胚胎的端粒長度最長；同時(shí),該研究發(fā)現(xiàn)端粒長度與組織的位置相關(guān),在老樹(50～200歲)中,莖形成層的端粒長度隨高度的增加而縮短[39]。另外,不同樹齡、同一植物不同組織以及不同分化程度的相同組織的端粒長度都可能存在差異[40]。相關(guān)研究指出2～8年人參(Panax ginseng C.A.Meyer)主根的端粒長度與年齡呈正相關(guān)關(guān)系[41]。一項(xiàng)早期研究表明,大麥(Hordeum vulgare L.)的端粒長度在整個(gè)植株發(fā)育過程中逐漸變短,成年葉片的端粒長度由幼胚中的80 kb縮減到30 kb,但在愈傷組織培養(yǎng)過程中變長[42]。與此類似,Rescalvo-Morales等[23]研究發(fā)現(xiàn)灰葉劍麻和韋伯龍舌蘭兩個(gè)品種的莖段組織在體外誘導(dǎo)生長(0～8個(gè)星期)時(shí),其端粒長度呈逐漸伸長的趨勢。

近年來,擬南芥及農(nóng)作物的端粒長度和端粒酶活性研究相繼被報(bào)道。擬南芥不同組織在不同發(fā)育階段的端粒長度無明顯變化,說明端粒長度不參與擬南芥衰老過程中的細(xì)胞分化和復(fù)制,也不參與有絲分裂[43]。在番茄(Solanum lycopersicum)植株4周至6個(gè)月的衰老過程中,研究者未觀察到葉片端粒長度的變化[44]。女婁菜(Melandrium album)不同組織和發(fā)育階段的端粒長度保持穩(wěn)定,端粒酶活性在萌發(fā)的幼苗和根尖中最高,而在葉片中下降了99%；在休眠的種子中沒有檢測到端粒酶活性,而在成熟的花粉粒中檢測到了端粒酶活性[6]。煙草葉片愈傷組織在脫分化和再分化過程中其端粒長度沒有顯著變化,但明顯高于葉片外植體[45]。在大麥中,胚、花藥和心皮組織的端粒酶活性較高,但是端粒酶的活性在胚胎發(fā)育過程中逐漸下降[46～47]。另外,在大豆(Glycine max)、菜花(Brassica oleracea)和胡蘿卜(Daucus carota)的懸浮培養(yǎng)組織中端粒酶活性較高,但在成熟的分化組織中端粒酶活性較低[48],表明端粒酶活性在分化能力強(qiáng)的細(xì)胞和組織中較高。

4 端粒長度及端粒酶相關(guān)基因的研究

端粒酶具有維持端粒穩(wěn)定性的功能,對(duì)端粒長度的調(diào)控具有重要的作用。在基因調(diào)控中,TERT參與了端粒DNA合成、維持端粒長度及賦予細(xì)胞無限增殖能力等途徑。煙草TERT基因的變異序列TERT_Ct和TERT_Cs在幼苗、根、花芽及葉片中均高水平表達(dá),而TERT_D的表達(dá)水平則較低[49]。擬南芥端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(AtTERT)編碼的蛋白質(zhì)含有保守的逆轉(zhuǎn)錄酶和端粒酶特異性基序,研究報(bào)道,該基因在擬南芥愈傷組織中高表達(dá),在缺乏AtTERT基因的情況下,每一代端粒長度會(huì)縮短500 bp[50]。另外,擬南芥AtTERT基因的TDNA突變體會(huì)導(dǎo)致每代端粒DNA逐漸縮短250～500 bp,在第5代以后,植物發(fā)生器官和分生組織開始畸形,最終停止生長[51]。這意味著端粒酶基因?qū)χ参锏陌l(fā)育是必不可少的。從沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)克隆到的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(AmTERT)在根和葉中表達(dá)較高,同時(shí)鹽、干旱、熱及低溫脅迫均能導(dǎo)致沙冬青幼苗根和葉中Am-TERT的表達(dá)量升高,說明AmTERT基因具有應(yīng)激保護(hù)功能[52]。

端粒結(jié)合蛋白(telomere binding protein,TBP)可以通過結(jié)合到端粒上阻礙端粒酶發(fā)揮調(diào)控端粒長度的功能。擬南芥端粒結(jié)合蛋白基因(AtTBP1)可以與植物端粒重復(fù)序列TTTAGGG特異性結(jié)合,研究顯示其在基因組中以單拷貝形式存在,并在各個(gè)組織中均有表達(dá),推測可能在端粒功能調(diào)控中發(fā)揮重要作用[53]。相關(guān)研究報(bào)道,水稻端粒結(jié)合蛋白基因(RTBP1)負(fù)調(diào)控端粒長度,敲除RTBP1后,水稻突變體的端粒長度明顯長于野生型,但4代以后植株的生長發(fā)育受到嚴(yán)重干擾,細(xì)胞分裂后期染色體融合頻率增加[54]。

Ku80基因在最近的研究報(bào)道中都涉及到端粒長度的調(diào)控。在擬南芥和大麥中,Ku80基因具有調(diào)控端粒長度的功能,AtKu80和HvKu80突變體的端粒長度相對(duì)于野生型植株都顯著伸長[55～56]。在水稻中,RNAi介導(dǎo)的基因敲除植株(Ubi:RNAi-OsKu80)與野生型水稻相比,在萌發(fā)后期表現(xiàn)為生長遲緩及端粒長度明顯增加,說明OsKu80在水稻植株的生長發(fā)育和端粒長度調(diào)控中發(fā)揮重要作用[57]。DNA甲基化(DNA methylation)在調(diào)控端?；虮磉_(dá)中也發(fā)揮著重要的作用。研究人員發(fā)現(xiàn)擬南芥缺乏DDM1(deficient in DNA methylation 1)后在G1～G5代可以實(shí)現(xiàn)自我繁殖,同時(shí)端粒長度保持穩(wěn)定,但在第6代(G6)開始出現(xiàn)不育,端粒長度急劇縮短[58]。

端粒及端粒酶在眾多基因調(diào)控下共同參與和控制植物生長發(fā)育進(jìn)程。把水稻中的OsTRFL1(Oryza sativa TRF like 1)基因敲除后,突變體的端粒長度相對(duì)于野生型的5～12 kb伸長到6～25 kb,說明OsTRFL1負(fù)調(diào)控端粒長度；同時(shí),該研究發(fā)現(xiàn)OsTRFL1基因表達(dá)水平的降低會(huì)導(dǎo)致水稻營養(yǎng)和生殖器官發(fā)育嚴(yán)重不足[59]。苔蘚植物小立碗蘚原絲體在培養(yǎng)過程中的端粒長度比較穩(wěn)定,而相對(duì)端粒酶活性則在培養(yǎng)1～3 d時(shí)呈急劇下降的趨勢。另外,與野生型相比,mre11、rad50、nbs1、ku70和lig4突變體的端粒長度都有改變,說明這5個(gè)基因都參與了端粒長度的調(diào)控[19]。

5 端粒在植物衰老過程中的作用

衰老是植物生長發(fā)育中出現(xiàn)的不可逆的生長和停滯現(xiàn)象,是生物體DNA、蛋白質(zhì)和其他大分子隨機(jī)損傷不斷累積的過程[60]。衰老最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡,其特征是細(xì)胞增殖不可逆,基因表達(dá)模式改變,細(xì)胞凋亡抗性增加,特異性細(xì)胞功能改變,并伴隨端?？s短[26]。

端粒的變短導(dǎo)致DNA損傷信號(hào)啟動(dòng),從而引起細(xì)胞衰老[61]。染色體由于末端復(fù)制導(dǎo)致端粒在每一輪細(xì)胞復(fù)制中會(huì)相應(yīng)縮短,而端粒長度縮短會(huì)觸發(fā)細(xì)胞衰老[62],進(jìn)而會(huì)引起氧化性損傷、基因的過度表達(dá)、染色質(zhì)改變和DNA損傷等應(yīng)激反應(yīng)[25]。端粒可以作為一個(gè)“生物時(shí)鐘”反映細(xì)胞的分裂次數(shù),決定細(xì)胞衰老和死亡發(fā)生的時(shí)間[25]。因此,端粒被認(rèn)為是衰老的生物標(biāo)記之一。

染色體DNA在復(fù)制過程中往往伴隨著端粒磨損,異常的端粒結(jié)構(gòu)將進(jìn)一步提高端粒磨損發(fā)生的速率,進(jìn)而導(dǎo)致端粒的穩(wěn)定性降低。細(xì)胞內(nèi)的端粒融合和雙著絲粒染色體結(jié)構(gòu)會(huì)誘導(dǎo)異常表型的形成,并觸發(fā)細(xì)胞衰老甚至凋亡的發(fā)生[63]。當(dāng)然,衰老不僅僅是端粒磨損,它的發(fā)生也是受基因控制的。真核生物染色體DNA的完整性是復(fù)制準(zhǔn)確的前提條件,其損傷和修復(fù)涉及到上百種基因和蛋白質(zhì)參與的調(diào)控[64]。因此,衰老是一個(gè)復(fù)雜的生理生化進(jìn)程。

在植物中,衰老是一個(gè)高度調(diào)控的生理過程,導(dǎo)致器官和組織細(xì)胞死亡,最顯著的表現(xiàn)是葉片衰老[65]。在一年生植物中,葉片衰老與整個(gè)植株的死亡密切相關(guān)。在多年生植物中,葉片的衰老在整個(gè)生命周期中會(huì)發(fā)生很多次,而且在一些壽命較長的樹木中,分生組織在植物的整個(gè)生命周期中不斷增殖,可能長達(dá)數(shù)千年。因此,多年生植物的分生組織細(xì)胞具有強(qiáng)大的端粒DNA修復(fù)和基因組維持機(jī)制[60]。

6 結(jié)語與展望

染色體的末端由端粒DNA重復(fù)序列及其蛋白質(zhì)組成,端粒與染色體末端融合和基因缺失存在著密切關(guān)系,是保持基因組穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素,是生物體生長發(fā)育和分化的必需因子[66]。端粒酶廣泛存在于真核生物中,維持著生長發(fā)育過程中端粒長度的變化,目前在原生動(dòng)物、酵母、兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物中都能檢測到其活性。

近年來,針對(duì)端粒、端粒酶及其結(jié)構(gòu)的功能研究相繼被報(bào)道,它們?cè)谏L發(fā)育和細(xì)胞分裂上的調(diào)控作用逐漸被揭示。端粒的變化和調(diào)控受多種因素影響,包括表觀遺傳、植物激素和DNA甲基化等,其中甲基化是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的重要方式,對(duì)染色體端粒的完整性起著重要的調(diào)控作用[67～68]。擬南芥中的相關(guān)研究表明,胞嘧啶甲基化對(duì)端粒長度的維持是至關(guān)重要的,甲基化突變體后代的端粒長度顯著縮短[69]。盡管在植物中端粒長度、端粒酶活性的變化及相關(guān)基因的功能研究陸續(xù)被報(bào)道,但是影響植物端粒復(fù)制、端粒長度和端粒酶活性的因素還有待進(jìn)一步研究,另外端粒及端粒酶的功能還涉及大量蛋白質(zhì)的參與,對(duì)其功能和調(diào)控的研究將是今后重點(diǎn)方向之一。