抗生素、重金屬和殺生劑抗性共選擇機(jī)制

陳帥，鄒海燕，高方舟，吳黛靈，張敏，何良英,*，應(yīng)光國(guó)

1. 華南師范大學(xué)環(huán)境研究院，廣東省化學(xué)品污染與環(huán)境安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&環(huán)境理論化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006 2. 華南師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，廣州 510006

抗生素是由真菌、細(xì)菌或其他生物在繁殖過(guò)程中所產(chǎn)生的一類具有殺滅或抑制微生物生長(zhǎng)作用的物質(zhì)[1]?？股匾蚱淇梢杂行ьA(yù)防和治療由細(xì)菌導(dǎo)致的疾病問(wèn)題而得到大量的使用，近年來(lái)臨床與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中抗生素濫用與隨之產(chǎn)生的抗性問(wèn)題受到廣泛關(guān)注[2-5]。據(jù)調(diào)查，我國(guó)2013年抗生素總產(chǎn)量估計(jì)為24.8萬(wàn)噸，總使用量約為16.2萬(wàn)噸，獸用抗生素的消費(fèi)量占比從2007年的46%增加到2013年的52%[6]。當(dāng)前抗生素抗性已成為全球公共健康領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)，也是世界各國(guó)政府和社會(huì)廣泛關(guān)注的問(wèn)題[7-8]。為了應(yīng)對(duì)抗生素抗性帶來(lái)的挑戰(zhàn)，我國(guó)發(fā)布了《遏制細(xì)菌耐藥國(guó)家行動(dòng)計(jì)劃(2016～2020年)》。

細(xì)菌抗性的形成機(jī)制及其選擇壓力是遏制細(xì)菌耐藥的關(guān)鍵之一，也是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。對(duì)環(huán)境中抗生素殘留和細(xì)菌抗生素抗性的研究發(fā)現(xiàn)，二者之間存在著較強(qiáng)的相關(guān)性，從各種途徑排入到水環(huán)境中的抗生素改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，提高了總體的抗性水平，抗生素成為導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的重要選擇壓力[9]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌產(chǎn)生抗生素抗性主要機(jī)制有外排泵系統(tǒng)、膜通透性改變、改變靶標(biāo)點(diǎn)、酶修飾及降解作用以及產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)改變生理特性作用，其中關(guān)于外排泵系統(tǒng)的研究較為豐富，并且值得注意的是，抗生素抗性的選擇壓力不止來(lái)源于抗生素本身，其他化學(xué)物質(zhì)如金屬和殺生劑也參與了抗生素抗性的共同選擇[10-12]。殺生劑是一類無(wú)機(jī)或合成有機(jī)分子，用于對(duì)物體和表面進(jìn)行消毒或滅菌，并保護(hù)材料或工藝不受微生物降解，如抗真菌劑、驅(qū)蟲劑、尼泊金酯類防腐劑和消毒劑等。一般認(rèn)為，殺生劑的作用機(jī)制主要為氧化作用、親電體作用和溶解細(xì)胞膜[13]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌對(duì)抗生素和殺生劑具有相似的抗性機(jī)制，其中外排泵機(jī)制最為重要[14-22]。此外，重金屬在環(huán)境中難以降解且容易發(fā)生富集而長(zhǎng)期穩(wěn)定存在，可對(duì)細(xì)菌群落對(duì)藥物的抗性產(chǎn)生持續(xù)選擇壓力[12]。細(xì)菌對(duì)重金屬抗性機(jī)制主要包括外排泵系統(tǒng)、金屬螯合與生物轉(zhuǎn)化作用[23-25]。越來(lái)越多的研究證明，細(xì)菌不但可以單獨(dú)對(duì)某一種藥物產(chǎn)生抗性，也可以通過(guò)協(xié)同抗性、交叉抗性和共調(diào)控抗性等多種機(jī)制產(chǎn)生多重抗性[26-28]。由此可見，細(xì)菌抗性的研究不僅要關(guān)注抗生素的使用和抗生素的直接選擇壓力，也要考慮多種物質(zhì)共同作用機(jī)制。

抗生素的大量使用促進(jìn)了細(xì)菌抗性的產(chǎn)生，然而環(huán)境中不止殘留著大量抗生素，也存在著大量重金屬和殺生劑等可進(jìn)一步影響細(xì)菌抗性的物質(zhì)。因此，研究細(xì)菌產(chǎn)生抗生素抗性的機(jī)制以及各種化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)菌抗生素抗性的作用顯得尤為重要。本文闡述了細(xì)菌對(duì)抗生素、重金屬和殺生劑的抗性機(jī)制，以及多種選擇壓力的共同抗性研究進(jìn)展，旨在綜述多重抗性共選擇的研究現(xiàn)狀，剖析細(xì)菌產(chǎn)生抗性的機(jī)制，為抗生素抗性研究探討新思路和新方法。

1 環(huán)境中的選擇壓力及其抗性機(jī)制(Chemical selection pressure in the environment and resistance mechanism)

我國(guó)是抗生素生產(chǎn)和使用大國(guó)，環(huán)境中抗生素含量較高，2013年我國(guó)抗生素總使用量約為16.2萬(wàn)噸，其中人用抗生素占到總量的48%，其余為獸用抗生素。其中36種常見抗生素總使用量達(dá)到9.27萬(wàn)噸，其84.3%為獸用抗生素用量，經(jīng)過(guò)人和動(dòng)物體內(nèi)代謝作用后，由糞便和尿液排泄的抗生素總量為5.4萬(wàn)噸，進(jìn)一步通過(guò)各種污水處理后，共有5.38萬(wàn)噸進(jìn)入受納環(huán)境中[6]。不止抗生素，環(huán)境中同樣存在著大量重金屬和殺生劑殘留。對(duì)珠江三角洲地區(qū)沉積物和河水中重金屬的檢測(cè)表明，大部分沉積物均受到嚴(yán)重的鎘、鉛和鋅污染；珠江水體的重金屬含量普遍在高于Ι類水標(biāo)準(zhǔn)的μg·L-1級(jí)[29-31]。三氯生和三氯卡班是常見的殺生劑，用于牙膏和洗手液等多種產(chǎn)品中，在水環(huán)境中廣泛檢出，對(duì)我國(guó)遼河、海河、黃河、珠江和東江五大河流的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在五大河流中均檢測(cè)到三氯生和三氯卡班，幾乎每條河流的地表水和沉積物中三氯生和三氯卡班的檢出率均為100%或接近100%，三氯生和三氯卡班在地表水中的濃度分別為478和338 ng·L-1，在沉積物中的濃度分別為1 329和2 723 ng·g-1[32]。環(huán)境中普遍存在的這些抗生素、殺生劑和重金屬成為誘導(dǎo)環(huán)境中細(xì)菌抗性的重要因素，導(dǎo)致細(xì)菌通過(guò)各種不同的機(jī)制對(duì)這些選擇壓力產(chǎn)生抗性。

1.1 外排泵功能

細(xì)菌抗性機(jī)制中研究較為豐富的是外排泵功能，細(xì)菌通過(guò)在細(xì)胞膜上產(chǎn)生特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，使藥物等進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部后還未發(fā)揮作用就被排放到細(xì)菌體外，從而產(chǎn)生抗性(圖1)。通過(guò)核苷酸序列分析，預(yù)測(cè)qacA基因編碼一個(gè)包含514個(gè)氨基酸的Mr55017蛋白，該蛋白具有典型的細(xì)胞膜蛋白的性質(zhì)，分析表明，這些蛋白質(zhì)的N-和C-端區(qū)分別參與能量耦合(質(zhì)子轉(zhuǎn)移)和底物運(yùn)輸，并且被證明屬于運(yùn)輸?shù)鞍准易?，通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)四環(huán)素和亞甲基霉素產(chǎn)生抗性[33]。與抗生素外排相似，金屬外排泵也使細(xì)菌擁有了金屬抗性，利用單分子超分辨成像和基因工程技術(shù)研究大腸桿菌發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中的三聯(lián)復(fù)合外排泵CusCBA配合物是一種動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，周質(zhì)銜接蛋白CusB是一種金屬傳感元件，它在cus操縱子的轉(zhuǎn)錄激活之前驅(qū)動(dòng)外排復(fù)合物的形成，以產(chǎn)生金屬抗性[25]。

同樣，在殺生劑抗性中外排泵機(jī)制也被證明具有重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)RNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析，戊二醛暴露誘導(dǎo)外排泵產(chǎn)生和膦酸鹽降解，同時(shí)影響脂質(zhì)和多胺的生物合成代謝，此外，對(duì)外排泵進(jìn)行化學(xué)抑制發(fā)現(xiàn)戊二醛活性增強(qiáng)，表明外排泵有助于戊二醛抗性[20]。這些研究說(shuō)明，外排泵功能是細(xì)菌產(chǎn)生抗性的重要機(jī)制。

1.2 細(xì)胞膜通透性改變

另一種重要的抗性機(jī)制是改變細(xì)胞膜通透性，細(xì)菌通過(guò)調(diào)節(jié)控制細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，選擇性地減少或禁止某些化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，從而產(chǎn)生對(duì)該化學(xué)物質(zhì)的抗性(圖1)。細(xì)菌可以通過(guò)突變而改變外膜中外膜孔蛋白和脂多糖的滲透性，從而產(chǎn)生四環(huán)素抗性[34]。對(duì)于殺生劑抗性的研究也表明，膜通透性改變可以提高細(xì)菌的殺生劑抗性，Bisbiroulas等[14]將單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在苯扎氯銨作用下生長(zhǎng)的極性和中性脂類成分進(jìn)行分析，并將其與最佳生長(zhǎng)細(xì)胞進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌通過(guò)調(diào)整脂質(zhì)變化導(dǎo)致膜流動(dòng)性降低，并且還導(dǎo)致細(xì)胞表面的物理化學(xué)性質(zhì)的改變，從而改變細(xì)菌對(duì)非生物物質(zhì)表面的粘附，產(chǎn)生了對(duì)殺生劑的抗性。而另一種通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析殺生劑抗性的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，受苯酚壓力選擇的大腸桿菌的外膜蛋白OmpA、FadL、LamB和OmpT，細(xì)胞質(zhì)相關(guān)蛋白AceA和EF-Tu，內(nèi)膜蛋白AtpB，推斷的衣殼蛋白Q8FewO和未知位置蛋白Dps蛋白質(zhì)也發(fā)生改變，從而使細(xì)菌產(chǎn)生了對(duì)苯酚的抗性[19]。

1.3 改變作用靶標(biāo)點(diǎn)

細(xì)菌還可以通過(guò)干擾或限制抗生素等化學(xué)物質(zhì)的靶標(biāo)位點(diǎn)，使其殺菌作用降低或受到抑制，從而產(chǎn)生抗性(圖1)。例如大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺和鏈霉素抗生素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上是不同的，但有相似的作用模式，細(xì)菌通過(guò)修飾它們?cè)诤颂求w上的靶標(biāo)點(diǎn)，特別是23S rRNA的結(jié)構(gòu)域中腺嘌呤殘基的甲基化，使抗生素藥物無(wú)法作用到正確靶標(biāo)點(diǎn)，從而產(chǎn)生抗性[35-37]。改變靶標(biāo)點(diǎn)同樣是殺生劑抗性的一種重要機(jī)制。在大腸桿菌中，F(xiàn)abI突變轉(zhuǎn)化為FabI[G93V]，而FabI可以與蛋白質(zhì)和三氯生形成穩(wěn)定的三元結(jié)構(gòu)，突變后的FabI[G93V]則影響了三氯生在細(xì)胞中的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，使三氯生更容易被去除，從而產(chǎn)生對(duì)三氯生的抗性[16]。

1.4 酶修飾和降解作用

細(xì)菌可以產(chǎn)生針對(duì)某些種類抗生素或殺生劑的修飾酶或降解酶，當(dāng)這些化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后，首先被相應(yīng)的酶作用水解或者修飾，或者被一些生化作用降解，從而無(wú)法起到殺菌作用，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生抗性(圖1)。Cagliero等[38]使用紅霉素和泰樂(lè)菌素在體外選擇空腸彎曲桿菌和彎曲桿菌的大環(huán)內(nèi)酯抗性突變體，發(fā)現(xiàn)這些突變體通過(guò)在核糖體蛋白L4(G74D)和L22(插入位置86或98)中表現(xiàn)出修飾作用而產(chǎn)生抗生素抗性。細(xì)菌對(duì)殺生劑的這一抗性機(jī)制主要是通過(guò)生化降解作用。Meade等[17]從堆肥、水和土壤樣品中分離到對(duì)三氯生具有高度抗性的惡臭假單胞菌和木糖氧化無(wú)色桿菌反硝化亞種，利用含有三氯生的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)高效液相色譜法結(jié)合生物測(cè)定證明，三氯生在液體培養(yǎng)物中被滅活或失去效用。Nishihara[18]也發(fā)現(xiàn)從城市污水處理廠的活性污泥中分離到的一種假單胞菌可以通過(guò)N-脫烷基化降解作用對(duì)季銨類化合物產(chǎn)生高度抗性。

1.5 應(yīng)激反應(yīng)及改變生理特性

與4種常見抗性機(jī)制不同的是，最近的一些研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌還可以通過(guò)生理代謝變化降低細(xì)胞對(duì)殺生劑的敏感性，比較常見的現(xiàn)象為營(yíng)養(yǎng)限制、降低生長(zhǎng)速率和防止殺生劑進(jìn)入下層細(xì)胞[22,27]。Muoz等[39]對(duì)比了益生菌戊糖乳桿菌MP-10暴露于亞致死濃度的抗生素(阿莫西林、氯霉素和四環(huán)素)和殺生劑(苯扎氯銨和三氯生)2種環(huán)境的抗性表現(xiàn)，并利用蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，戊糖乳桿菌MP-10對(duì)抗生素產(chǎn)生的適應(yīng)性表現(xiàn)為蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)增加、碳水化合物代謝及能量生產(chǎn)的相關(guān)基因的表達(dá)下降，對(duì)殺生劑的適應(yīng)性表現(xiàn)為磷酸化載體蛋白HPr和氧化還原酶相關(guān)編碼基因表達(dá)的下調(diào)，但它們的共同點(diǎn)在于蛋白質(zhì)合成基因的過(guò)量表達(dá)，這些生理代謝共同的適應(yīng)性使細(xì)菌對(duì)抗生素和殺生劑產(chǎn)生了抗性(圖1)。

1.6 金屬螯合與生物轉(zhuǎn)化

金屬螯合與生物轉(zhuǎn)化作用是細(xì)菌針對(duì)重金屬產(chǎn)生的抗性機(jī)制，而近些年的研究發(fā)現(xiàn)，重金屬抗性與抗生素抗性密切相關(guān)[26]。關(guān)于細(xì)菌對(duì)重金屬的抗性，研究發(fā)現(xiàn)，由mer操縱子編碼的細(xì)菌抗汞機(jī)制中，進(jìn)入細(xì)胞膜的Hg2+先與Hg2+結(jié)合蛋白結(jié)合，將結(jié)合的汞傳遞給位于細(xì)胞質(zhì)膜中的汞運(yùn)輸系統(tǒng)，該系統(tǒng)允許汞向細(xì)胞內(nèi)的易化擴(kuò)散，隨后非細(xì)胞汞(Hg2+)被細(xì)胞質(zhì)汞還原酶還原為無(wú)毒的0價(jià)汞從細(xì)胞中揮發(fā)，防止了Hg2+對(duì)細(xì)胞的損傷(圖1)[23]。在另一項(xiàng)研究中，由于細(xì)胞壁上存在磷酸二酯基、羧基、糖羥基和酰胺基等許多陰離子位點(diǎn)，使枯草芽孢桿菌細(xì)胞壁與多種金屬(Hg2+、Pb2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Na+和K+)結(jié)合，結(jié)合后的金屬失去了生物毒性[24]，所以使細(xì)菌產(chǎn)生重金屬抗性(圖1)。

2 細(xì)菌對(duì)多種選擇壓力的共選擇機(jī)制(Resistance mechanism of bacteria to multiple selection pressures)

重金屬、殺生劑和抗生素都是具有抗菌作用的物質(zhì)，具有相似的抑菌/殺菌手段，所以，細(xì)菌可以同時(shí)對(duì)它們產(chǎn)生抗性，且可能具有相似的選擇和共存機(jī)制，與單一化學(xué)物質(zhì)抗性相比，細(xì)菌的多重抗性機(jī)制更為復(fù)雜，研究較多的則是協(xié)同抗性(共抗性)、交叉抗性和共調(diào)控抗性。

2.1 協(xié)同抗性(共抗性)

當(dāng)不同抗性表型的基因位于同一遺傳元件(如質(zhì)粒，轉(zhuǎn)座子或整合子)上時(shí)，就會(huì)發(fā)生共同抗性[40]。Buffet-Bataillon等[41]通過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，dfrA、sul1和qacEΔ1基因盒的存在與對(duì)復(fù)方新諾明的抗性和季胺類殺生劑的最小抑菌濃度(MIC)值相關(guān)。Zhang等[42]對(duì)金黃色葡萄球菌LZ-01的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鉻酸鹽或氨芐青霉素處理后的細(xì)菌，基因組和轉(zhuǎn)錄組EmrA和EmrB基因水平都會(huì)相應(yīng)上調(diào)，使細(xì)菌對(duì)鉻和氨芐青霉素的抗性增加，在將EmrA和EmrB基因扣除后，這種誘導(dǎo)現(xiàn)象消失，表明EmrAB操縱子賦予了細(xì)菌在生存環(huán)境中對(duì)鉻酸鹽或氨芐青霉素的共抗性。另外，對(duì)于攜帶多種抗性基因質(zhì)粒的研究已有許多報(bào)道，F(xiàn)ang等[43]研究發(fā)現(xiàn)，pco和sil操縱子、oqxAB/blaCTX-M共存于IncHI2質(zhì)粒上，含有這一質(zhì)粒的細(xì)菌表現(xiàn)出對(duì)重金屬和抗生素的共抗性(圖2)。另一項(xiàng)研究表明，質(zhì)粒pUUH239.2編碼對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗性(blaCTX-M-15、blaTEM-1和blaOXA-1)、氨基糖苷類抗性(aac-(6')-1b-cr和aadA2)，四環(huán)素類抗性(tet(A)和tetR)、甲氧芐氨嘧啶類抗性(dhfrXII)、磺胺類抗性(sul1)、季銨化合物類抗性(qacEΔ1)、大環(huán)內(nèi)酯類抗性(mph(A)-mxr-mphR(A))和重金屬離子(銀、銅和砷)抗性，這種同時(shí)編碼對(duì)抗生素、殺生劑和重金屬抗性的質(zhì)粒的存在對(duì)細(xì)菌多重抗性有重要作用[44]。

2.2 交叉抗性

交叉抗性是指細(xì)菌通過(guò)同一種抗性機(jī)制可以同時(shí)對(duì)抗生素、殺生劑和重金屬等產(chǎn)生抗性[45]。已有研究證明，由于應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)導(dǎo)致喹諾酮類藥物與其他抗菌藥物(包括三氯生)之間的交叉抗性[46-47]。外排泵功能作為一個(gè)重要的抗性機(jī)制，在交叉抗性機(jī)制中也占據(jù)主導(dǎo)地位。由3個(gè)基因操縱子(cmeABC)編碼的外排泵與已知的三重多藥外排泵具有顯著結(jié)構(gòu)同源性，它由周質(zhì)融合蛋白(CmeA)、內(nèi)膜外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CmeB)和外膜蛋白(CmeC)組成，有助于空腸彎曲桿菌野生型81-176菌株中的多重抗性[48]。且后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，cmeDEF編碼的外排系統(tǒng)對(duì)包括氨芐青霉素、溴化乙錠、吖啶、十二烷基硫酸鈉(SDS)、脫氧膽酸鹽、三氯生和西曲酰亞胺等具有多重抗性[49]。關(guān)于在外排泵功能中常見的RND型多蛋白外排機(jī)制，Conroy等[50]研究發(fā)現(xiàn)，ges編碼系統(tǒng)與RND型蛋白外排系統(tǒng)密切相關(guān)，且ges系統(tǒng)具有較為廣泛的底物特性，可以同時(shí)將重金屬和抗生素類藥物排出細(xì)胞外。而對(duì)于另一具有外排功能的MexAB-OprM系統(tǒng)，Schweizer[51]采用一種基于酵母FLP重組酶的新技術(shù)，驗(yàn)證了MexAB-OprM系統(tǒng)是銅綠假單胞菌對(duì)藍(lán)藻素和硫代乳霉素的內(nèi)源性耐藥系統(tǒng)，且該系統(tǒng)同時(shí)可以排出具有廣譜殺菌作用的三氯生。另有研究證明，在鼠傷寒沙門氏菌中BaeSR系統(tǒng)通過(guò)誘導(dǎo)AcrD和MdtABC藥物外排系統(tǒng)增加沙門氏菌的多重抗性和金屬抗性(圖2)[52]。Shahcheraghi等[53]通過(guò)基因克隆，將含有編碼多藥外排功能smfY基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)菌，觀察細(xì)菌抗性發(fā)現(xiàn)，宿主菌對(duì)諾氟沙星、苯扎氯銨、吖啶黃和溴化乙錠的MIC顯著增加。另一誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)或?qū)Ρ皆蠕@和抗生素適應(yīng)性增強(qiáng)，導(dǎo)致大腸桿菌表征出對(duì)苯扎氯銨和抗生素的獲得性交叉抗性，其中外排功能的增強(qiáng)在具有抗性的細(xì)胞中明顯增加[54]。

2.3 共調(diào)控抗性

細(xì)菌的生命活動(dòng)依靠各種胞內(nèi)組織的共同調(diào)節(jié)，當(dāng)細(xì)菌暴露于選擇壓力之下時(shí)，會(huì)將轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程聯(lián)系起來(lái)，通過(guò)應(yīng)激協(xié)調(diào)反應(yīng)產(chǎn)生抗性[26]。Navarre等[55]發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)基因slyA和phoP/phoQ在沙門氏菌對(duì)藥物產(chǎn)生的抗性中起關(guān)鍵作用，slyA的主要作用是改變細(xì)胞表面以保護(hù)細(xì)胞免受宿主產(chǎn)生的有毒化合物的影響(圖2)。Perron等[56]通過(guò)亞抑制濃度或亞致死濃度誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，證明了雙組分調(diào)節(jié)基因czcR-czcS與銅綠假單胞菌的重金屬抗性和碳青霉烯抗生素抗性有關(guān)。Balasubramanian等[57]的研究證明，ampR的丟失導(dǎo)致了藥物對(duì)細(xì)菌作用的增強(qiáng)，這表明在β-內(nèi)酰胺抗性、藻酸鹽生產(chǎn)、群體感應(yīng)基因和毒性因子產(chǎn)生之間存在著一個(gè)共同調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，其中ampR起著核心作用。與此相似，acrD和mdtABC基因的共同缺失抑制了baeR介導(dǎo)的多重抗性，而單個(gè)基因的缺失并不能抑制baeR介導(dǎo)的多重抗性，證明BaeR調(diào)節(jié)系統(tǒng)通過(guò)誘導(dǎo)AcrD和MdtABC外排系統(tǒng)增加了沙門氏菌的多重抗性[52]。最近的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三氯生可誘導(dǎo)野生型大腸埃希菌通過(guò)共調(diào)控作用產(chǎn)生多重抗性，三氯生誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致fabI、frdD、marR、acrR和soxR等基因的突變，引起編碼β-內(nèi)酰胺酶和多藥外排泵基因轉(zhuǎn)錄的上調(diào)，以及膜通透性相關(guān)基因的下調(diào)[58]。

3 重金屬和殺生劑對(duì)細(xì)菌抗生素抗性影響的研究現(xiàn)狀(Research status of the effects of heavy metals and biocides on bacterial antibiotic resistance)

重金屬對(duì)細(xì)菌抗生素抗性影響的研究，過(guò)去主要采用誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的方法觀察細(xì)菌抗生素抗性的變化，并且發(fā)現(xiàn)受重金屬刺激的細(xì)菌更容易在抗生素環(huán)境中存活；后期的研究專注于與表型相關(guān)的基因及其表達(dá)的情況，證明了環(huán)境污染濃度的重金屬暴露可以提高細(xì)菌的抗生素抗性[59-61]。與重金屬的環(huán)境污染濃度下細(xì)菌抗生素抗性的變化相比，現(xiàn)在的研究更關(guān)注于環(huán)境濃度及亞抑制濃度下細(xì)菌抗生素抗性的變化，并且抗性的持續(xù)性問(wèn)題成為研究熱點(diǎn)。一些實(shí)驗(yàn)證明，低濃度的重金屬共選擇作用提高了環(huán)境中抗生素抗性基因(ARGs)的豐度，改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，使細(xì)菌整體抗性水平增強(qiáng)，且在去除重金屬后，這種抗性水平會(huì)維持較長(zhǎng)時(shí)間，在土壤環(huán)境中這種抗性甚至?xí)掷m(xù)幾十天[61-63]。最近研究發(fā)現(xiàn)，在亞抑制濃度Cu2+暴露下，細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧(ROS)，提高了細(xì)菌的接合頻率，從而增強(qiáng)了抗生素抗性基因的水平轉(zhuǎn)移[64]。此外，環(huán)境濃度Cu、Ag、Cr和Zn的暴露，不僅促進(jìn)了細(xì)菌內(nèi)ROS的形成，使得細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，也對(duì)膜完整性造成損害，從而增加了脂質(zhì)相關(guān)rfaZ、rfaq、pmrD、htrL和plsX等的表達(dá)，從而促進(jìn)抗生素抗性基因的水平轉(zhuǎn)移[65]。由此可見，亞抑制濃度重金屬對(duì)細(xì)菌的抗生素抗性具有促進(jìn)作用，其中ROS的產(chǎn)生被認(rèn)為是重金屬促進(jìn)抗性基因水平轉(zhuǎn)移的原因之一[64-65]。

重金屬對(duì)細(xì)菌抗生素抗性的促進(jìn)作用已被廣泛認(rèn)可，但目前對(duì)于殺生劑與抗生素抗性的相關(guān)性存在一些爭(zhēng)議。已經(jīng)有多項(xiàng)研究表明，殺生劑抗性與抗生素抗性之間并無(wú)直接關(guān)聯(lián)性，對(duì)從環(huán)境樣品中分離的抗性細(xì)菌的調(diào)查分析顯示，來(lái)自動(dòng)物糞便、含氯自來(lái)水和臨床菌株等多種途徑的細(xì)菌可以同時(shí)對(duì)多種抗生素和殺生劑產(chǎn)生抗性，但2種抗性之間僅存在弱相關(guān)性[66-68]。這種2種抗性之間相關(guān)性分析很明顯，不能成為殺生劑與抗生素抗性間作用的有效證據(jù)，更多的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)及基因?qū)用娴臋C(jī)理研究準(zhǔn)確地說(shuō)明了殺生劑對(duì)抗生素抗性的促進(jìn)作用。一些調(diào)查分析表明，殺生劑與細(xì)菌抗生素抗性密切相關(guān)。在空氣和水體環(huán)境中的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，殺生劑的存在往往提高了環(huán)境中ARGs的豐度，且抗生素抗性呈現(xiàn)隨殺生劑濃度升高而增強(qiáng)的現(xiàn)象[69-70]。Liu等[70]對(duì)暴露于消毒副產(chǎn)物中的銅綠假單胞菌的抗生素抗性研究表明，殺生劑暴露使細(xì)菌對(duì)10種單獨(dú)抗生素和多種抗生素的抗性均有不同程度的提高，與對(duì)照相比，對(duì)諾氟沙星和多霉素B抗性增強(qiáng)甚至超過(guò)10倍。對(duì)這些抗性表型的作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，SmeT是多藥外排系統(tǒng)SmeDEF的一種阻遏物，三氯生與SmeT結(jié)合，降低了SmeT對(duì)SmeDEF的抑制作用，提高了SmeDEF在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，從而提高抗性[71]。不止這種化學(xué)結(jié)合作用，殺生劑還可以通過(guò)誘導(dǎo)而導(dǎo)致多藥外排泵AcrAB-TolC突變，該突變與多重抗性表型有關(guān)，使細(xì)菌對(duì)喹諾酮類抗生素和殺生劑三氯生均產(chǎn)生高度抗性[72]。最近的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2種常見的水消毒副產(chǎn)物(亞氯酸鹽和碘乙酸)具有選擇抗生素抗性的作用，導(dǎo)致在高(接近MIC)和低(亞MIC)暴露濃度下抗性大腸桿菌菌株的突變，且亞抑制濃度的消毒副產(chǎn)物暴露產(chǎn)生的抗性高于MIC暴露濃度下產(chǎn)生的抗性[73]。綜上，可以看出殺生劑可以誘導(dǎo)抗生素抗性增強(qiáng)，但對(duì)于這種抗性在環(huán)境中的持續(xù)性問(wèn)題研究較少，Li等[74]將革蘭氏陰性菌大腸桿菌長(zhǎng)期暴露于環(huán)境濃度的三氯生中，檢測(cè)分析細(xì)菌基因組和轉(zhuǎn)錄組信息發(fā)現(xiàn)，由于靶基因的過(guò)度表達(dá)和突變導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)三氯生的抗性明顯增強(qiáng)，且在停止暴露后細(xì)菌由于可遺傳的基因突變，適應(yīng)細(xì)胞對(duì)三氯生表現(xiàn)出持續(xù)的抗性；而在暴露過(guò)程中細(xì)菌的抗生素抗性變化不大，暴露停止后會(huì)隨著時(shí)間的推移而下降。而關(guān)于殺生劑促進(jìn)抗生素抗性傳播的研究，目前僅有一篇文獻(xiàn)介紹了在對(duì)供體菌和受體菌共同培養(yǎng)的條件下，三氯生和洗必泰顯著增加了抗生素抗性的轉(zhuǎn)移頻率，促進(jìn)了抗生素抗性的水平傳播[75]。

從目前研究來(lái)看，對(duì)于環(huán)境中的重金屬和殺生劑對(duì)細(xì)菌抗生素抗性的研究，首先通過(guò)細(xì)菌誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)觀察其抗性表型，其次結(jié)合分子生物學(xué)和測(cè)序技術(shù)，分析細(xì)菌基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組信息，深入研究細(xì)菌產(chǎn)生抗生素抗性的基因型和抗性表型[59-61,66-71]。一般認(rèn)為高濃度暴露更容易產(chǎn)生細(xì)菌抗生素抗性[59-61]，但近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)，亞抑制濃度暴露也是促進(jìn)細(xì)菌抗生素抗性及多重抗性的關(guān)鍵因素[73-74]，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析了細(xì)菌抗生素抗性的持久性[61-63]，以更好評(píng)估重金屬和殺生劑帶來(lái)的抗生素抗性的環(huán)境影響。其中，抗性基因的水平轉(zhuǎn)移是目前重金屬和殺生劑對(duì)細(xì)菌抗生素抗性影響研究的重點(diǎn)[64-65,75]。

4 研究展望(Research prospect)

重金屬和殺生劑已成為推動(dòng)細(xì)菌抗性增長(zhǎng)的重要因素，但目前的研究仍存在一些不足，主要表現(xiàn)在：(1)缺乏多種選擇壓力共選擇實(shí)驗(yàn)研究。目前有關(guān)選擇壓力脅迫產(chǎn)生抗生素抗性的研究多是采用單一化學(xué)物質(zhì)暴露的實(shí)驗(yàn)，而環(huán)境中更多的情況是多種選擇壓力并存，進(jìn)一步研究多種選擇壓力對(duì)細(xì)菌抗生素抗性的共選作用及機(jī)制有利于應(yīng)對(duì)細(xì)菌抗性問(wèn)題。(2)驅(qū)動(dòng)機(jī)制研究不足。雖然已有足夠證據(jù)表明細(xì)菌可以通過(guò)多種作用機(jī)制產(chǎn)生多重抗性，但驅(qū)使這種多重抗性產(chǎn)生的機(jī)制仍不清楚；另外，雖然已有部分研究證明重金屬和殺生劑可以驅(qū)動(dòng)抗生素抗性水平傳播，但其傳播機(jī)制和誘導(dǎo)傳播的機(jī)制尚不明確?？股乜剐匝芯恳焉婕拔⑸飳W(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域，因此，有必要利用多學(xué)科研究手段對(duì)細(xì)菌抗性的形成機(jī)制、選擇壓力和驅(qū)動(dòng)機(jī)制開展深入研究。