洋參御糖丸對(duì)糖尿病大鼠心肌微血管病變的干預(yù)作用

隋艷波，孫 藝，王瑞楠，謝 寧*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040）

糖尿病微血管病變是糖尿病最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，更是所有糖尿病患者致死致殘最為主要的原因。本研究采用民間驗(yàn)方洋參御糖丸，以前期臨床及動(dòng)物研究證實(shí)其治療糖尿病安全有效為基礎(chǔ)[1-2]，進(jìn)一步觀察洋參御糖丸對(duì)糖尿病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)及血管內(nèi)皮功能紊亂的干預(yù)作用，為洋參御糖丸推廣應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)健康Wistar 雄性大鼠80 只，體質(zhì)量（180±20）g，購(gòu)買自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GCP實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有大鼠自由飲水和進(jìn)食飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，保障實(shí)驗(yàn)室空氣流通，相對(duì)濕度維持在40%～70%之間，溫度保持在20～24 ℃之間。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 中藥飲片包括黃芪、西洋參、玉竹、麥冬、烏梅、白芍、山藥、葛根、女貞子、龜板、山茱萸等，上述飲片均購(gòu)自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司；洋參御糖丸由黑龍江省中西醫(yī)結(jié)合研究所所屬制劑室加工生產(chǎn)；鹽酸二甲雙胍片，商品名：格華止；生產(chǎn)批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)號(hào)H20 023370；生產(chǎn)廠家：中美上海施貴寶制藥有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 血糖試紙（美國(guó)強(qiáng)生公司）；磷酸二氫鈉、檸檬酸、丙酮、檸檬酸鈉（天津市化學(xué)試劑三廠）；多聚甲醛、磷酸戊二醛固定液（北京賽馳生物科技有限公司）；鏈脲佐菌素（批號(hào)s-0130，AIGMA公司）；糖化血紅蛋白試劑（南京建成生物工程研究所）；二抗PV6001（北京中山生物有限公司）；大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1（VCAM-1）免疫組化試劑盒、大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）免疫組化試劑盒、大鼠糖基化終產(chǎn)物（AGCs）免疫組化試劑盒（北京博奧森生物有限公司）。

1.4 儀器 血糖儀（美國(guó)強(qiáng)生公司）；電熱恒溫干燥箱（上海一橫有限公司）；超低溫冰箱（日本三洋公司）；組織切片機(jī)（2135）：德國(guó)萊卡；醫(yī)用微波爐（日本）；透射電鏡（1220）：Olympus 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料 普通飼料由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心加工生產(chǎn)；高糖高脂飲食飼料配置：在常規(guī)普通飼料的基礎(chǔ)上，混合加入10%白砂糖、10%蛋黃粉、2%膽固醇和13%豬油，上述飼料混勻后，每周一次由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心加工成顆粒，謹(jǐn)防飼料霉變。

2.2 造模及分組 隨機(jī)選擇10 只Wistar 大鼠作為空白組，給予常規(guī)普通飼料飼喂；70 只大鼠高脂高糖飼料連續(xù)飼喂8 周后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素進(jìn)行糖尿病造模（鏈脲佐菌素給藥劑量：30 mg/kg），72 h 后檢測(cè)尾靜脈血糖，篩選隨機(jī)連續(xù)2 次以上血糖≥16.7 mmol/L 做為糖尿病模型大鼠成功標(biāo)準(zhǔn)，篩選符合上述標(biāo)準(zhǔn)的糖尿病大鼠給予高脂高糖飼料繼續(xù)飼喂12 周，誘導(dǎo)糖尿病大鼠形成微血管病變。

篩選符合標(biāo)準(zhǔn)大鼠隨機(jī)分為模型組、洋參御糖丸高劑量組、洋參御糖丸低劑量組以及二甲雙胍組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。各組大鼠均自由進(jìn)行攝食和飲水，藥物灌胃4 周后進(jìn)行組織取材和相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。

2.3 給藥方法 各組大鼠每日固定時(shí)間灌服相應(yīng)藥物，療程4 周，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果并參照“人與動(dòng)物間體表面積折算等效劑量比值表”各組大鼠給藥劑量確定如下：二甲雙胍組70 mg/（kg·d）；洋參御糖丸高劑量組：2.7 g/（kg·d）；洋參御糖丸低劑量組1.35 g/（kg·d）；空白組大鼠每日同等量蒸餾水；模型組大鼠予相同體積蒸餾水。

2.4 標(biāo)本采集 灌胃4 周后次日清晨空腹進(jìn)行標(biāo)本采集，尾靜脈采血測(cè)血糖，去眼球收集全血4 mL，3 000轉(zhuǎn)/min，離心5 min，分離保存血清和紅細(xì)胞備檢糖化血紅蛋白；烏拉坦麻醉狀態(tài)下，剪毛備皮消毒，開(kāi)胸，剪開(kāi)心包膜，直接暴露心臟，剪斷主動(dòng)脈，迅速取出整個(gè)心臟，置于冰袋上，剪去心房和血管，保留左心室心肌，分離切割成3 mm×3 mm×3 mm 心肌塊，慮紙拭干血漬，4%多聚甲醛固定液內(nèi)固定免疫組化指標(biāo)檢測(cè)；左心室心肌分離切割成1 mm×1 mm×3 mm 組織塊，戊二醛溶液固定，以備電鏡檢測(cè)。

2.5 指標(biāo)檢測(cè) 全自動(dòng)生化儀測(cè)定各組大鼠空腹血糖；比色法測(cè)定糖化血紅蛋白；電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)；免疫組化法檢測(cè)心肌AGEs、VEGF、VCAM-1：以積分光密度（IOD）代表AEGS、VCAM-1和VEGF的相對(duì)表達(dá)量，積分光密度（IOD）=陽(yáng)性面積×平均光密度。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組大鼠組間比較滿足方差齊性時(shí)采用方差分析，方差不齊則采用T 檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 洋參御糖丸對(duì)糖尿病大鼠糖代謝及糖化血紅蛋白的影響 見(jiàn)表1。

表1 洋參御糖丸對(duì)糖尿病大鼠糖代謝及糖化血紅蛋白的影響（）

表1 洋參御糖丸對(duì)糖尿病大鼠糖代謝及糖化血紅蛋白的影響（）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與二甲雙胍組比較，▲P ＜0.05

模型組大鼠血糖、HbA1C較空白組顯著升高（P＜0.05）；二甲雙胍組大鼠以及洋參御糖丸高劑量組和洋參御糖丸低劑量組均不同程度降低大鼠血糖、糖化血紅蛋白，與模型組相比差異顯著（P＜0.05）；而且二甲雙胍組在降低血糖、糖化血紅蛋白方面的作用明顯優(yōu)于洋參御糖丸組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3.2 洋參御糖丸對(duì)糖尿病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響 見(jiàn)圖1～5。透射電鏡下觀察空白組大鼠心肌結(jié)構(gòu)清晰，肌纖維排列整齊，閏盤(pán)鏈接規(guī)整；細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)一致；線粒體清楚；明暗帶分布均勻清晰；肌絲排列整齊，微血管數(shù)目正常，微血管基底膜未見(jiàn)增厚。模型組心肌細(xì)胞核畸形，結(jié)構(gòu)紊亂；閏盤(pán)扭曲、斷裂，形態(tài)參差不齊；肌原纖維明顯減少，明暗帶模糊，Z 線和M 線看不清，部分肌絲及基質(zhì)溶解；線粒體腫脹，結(jié)構(gòu)不清，甚至空化，大小及形狀不一致；心肌微血管數(shù)目明顯增加，但完整清晰的微血管數(shù)目較少，基底膜明顯增厚。二甲雙胍組大鼠肌原纖維排列整齊，肌絲結(jié)構(gòu)正常，明暗帶清楚，細(xì)胞核橢圓形，結(jié)構(gòu)正常；線粒體大小及形態(tài)一致，結(jié)構(gòu)清晰，心肌微血管數(shù)目及基底膜厚度正常。洋參御糖丸高劑量組大鼠肌原纖維排列整齊，Z 線和M 線清楚，可見(jiàn)明暗帶；細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整清晰；線粒體排列規(guī)整，部分腫脹，未見(jiàn)空泡化；閏盤(pán)鏈接較完整；與模型組比較，心肌微血管數(shù)目增多，但未見(jiàn)明顯基底膜增厚。低劑量組大鼠心肌細(xì)胞核及線粒體結(jié)構(gòu)完整，排列均勻，肌原纖維輕度減少，閏盤(pán)鏈接尚算完整，僅見(jiàn)少量肌絲斷裂，部分線粒體腫脹，微血管數(shù)目尚可，基底膜厚度輕度增加。

圖1 各組大鼠電鏡下心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

圖2 各組大鼠電鏡下心肌微血管形態(tài)

3.3 洋參御糖丸對(duì)糖尿病大鼠心肌AGEs、VEGF、VCAM-1 的影響 見(jiàn)表2。本研究結(jié)果顯示糖尿病心肌病模型大鼠心肌AGEs、VEGF、VCAM-1 表達(dá)水平較空白組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；空白組僅有少量上述物質(zhì)表達(dá)；二甲雙胍和洋參御糖丸高劑量組大鼠心肌AGEs、VEGF、VCAM-1 表達(dá)水平較糖尿病心肌病模型組大鼠顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；洋參御糖丸低劑量組上述指標(biāo)表達(dá)水平下降并不明顯（P＞0.05）。

4 討論

根據(jù)各醫(yī)家對(duì)糖尿病微血管病變的認(rèn)識(shí)以及臨床經(jīng)驗(yàn)，在該病辨證論治方面尚無(wú)一致的結(jié)論和標(biāo)準(zhǔn)，脈絡(luò)中的孫絡(luò)在形態(tài)和功能上與微血管基本一致，絡(luò)病思想符合糖尿病微血管病變特點(diǎn)。臨床研究表明，中醫(yī)藥在防治糖尿病微血管病變中有著較好的療效優(yōu)勢(shì)[3-4]。洋參御糖丸中君藥為西洋參、黃芪，臣藥為山藥、山茱萸，諸藥合用共同起到益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)脾益腎之功效。此方經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床應(yīng)用表明其對(duì)糖尿病慢性并發(fā)癥具有良好的功效[5-6]。

圖3 各組大鼠心肌AGEs

圖4 各組大鼠心肌VCAM-1

圖5 各組大鼠心肌VEGF

表2 洋參御糖丸對(duì)糖尿病大鼠心肌AGEs、VEGF、VCAM-1 的影響

糖尿病心肌微血管病變主要病理特征為微血管內(nèi)皮損傷、管壁通透性增加、微血管基底膜增厚、舒縮功能障礙，微血栓形成，最終導(dǎo)致管腔狹窄甚至閉塞。VCAM-1 會(huì)增加內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附效應(yīng)，參與組織修復(fù)、炎癥反應(yīng)、血栓形成等病理生理過(guò)程；VEGF 在促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化及遷移的同時(shí)，還會(huì)增加血管通透性，進(jìn)而影響血液動(dòng)力學(xué)。AGEs 積聚造成細(xì)胞間通透性增高，內(nèi)皮細(xì)胞間氧彌散功能降低，導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和微血管功能退化。高糖高脂聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素建立的糖尿病大鼠模型具有典型的心肌微血管損傷病理特點(diǎn)。洋參御糖丸高劑量組治療后糖尿病大鼠血糖、HbA1C均有所下降；心肌纖維排列整齊，肌絲結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核線粒體結(jié)構(gòu)清晰，心肌微血管數(shù)目正常，表明本方在降糖同時(shí)能夠修復(fù)心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷；大鼠心肌AGEs、VEGF、VCAM-1 表達(dá)顯著下降，說(shuō)明洋參御糖丸具有降低AGEs、抑制病理性微血管促新生效應(yīng)、抑制促內(nèi)皮細(xì)胞黏附積聚作用，進(jìn)而可能延緩糖尿病微血管病變進(jìn)程。前期研究亦表明，洋參御糖丸能夠降低微血管通透性、清除心肌自由基、提高心肌抗氧化能力[7]，表明該方具有防治糖尿病微血管病變的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，洋參御糖丸方中主要藥味及其有效成分均有降糖及改善微血管病變作用，西洋參莖葉皂苷及葛根素有調(diào)脂、降糖、改善胰島素敏感性和改善心肌缺血作用[8-11]，另外可以調(diào)節(jié)高糖損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞PI3K/Akt 信號(hào)通路[12]；黃芪活性成分、黃芪甲苷、黃芪多糖均有調(diào)節(jié)血糖、抗氧化及改善內(nèi)皮細(xì)胞功能作用[13-16]；山茱萸環(huán)烯醚萜總苷、女貞子提取物總?cè)扑帷⑴懽又旋R墩果酸具有調(diào)節(jié)糖脂代謝，改善血流變，恢復(fù)血管收縮與舒張功能作用[17-20]；綜上所述，洋參御糖丸具有調(diào)節(jié)血糖，修復(fù)高糖損傷心肌病理結(jié)構(gòu)的作用，可能通過(guò)減少血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞黏附以及抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖來(lái)減緩血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，進(jìn)而改善糖尿病心肌微血管病變。