塞內卡病毒A VP1基因原核表達及蛋白純化

賀大芳，邱文英，陳奕帆，鄒 瑤，王 德

（華派生物工程集團有限公司，四川 簡陽 641402）

豬塞內卡病毒A（Senecavirus A,SVA）易感染動物。豬是該病毒的重要傳染源，能通過多種途徑排出病毒，如唾液、糞便、水皰皮等，在康復的動物組織中也能檢測到該病毒核糖核酸[1]。SVA可引起豬出現(xiàn)水皰性變化和新生仔豬死亡，成年豬通常呈亞臨床感染，引起繁殖母豬和公豬鼻吻和冠狀帶、蹄部出現(xiàn)水皰樣病變，偶見腹瀉癥狀[2]。SVA易感動物較廣泛，不僅不同年齡豬均易感[3]，研究者還在其他動物如人、蒼蠅[4]、牛和鼠等的血清中發(fā)現(xiàn)了SVA中和抗體，表明SVA能感染的動物種類可能較多。SVA能適應不同的細胞系，可利用豬睪丸細胞（SK-RST）、豬腎細胞（PK-15）和幼倉鼠腎細胞（BHK-21）[5]、人肺癌細胞（NCI-H1299）[6]等對SVA進行分離。

SVA是小RNA病毒，是塞內卡病毒屬（Senecavirus）的唯一成員[7]。它的基因組全長為7.2 kb，包括5'非編碼區(qū)、一個開放閱讀框及3'非編碼區(qū)，其功能如同mRNA，編碼病毒聚蛋白。SVA顆粒呈典型的二十面體對稱，直徑27 nm左右，外表面點綴著VP1、VP2和VP3伸出的肽環(huán)，且VP1和VP3是主要的抗原表位[8]。其中，VP1是能夠顯著誘導細胞發(fā)生早期和晚期凋亡，并且能夠促進凋亡蛋白Caspase3、Caspase8及Bax蛋白和mRNA水平的上調[9]，且VP1核苷酸易發(fā)生變異[10]，是抗原變異的關鍵結構蛋白，因此VP1是重要的抗原位點。

因此，本研究以SVAVP1基因為目的片段構建的原核表達載體在大腸桿菌中進行了誘導表達，并經過純化獲得較高純度的蛋白，為后續(xù)SVAVP1蛋白免疫原性的研究及塞內卡病毒病抗體ELISA方法的建立奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

SVAVP1基因序列[參考GenBank中收錄的SVA-001（DQ641257）的基因組序列VP1基因]，大小為788 bp，由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成；pET-28a（+）載體由本實驗室（華派生物工程集團質檢研發(fā)中心）保存；SVA高免血清由本實驗室自制。

1.2 主要試劑

E.coli DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細胞購自天根生化科技（北京）有限公司；T4連接酶、限制性內切酶Bam HI和Xho I購自寶生物工程（大連）有限公司；2×Taq Mix、質粒小提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；HRP標記的山羊抗豬IgG抗體購自KPL公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 VP1基因的擴增 參考GenBank中收錄的SVA-001（DQ641257）的基因組序列的VP1基因合成的序列為目的片段，并以此序列片段為模板設計1對引物，正向引物加入Bam HI酶切位點，F(xiàn):5'-CGCGGATCC TACCGTGAAACTCGGGCTATTACCA-3'；反向引物加入Xho I酶切位點R:5'-CCGCTCGAGAAGCTTGGAA GCGCCCCCCCA-3'，加下劃線部分即為引入的酶切序列，引物的合成由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。以合成的VP1基因序列為模板進行PCR擴增，反應體系為：2×Taq Mix 12.5μL，dNTPMix 1.0μL，上下游引物各1.0μL，模板2.0μL，ddH2O補足至25μL。PCR反應程序為：94℃5min，（94℃30 s，53℃45 s，72℃1min）35個循環(huán)，72℃10min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.3.2 重組質粒的構建 利用膠回收試劑盒將VP1基因擴增片段純化回收，利用Bam HI和Xho I進行雙酶切，同時用Bam HI和Xho I雙酶切pET-28a（+）載體，酶切結束電泳后切膠回收。兩種酶切產物按照適宜比例，利用T4連接酶在16℃過夜連接，連接產物經熱擊法轉化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞，涂布含卡那霉素的平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單個菌落進行菌落PCR鑒定。鑒定呈陽性的菌落經擴大培養(yǎng)后，質粒小提試劑盒提取質粒，再進行Bam HI和Xho I雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序驗證，測序驗證正確的重組質粒命名pET-28a（+）-VP1。

1.3.3 重組質粒pET-28a（+）-VP1的誘導表達 取成功構建的pET-28a（+）-VP1重組質粒轉化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)。分別挑取3～5個單菌落于含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)12～16 h，以此為種子液。種子液按照體積比1∶100轉接到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，當菌液的D600值在0.8～1.0時，加入終濃度為1 mmoL/L的IPTG，在37℃、180 r/min進行誘導表達，誘導6 h。誘導后菌液經4℃、5 000 r/min離心收集菌體。菌體用PBS緩沖液重懸后冰浴超聲破碎，裂解液進行離心后分別收集上清和沉淀，對其進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測，上樣量為15μL，考馬斯亮藍染色后分析重組VP1蛋白表達情況。

1.3.4 重組VP1蛋白的純化及復性 經小量表達驗證成功的克隆，擴大培養(yǎng)后進行大量誘導，收集大量誘導表達菌體后，用PBS緩沖液重懸，冰浴超聲破碎，離心收集包涵體沉淀。包涵體沉淀經包涵體洗滌液洗滌后用8M尿素溶解，再4℃、12 000 r/min離心25 min。上清液移至處理后的透析袋中，依次經6M、4M、2M、1M、0.5M、0.2M尿素透析復性。純化的每個步驟后都進行SDS-PAGE電泳，分析純化后重組蛋白的純度和表達量。

1.3.5 純化后VP1蛋白Western blot鑒定 取純化復性后的VP1蛋白，經SDS-PAGE分離后，轉移至PVDF膜，用含50 g/L脫脂奶粉溶液的PBST常溫封閉2 h；加入SVA高免血清（1∶2 000稀釋），4℃孵育過夜；TBST洗滌3次后加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG（1∶50 000稀釋），室溫孵育2 h；TBST洗滌3次后ECL顯影。

2 結果

2.1 VP1基因的PCR擴增

經PCR法擴增出788 bp的VP1基因序列，擴增產物大小與預期相符（圖1），表明本研究成功克隆到SVAVP1基因。

2.2 原核表達載體的構建與驗證

將VP1的PCR產物和載體pET-28a（+）分別用限制性內切酶Bam HI和Xho I進行雙酶切，酶切產物經T4連接酶連接，熱擊轉化至DH5α感受態(tài)細胞中。挑取菌落PCR驗證為陽性的單菌落（圖2），提取的重組質粒經雙酶切驗證（圖3）后送生物公司經載體pET-28a（+）的T7-Terminal引物測序。測序結果表明該序列與GenBank中收錄的SVA-001（DQ641257）的基因組序列的VP1基因序列的相似性為100%，且編碼框插入正確。

2.3 重組VP1基因的原核表達及可溶性分析

利用鑒定為陽性的BL21（DE3）/pET-28a（+）-VP1原核表達菌株進行原核誘導表達，加入終濃度為1 mmol/L IPTG，37℃下誘導表達6 h。菌體經過離心重懸，超聲破碎后進行SDS-PAGE電泳。結果（圖4）：BL21（DE3）/pET-28a（+）-VP1菌成功表達出預期36 kDa大小的特異性蛋白條帶，且超聲裂解后菌液及離心后的上清液和沉淀的電泳結果表明，表達的VP1蛋白主要以包涵體形式存在。

2.4 VP1蛋白的純化

將超聲波裂解后的菌液沉淀用包涵體洗滌液洗滌3次后，用8M尿素溶解可得到純度較高的VP1蛋白（圖5）。再依次經6M、4M、2M、1M、0.5M、0.2M尿素進行透析復性，得到純度為80%以上、濃度為400μg/mL的VP1蛋白。

2.5 純化后VP1蛋白Western blot分析

Western blot檢測結果表明，純化后的VP1蛋白可與SVA高免血清發(fā)生特異性結合，出現(xiàn)一條大小與SDS-PAGE中VP1蛋白一致的條帶（圖6），表明該條帶為VP1蛋白。

3 討論

近幾十年來關于SVA大量研究發(fā)現(xiàn)，SVA已發(fā)生變異，致病性逐漸增強[11]。并且VP1基因也表現(xiàn)出明顯差異，但這些變異是不是導致毒株致病性增強的原因還有待研究。有研究表明，誘導機體產生中和抗體的抗原具有構象依賴性[12]，因此VP1蛋白空間構象與其功能有著重要聯(lián)系。作為SVA最重要的結構蛋白，VP1蛋白在病毒感染和自然免疫中都發(fā)揮著重要作用[13]，故而獲得有活性的高質量的VP1蛋白對于進一步研究SVA診斷及其防治顯得尤為重要。

大腸桿菌表達系統(tǒng)能表達外源蛋白，具有方法簡單、蛋白表達量高、蛋白易純化、成本低等優(yōu)點，胰島素等生物制品都能在大腸桿菌中表達，其中以BL21（DE3）為應用最廣泛的表達宿主。pET系列的載體采用噬菌體T7啟動子，目的基因克隆到載體上，可以實現(xiàn)目的基因的高效表達，但目標蛋白主要以包涵體形式表達[14]。包涵體是沒有生物活性的蛋白，是蛋白表達過程中肽鏈部分折疊的中間體聚合形成的，其復性效率較低，除了與復性過程性質相關外，還與蛋白質本身特性有關。

目前關于SVA的研究主要是流行病學、臨床癥狀和病原學等方面，其診斷技術主要集中在病原學診斷和血清學診斷，其防治技術仍處于探索階段。因此，本試驗起以pET-28a（+）為表達載體，構建了重組質粒pET-28a（+）-VP1并于原核表達系統(tǒng)BL21（DE3）表達了重組蛋白，以為后續(xù)VP1蛋白的功能研究、SVA診斷方法研究以及疫苗的開發(fā)奠定基礎。本研究結果顯示，VP1蛋白主要以包涵體的形式進行表達，與各文獻報道一致。本試驗經洗滌，尿素溶解及復性過程得到了高純度的VP1蛋白，為后續(xù)研究奠定了基礎。