研究生教學中的基因克隆與病毒載體的構建

王菁華， 孫 瑾， 穆莉莉

（哈爾濱醫(yī)科大學神經(jīng)生物學教研室，哈爾濱150081）

0 引 言

基因克隆技術［1］是20 世紀70 年代發(fā)展起來的一項具有革命性的研究技術，其最終目的在于通過相應的技術手段，將目的基因導入寄主細胞，在宿主細胞內(nèi)目的基因被大量的復制。病毒載體構建技術［2］是將遺傳物質帶入細胞，原理是利用病毒具有傳送其基因組進入其他細胞，進行感染的分子機制?？砂l(fā)生于完整活體［3］或是細胞培養(yǎng)中［4］，可應用于基礎研究［5］、基因療法［6］或疫苗［7］?；蚩寺〖夹g有著極其廣泛的應用前景，在動物克隆［8］、植物克隆［9］以及疾病治療領域［10］都有著很強的使用價值，也是各國研究投入的重點。

在廣大醫(yī)學院研究生日常實驗科研中，基因克隆技術以及病毒載體的構建技術是其經(jīng)常面對的實驗內(nèi)容。在研究生教育教學過程中，特別是在碩士研究生新生里，通過觀察以及與學生們之間的交流反饋，發(fā)現(xiàn)對于碩士研究生新生來說存在兩個需要積極引導解決的問題：①研究生新生還沒有建立研究生學習應當具備的思維方式和思維習慣；②新生普遍缺乏相關實驗實踐經(jīng)驗。針對本校學生存在的問題，我校在碩士研究生一年級的第二學期開設了相關內(nèi)容的選修課，課程的內(nèi)容主要針對學生在實驗中可能會遇到的相關實驗技術，主要包括聚合酶鏈式反應（PCR）技術，組織化學和細胞化學技術，標記技術，分子雜交，細胞培養(yǎng)技術，電鏡技術及應用，流式細胞技術，膜片鉗技術及其應用和基因克隆與病毒載體的構建等。筆者在多年的基因克隆技術和病毒載體構建的教學中，累計教學260 人次，2018 ～2019 學年選修人數(shù)為80 人，共9 課時。如何做好理論與實踐的銜接是近年教學中經(jīng)常思考的問題。

1 教學指導思想

1.1 案例化教學的思考

案例教學是連接教育理論與教育實踐之間的橋梁［11］，案例化教學在研究生教育階段有著其獨特的優(yōu)勢。首先，從理論向實踐的轉型，離不開典型案例的示范作用，多年的教學實踐表明，有效開展案例化教學模式必須要注意：①對于案例的選取要典型全面；②在隨堂教學中要注意師生互動，問題的積極引導；③考核的方式方法要密切聯(lián)系學生學習中遇到的問題。把握好核心問題，有針對性地選擇教課內(nèi)容，針對教授對象的實際實驗需求，設計教學大綱，以期達到最好的教學效果［12］。

1.2 PBL教學模式的思考

研究生教學相比義務教育、本科教育，有著很大的不同，它不是簡單的“填鴨式”教學，也不是大規(guī)模的機械化教學，其教學的目的在于培養(yǎng)學生發(fā)現(xiàn)問題、思考問題、解決問題、實際應用的能力。正確的方法論對于問題的解決將會是事半功倍的。在教學中，堅持以問題為導向，根據(jù)問題，設問拋問，為學生們確定研究問題的方向，其后學生們通過自我學習，而后隨堂展示，發(fā)現(xiàn)自學中存在的問題，老師再根據(jù)學生的學習反饋，針對性地做出引導，最后達到問題的解決和學生們知識的應用掌握。這種教學方式是近些年在國內(nèi)外的中小學教育及本科生教學中受到廣泛的重視，稱之為基于問題的學習（Problem-Based Learning，PBL）［13］。在改革之前通用的教學模式是：學生課前預習，老師備課，老師授課，課后習題鞏固復習。對比起來，二者各有利弊：原始的教學模式優(yōu)點在于對知識的普及教授，缺點在于學生們更多的是被動記憶消化，不能夠有效地激發(fā)學生對于問題的解決思考能力。而在中小學義務教育階段開展教育改革，可以激發(fā)一部分同學的學習積極性，但是在當前的教育大環(huán)境來看并不能做到環(huán)環(huán)相扣，造成的結果卻是大部分義務教育階段學生沒有打下良好的知識基礎，反而把問題留給了之后的教育教學者。PBL教學模式似乎不適合初級學習的學生，但是對于處于高級學習階段的碩士研究生來說，應為利大于弊：①研究生教學屬于精細化教學，小班教學。導師在開展教學工作時精力足夠照顧每一位學生，便于因材施教。②脫胎換骨于本科生教育，研究生普遍具有良好的學習能力和學習習慣，問題的理解能力與解決能力已打下了一定的基礎。因此，開展PBL教學模式可以取得較好的效果。

2 教學內(nèi)容與授課模式

“基因克隆”是伴隨著生物學尤其是分子生物學的飛速發(fā)展而興起的一門新學科?；蚩寺〖夹g［14］，又稱重組DNA技術，是將目的基因與具有自主復制能力的載體DNA 進行體外重組，獲得新的重組DNA 后導入受體細胞中表達相應蛋白，以研究蛋白結構與功能及其與其他分子的相互作用。本門課程意在通過問題導向，聯(lián)系碩士研究生在今后實驗中可能遇到的有關基因克隆技術的相關問題，使研究生在了解生物學以及分子生物學的基礎知識后，掌握DNA重組，轉移、表達和檢測等技術的原理。根據(jù)教學的實際情況，將所要教授的相關內(nèi)容劃分為8 個學時4 大分類，每個分類占用2 課時，分別是：①基因克隆原理及載體圖譜的識別；②Vector NTI 及相關軟件的應用；③蛋白標簽在基因克隆中的應用；④病毒載體的構建及應用。由于基因克隆技術相關知識點龐雜，對于零基礎的同學來說，理解與學習起來都較為困難，因此，結合多年來的基因克隆實驗經(jīng)歷，教學中堅持由淺入深，由簡入難，拋問設問的教學方式，用通俗易懂的方式講解知識點。從最基本的知識如閱讀質粒圖譜pEGFPN1，pQCXIP，pCMV-Tag2B，pLVX-AcGFP-N1 等開始講起，并且把筆者所克隆過基因的過程如Ostn，Bex1，RGS5 等一一逐條講解。每個克隆質粒的案例都包括基因的背景，明確克隆目的，選擇適合骨架質粒，查找目的片段，選擇酶切位點，設計引物，獲取目的片段，膠回收，酶切，連接轉化，驗證陽性產(chǎn)物等內(nèi)容［15］。通過案例分析教學，引導學生養(yǎng)成邏輯化的思維習慣，在結合當前基因克隆技術前沿發(fā)展動態(tài)，著重講授難點知識——構建病毒質粒，包括慢病毒、腺病毒、逆轉錄病毒的選擇、包裝及其他應用性較強的知識。通過理論聯(lián)系實際，緊抓前沿發(fā)展態(tài)勢，讓學生們對于基因克隆技術有了更立體更系統(tǒng)的認識。對于部分對基因克隆技術有了實驗經(jīng)歷的研究生，通過再一次的動手實驗講解，轉換立場的方法，使得他們對于基因克隆技術有了新的認識，在授課過程中，能夠和老師積極的就其實驗中所遇到的疑惑點進行討論學習。其次，基于學生們的教學需求，在8 課時的教學大綱之外，還邀請了對于基因克隆技術感興趣的同學去相關實驗室參觀學習，面對面地了解熟悉基因克隆實驗的全流程。通過多種多樣的教學方式，立體的展示了基因克隆技術，希望能夠為碩士生們的研究之路開一個好頭。

3 考核標準與考核方式

對于本門選修課程，在學校要求的考核框架下，本課程采取考勤＋結課測驗的方式來對學生的掌握情況進行測試。只要認真聽課的同學，最后都會給予合格的基本成績。在結課時組織隨堂測驗，以期對學生們的知識掌握情況進行掌握，題目如給出兩個質粒的圖譜，根據(jù)圖譜回答該質?？梢赃x擇哪種酶切，具有什么原核抗性、真核抗性，是否可以用于包裝病毒、可以包裝哪類病毒等。通過測驗結果來看，學生們對于知識能夠有很好的消化吸收，達到了本選修課的教學目的。

4 授課反饋與總結

在最后一課上，同時向學生們征求意見，對于學生們在課程中的疑問，以及對于課程和教學上好的建議與意見進行收集與總結，主要集中總結在以下幾個方面：

（1）在基因克隆技術方面。學生們提出了一些具體問題，如：如何進行細胞基因敲除，如何進行甲基化測序，引物如何選擇，引物擴不出基因的原因，如何構建基因數(shù)據(jù)庫，如何建立穩(wěn)定克隆等，以及基因重組的其他具體問題。

（2）病毒載體構建方面。問題包括如何選擇病毒載體，轉染過程中有哪些注意事項，如何提高轉染的效率，載體技術在醫(yī)療上的應用情況，如何進行病毒的穩(wěn)定克隆，慢病毒的不穩(wěn)定問題，病毒的選擇以及特定病毒的不足處，病毒載體構建時的問題和解決辦法。

（3）對于課程建設的建議與意見。①對于課程的設置，學生們還是認為基因克隆技術相關課程知識較多，選修課的時長較短，不利于知識的理解與銜接，建議對于實用性較強的病毒載體的構建部分課程獨立出來，單獨設立一門選修課；②有的學生認為先理論教學沒有實踐操作的體驗，不利于知識的消化應用，建議除了講授理論知識外，開設基因克隆的實驗輔導班，從而真正動手學習實驗的操作；③課程教學應當遵循由淺入深的原則，通過循序漸進的教授方式，便于學生們更好地消化吸收相關內(nèi)容；④要加強師生之間的隨堂互動，老師積極地設問拋問，學生積極思考，良性互動能夠調動學生們的學習積極性。

5 結 語

作為醫(yī)學領域教學，如何做好研究生教育教學與本科生教育教學的銜接工作，使碩士研究生新生們能夠用最短的時間進入研究生學習的學習狀態(tài)，掌握基本科研素養(yǎng)，專業(yè)技術知識，是研究生教育階段的一個重要工作。而開設實驗技術方面的選修課程可找到一個符合實際的選擇。在今后的教學工作中不斷改進、完善基因克隆與病毒載體構建的課程，以教為輔、學為主，充分激發(fā)學生學習的積極主動性，從提高學生的科研能力和水平入手，培養(yǎng)學生的科研興趣，為研究生日后的實驗室科研工作奠定堅實的基礎。