P-糖蛋白相關(guān)信號(hào)通路介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

劉亨晶，魏敏，孫瑾瑜，于曉輝，張久聰

1.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院 消化內(nèi)科，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是腫瘤細(xì)胞免受化療藥物攻擊最重要的防御機(jī)制，也是導(dǎo)致腫瘤化療療效降低或失敗的主要原因之一。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的機(jī)制十分復(fù)雜，主要是通過上調(diào)一個(gè)或多個(gè)ABC細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，將腫瘤細(xì)胞內(nèi)的化療藥物排出細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低實(shí)現(xiàn)的。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是具有典型特征的ABC細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體之一，在具有耐藥表型的腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)。目前研究表明，P-gp表達(dá)受多種信號(hào)通路調(diào)控，如核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信號(hào)通路等。本文將對(duì)P-gp相關(guān)信號(hào)通路介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞多要耐藥的機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 P-gp的基本結(jié)構(gòu)、分布及功能

P-gp是在耐藥細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種由1280個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈異二聚體膜蛋白[1]。P-gp由MDR1基因（ABCB1）編碼，位于人7號(hào)染色體上，相對(duì)分子質(zhì)量為170 000。P-gp由2個(gè)半轉(zhuǎn)運(yùn)體組成，每個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體擁有2個(gè)跨膜結(jié)合域和2個(gè)核苷酸結(jié)合域，包含6個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)膜區(qū)和1個(gè)ATP結(jié)合利用區(qū)的部分構(gòu)成，跨膜結(jié)合域與底物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，而核苷酸結(jié)合域能與ATP結(jié)合為底物轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量[2]。

P-gp在人體中分布廣泛，在腸、肝、腎、腦、睪丸、胎盤和眼睛等有分泌功能和排泄功能的上皮細(xì)胞膜上表達(dá)量相對(duì)較高，在人體重要屏障如血腦屏障、血睪屏障、胎盤和血-視網(wǎng)膜屏障的內(nèi)皮細(xì)胞上也有分布[3]，可保護(hù)正常細(xì)胞及組織免受毒性物質(zhì)的損害。P-gp的底物范圍比較廣泛，能夠識(shí)別與轉(zhuǎn)運(yùn)一系列結(jié)構(gòu)多樣的重要內(nèi)源性物質(zhì)（如白三烯和雌激素結(jié)合物）和外源性物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物，包括多種化療藥物[4]?；赑-gp的結(jié)構(gòu)和功能，其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制被廣泛認(rèn)為是P-gp分別與底物及2個(gè)ATP分子結(jié)合后，其中一個(gè)ATP分子發(fā)生水解引起底物結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)象的改變，進(jìn)而導(dǎo)致跨膜結(jié)合域與底物之間親和力急劇下降并釋放、排出藥物，從而導(dǎo)致耐藥[5]。

2 PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)P-gp的調(diào)控機(jī)制

PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞外生存和生長(zhǎng)的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路在多發(fā)性骨髓瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中可過度激活，尤其在耐藥的腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)或過表達(dá)。PI3K由調(diào)節(jié)亞基（p85）和催化亞基（p110）組成，異二聚體p85/p110從細(xì)胞質(zhì)移動(dòng)到細(xì)胞膜上后磷酸化，AKT活化后可激活其下游雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）、NF-κB 激酶抑制劑（inhibitor of nuclear factor κB kinase，IκB）、PTEN 等，調(diào)控耐藥基因 MDR1的表達(dá)。Dong等[6]研究發(fā)現(xiàn)AKT特異性抑制劑MK-2206通過下調(diào)p-AKT、P-gp的表達(dá)水平，逆轉(zhuǎn)MDR，結(jié)果表明PI3K/AKT信號(hào)通路的激活可上調(diào)P-gp的表達(dá)，介導(dǎo)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的耐藥。Liu等[7]發(fā)現(xiàn)PD-L1在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，與PD-1相互作用后可激活PI3K/AKT，反向上調(diào)MDR1/P-gp的表達(dá)，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的MDR。知母皂苷A-Ⅲ、康萊特、苦參堿等多種藥物可通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路在一定程度上逆轉(zhuǎn)MDR，然而由于多條信號(hào)通路之間存在交叉，對(duì)P-gp的調(diào)節(jié)機(jī)制更加復(fù)雜，因此對(duì)于逆轉(zhuǎn)劑的研發(fā)更加困難，可在現(xiàn)有藥物的基礎(chǔ)上進(jìn)行深入研究。

3 MAPK信號(hào)通路對(duì)P-gp的調(diào)控機(jī)制

在腫瘤發(fā)生過程中，MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)可被多種機(jī)制組成性地激活，在各種刺激信號(hào)調(diào)節(jié)P-gp表達(dá)介導(dǎo)MDR發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MAPK信號(hào)通路主要由細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）、c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38 MAPK組成。

ERK1/2在細(xì)胞增殖、分化、黏附、遷移等中發(fā)揮重要作用。大量研究表明ERK1/2的過度激活與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的耐藥性呈正相關(guān)，活化的ERK1/2進(jìn)入細(xì)胞核后可直接激活許多轉(zhuǎn)錄因子，如ETS-1、AP-1（c-Jun或c-Fos）和c-Myc，進(jìn)而促進(jìn)MDR1的表達(dá)，上調(diào)P-gp，參與乳腺癌、肝癌等細(xì)胞MDR的發(fā)生。Ji等[8]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）外泌體中MDR1/P-gp的表達(dá)增加會(huì)導(dǎo)致鈣離子進(jìn)入胃癌細(xì)胞內(nèi)，形成鈣/鈣調(diào)素復(fù)合物，激活鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶（calcium/calmodulin-dependent protein kinases，CaM-Ks）。CaM-Ks的激活可以活化其下游的Raf/MEK/ERK激酶級(jí)聯(lián)，從而使MDR1的表達(dá)上調(diào)，介導(dǎo)MDR的產(chǎn)生，而CaM-Ks磷酸化抑制劑KN-93可以抑制CaM-Ks活化、MDR1的表達(dá)。因此，胃癌細(xì)胞MSCs外泌體是通過蛋白質(zhì)激活CaM-Ks/Raf/MEK/ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)，而不是直接將MDR相關(guān)蛋白或mRNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)參與MDR。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在順鉑耐藥的宮頸腺癌HeLa細(xì)胞中ERK1/2的磷酸化水平降低，P-gp的表達(dá)上調(diào)[9]，這與目前的多數(shù)研究結(jié)果相反。綜上，ERK1/2信號(hào)通路在調(diào)控P-gp的表達(dá)，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞MDR發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用，抑制ERK1/2可在一定程度上逆轉(zhuǎn)MDR，但是其表達(dá)在不同的耐藥腫瘤細(xì)胞中可能呈現(xiàn)相反的水平，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

JNK信號(hào)通路可以被細(xì)胞因子、毒素、藥物和代謝變化等多種刺激激活，參與細(xì)胞分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)，越來(lái)越多的證據(jù)表明JNK與MDR的發(fā)生密切相關(guān)。在5-氟尿嘧啶耐藥的人肝癌細(xì)胞中，JNK信號(hào)通路的激活導(dǎo)致與MDR1基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的c-Jun表達(dá)上調(diào)，而c-Jun是JNK的代表性靶點(diǎn)，可以與c-JunB二聚形成轉(zhuǎn)錄因子AP-1，促進(jìn)MDR1的表達(dá)[10]。在順鉑誘導(dǎo)HepG2耐藥后，發(fā)現(xiàn)P-gp表達(dá)上調(diào)，JNK1/2磷酸化增加，用JNK信號(hào)通路抑制劑SP600125可通過下調(diào)P-gp的表達(dá)增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[11]。同樣，在阿霉素耐藥的胃癌細(xì)胞和長(zhǎng)春新堿耐藥的人結(jié)腸癌細(xì)胞中也有類似的報(bào)道。相反，生脈注射液[12]、鹽酸千金藤堿[13]、抗腫瘤藥物桑根的提取物可通過激活JNK通路，使其下游底物Jun磷酸化水平增加，使耐藥基因MDR1的表達(dá)降低，在一定程度上逆轉(zhuǎn)了胃癌細(xì)胞的MDR。Liu等[14]發(fā)現(xiàn)在常氧狀態(tài)下，JNK途徑激活后增加了c-Jun和MDR1啟動(dòng)子中AP-1位點(diǎn)的結(jié)合，抑制了人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞耐藥基因MDR1的表達(dá)，而在缺氧狀態(tài)下，JNK途徑激活可誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）轉(zhuǎn)移到核內(nèi)后與HIF-1發(fā)生二聚反應(yīng)，進(jìn)而與MDR1啟動(dòng)子中的低氧反應(yīng)元件結(jié)合，使MDR1的轉(zhuǎn)錄增加。綜上，JNK信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的MDR中可能起著雙重作用，這可能與腫瘤類型、凋亡刺激特性、腫瘤微環(huán)境和其他信號(hào)通路的參與有關(guān)，故對(duì)于JNK信號(hào)通路在MDR過程中發(fā)揮的作用須進(jìn)行更深入的研究。

p38 MAPK是典型的蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）磷酸化激活蛋白，MAPKKs對(duì)Thr和Tyr的雙重磷酸化可激活p38 MAPK，然后激活其下游的多個(gè)MDR1基因轉(zhuǎn)錄因子如YB-1、AP-1等，調(diào)節(jié)P-gp的表達(dá)，從而介導(dǎo)MDR的發(fā)生。NF-κB是p38 MAPK下游重要的轉(zhuǎn)錄因子，激活后也可調(diào)節(jié)P-gp的表達(dá)。Luo等[15]報(bào)道p38 MAPK激活引起的NF-κB易位可使慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞MDR1的過表達(dá)和對(duì)伊馬替尼耐藥性的增加，白藜蘆醇能顯著抑制阿霉素耐藥的骨肉瘤細(xì)胞中p38 MAPK（磷酸化）和p65（乙酰化）的表達(dá)水平，使MDR1和P-gp的表達(dá)下調(diào)，逆轉(zhuǎn)骨肉瘤細(xì)胞的阿霉素耐藥[16]。積雪草酸可通過抑制ERK1/2、AKT、p38 MAPK和JNK的磷酸化降低，阻斷YB-1的核轉(zhuǎn)位而導(dǎo)致P-gp表達(dá)水平降低[17]。這些結(jié)果均提示在p38 MAPK信號(hào)通路激活的同時(shí)，其他信號(hào)通路也可能被激活共同參與腫瘤細(xì)胞MDR的發(fā)生，因此，可聯(lián)合使用信號(hào)通路的特異性抑制劑來(lái)逆轉(zhuǎn)MDR，但要注意的是聯(lián)合治療是否會(huì)影響細(xì)胞正常的生理功能。除上述機(jī)制外，p38 MAPK誘導(dǎo)的細(xì)胞外刺激，如氧化應(yīng)激、低滲、紫外線照射和缺氧等，與腫瘤細(xì)胞的MDR有一定關(guān)系[18]，調(diào)控p38 MAPK信號(hào)通路的活性可能會(huì)改善腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)MDR。

4 NF-κB信號(hào)通路對(duì)P-gp的調(diào)控機(jī)制

NF-κB是一個(gè)普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子家族，可被細(xì)胞因子或DNA損傷劑，如化療藥物等刺激激活。在肝癌、大腸癌等腫瘤細(xì)胞中，NF-κB通過銜接蛋白向信號(hào)分子NF-κB激酶（IKKs）傳遞信號(hào)，導(dǎo)致IKKs磷酸化，抑制蛋白IkBα降解，p50/p65核轉(zhuǎn)移，進(jìn)而使NF-κB信號(hào)通路活化，調(diào)節(jié)耐藥基因MDR1的表達(dá)水平。Sun等[19]通過計(jì)算機(jī)序列分析及免疫共沉淀對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)MDR1啟動(dòng)子區(qū)域存在NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)（2324～2315處的GAAATTTCC），NF-kB激活后可能直接與MDR1基因啟動(dòng)子結(jié)合，使P-gp過表達(dá)，導(dǎo)致MDR的產(chǎn)生。

Chen等[20]發(fā)現(xiàn)NF-κB在細(xì)胞中的持續(xù)激活可導(dǎo)致抗凋亡蛋白BCL-2上調(diào)，BCL-2通過反饋機(jī)制下調(diào)IκBα的表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)NF-κB的激活與MDR1的啟動(dòng)子結(jié)合，激活MDR1的轉(zhuǎn)錄并上調(diào)P-gp的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，介導(dǎo)MDR的產(chǎn)生。反之，用NF-κB特異性抑制劑、siRNA技術(shù)靶向干預(yù)NF-κB基因后MDRl、P-gp明顯下降，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡增加[21]。綜上，MDR的發(fā)生是一個(gè)由信號(hào)通路及凋亡和耐藥基因組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)控的，抑制或siRNA技術(shù)靶向干預(yù)NF-κB信號(hào)通路是逆轉(zhuǎn)MDR的重要靶點(diǎn)。

5 其他信號(hào)通路對(duì)P-gp的調(diào)控

除上述經(jīng)典的信號(hào)通路外，其他信號(hào)通路也可以調(diào)控P-gp的表達(dá)介導(dǎo)MDR。Liu等[22]研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)非編碼RNA CCAL可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制AP-2α，進(jìn)而上調(diào)MDR1/P-gp的表達(dá)，誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞產(chǎn)生MDR。Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活也可調(diào)控乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中P-gp的表達(dá)介導(dǎo)MDR。Jeddi等[23]研究發(fā)現(xiàn)MDR1的啟動(dòng)子包含核因子E2相關(guān)因子（NF-E2-related factor 2，Nrf2）的結(jié)合位點(diǎn)，胃癌細(xì)胞中Nrf2過表達(dá)使下游基因MDR1表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致P-gp外排作用增強(qiáng)。STAT3信號(hào)通路抑制后可以逆轉(zhuǎn)胃癌、乳腺癌、肝癌等細(xì)胞的MDR。上述信號(hào)通路調(diào)控P-gp參與MDR的相關(guān)研究相對(duì)較少，可能是目前尚未引起重視，但其在MDR發(fā)生過程中的作用不容忽視，應(yīng)該進(jìn)行深入的研究，可能為逆轉(zhuǎn)MDR提供重要的治療靶點(diǎn)。

6 結(jié)語(yǔ)

MDR是影響腫瘤化療療效的主要因素之一，ABC細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp的過表達(dá)可降低細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度，介導(dǎo)MDR發(fā)生。近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)P-gp的表達(dá)受到一個(gè)或多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)控。因此，了解P-gp相關(guān)信號(hào)通路介導(dǎo)MDR的機(jī)制可能為逆轉(zhuǎn)MDR提供潛在的靶點(diǎn)，為研發(fā)療效顯著的化療藥物提供臨床思路，進(jìn)而提高惡性腫瘤化療療效，改善疾病預(yù)后及提高患者的生存質(zhì)量。