奧卡西平特異性抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖

劉召丹，陳麗樹(shù)，滿江紅

國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850

腦膠質(zhì)瘤是人腦最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤，治療方式主要是手術(shù)切除腫瘤后輔助放療和化療[1]。Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM），惡性程度高，通常對(duì)放化療不敏感，患者生存周期僅1年左右[2]。盡管GBM的治療近年取得一些進(jìn)展，但這類腫瘤發(fā)病率和死亡率仍然很高[3]。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cell，GSC）是膠質(zhì)瘤中一類具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞，具有無(wú)限增殖能力和多項(xiàng)分化潛能，被認(rèn)為與腫瘤的起始、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)[4]。靶向GSC的治療方法將會(huì)有效治療腦腫瘤[5]。

新藥研發(fā)是一個(gè)耗時(shí)且成本昂貴的過(guò)程。與新藥研發(fā)相比，開(kāi)發(fā)已有藥物的新功能具有很多優(yōu)勢(shì)，不僅縮短了研發(fā)周期，而且降低了開(kāi)發(fā)成本[6]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的藥物庫(kù)中的化合物具有較好的生物安全性和明確的靶點(diǎn)信息，應(yīng)用于開(kāi)發(fā)藥物新用途將加快治療藥物的開(kāi)發(fā)速度[7-8]。

奧卡西平（oxcarbazepine）是美國(guó)最近引入的抗癲癇藥物之一，可有效輔助成人和兒童治療，并且可作為成人癲癇的單一療法，與卡馬西平（carbamazepine）相比具有更好的耐受性[9]。此外，研究表明奧卡西平對(duì)于三叉神經(jīng)痛和雙相情感障礙也具有一定的療效[10-11]。本研究表明奧卡西平能夠特異性殺傷GSC，且對(duì)人正常神經(jīng)細(xì)胞影響不大，揭示奧卡西平靶向治療腦腫瘤的潛能，從而為開(kāi)發(fā)藥物新功能提供線索。

1 材料和方法

1.1 材料

人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞（normal human astrocytes，NHA）購(gòu)自蘇州北納保藏中心；人GSC（T3691、T3832、T387、T4121、D456）受贈(zèng)于美國(guó)加州大學(xué)圣迭戈分校Jeremy Rich實(shí)驗(yàn)室，并且所有細(xì)胞在本實(shí)驗(yàn)室都已按照現(xiàn)有方案進(jìn)行了分離與功能鑒定[12-16]。

B-27血清替代物（B-27 Supplement without vitamin A）、Neurobasal培養(yǎng)基（Thermo Fisher公司；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）、左旋谷氨酰胺、丙酮酸鈉、青霉素-鏈霉素雙抗（邁晨科技有限公司）；澳洲進(jìn)口胎牛血清（依科賽生物科技有限公司）；表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）（R&D Systems公司）；細(xì)胞消化液accutase（Sigma-Aldrich公司）；CellTiter-Lumi發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（碧云天生物科技有限公司）；奧卡西平（MCE公司）；FDA批準(zhǔn)的藥物庫(kù)（FDA Approved Drug Library）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所（中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心）。

1.2 培養(yǎng)基配制、細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

1.2.1 培養(yǎng)基配制 向500 mL DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加50 mL澳洲進(jìn)口胎牛血清和5 mL青霉素-鏈霉素雙抗，配制為DMEM完全培養(yǎng)基；向500 mL Neurobasal培養(yǎng)基中添加10 mL血清替代物、5 mL丙酮酸鈉、5 mL左旋谷氨酰胺、5 mL青霉素-鏈霉素雙抗、終濃度為10 μg/L的bFGF和EGF，配制為Neurobasal完全培養(yǎng)基。

1.2.2 GSC的培養(yǎng)和傳代 GSC為懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，采用Neurobasal完全培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)顯微鏡下觀察腫瘤球較大時(shí)，吸取培養(yǎng)皿中的細(xì)胞懸液至離心管中，900 r/min離心3 min棄上清，用生理鹽水重懸細(xì)胞，900 r/min離心3 min棄上清，清洗細(xì)胞表面殘留培養(yǎng)基，用適量accutase重懸細(xì)胞，吹打混勻后靜置3 min，加入生理鹽水稀釋終止消化，900 r/min離心3 min棄上清，用Neurobasal完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至合適的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 NHA的培養(yǎng)和傳代 NHA為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，采用DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度為80%左右時(shí)需要處理，吸去培養(yǎng)上清，加入生理鹽水清洗表面殘留的培養(yǎng)基，棄上清后向培養(yǎng)皿中加入胰蛋白酶，靜置2～3 min至輕輕晃動(dòng)后能觀察到細(xì)胞脫落，或者在顯微鏡下觀察到細(xì)胞懸浮，向培養(yǎng)皿中加入DMEM完全培養(yǎng)基，混勻后反復(fù)吹打幾次轉(zhuǎn)移至新的離心管中，800 r/min離心3 min棄上清，用DMEM完全培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 化合物篩選

購(gòu)買的FDA批準(zhǔn)的藥物庫(kù)中640種化合物以粉末形式置于8個(gè)96孔板中，每種藥物10 mmol，用排槍向各孔藥物粉末中加入10 μL DMSO溶解藥物并混勻；取新的96孔板向?qū)?yīng)的孔中加入2 μL藥物，確保槍尖上無(wú)殘留液體；處理T4121和NHA細(xì)胞后計(jì)數(shù)，用對(duì)應(yīng)的完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至每200 μL含有2000個(gè)細(xì)胞，向96孔板中加入細(xì)胞懸液200 μL，使每孔含有2000個(gè)細(xì)胞，藥物終濃度為10 μmol/L；恒溫培養(yǎng)4 d后高內(nèi)涵明場(chǎng)拍照，根據(jù)細(xì)胞成像進(jìn)行初步篩選。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè)

將奧卡西平用DMSO溶解后用完全培養(yǎng)基稀釋，使終濃度分別為 2.5、5、10、200 μmol/L，加入DMSO的完全培養(yǎng)基為對(duì)照組。向96孔板中加入100 μL完全培養(yǎng)基稀釋的DMSO和不同濃度的奧卡西平，處理不同種類的GSC和NHA，計(jì)數(shù)處理，用對(duì)應(yīng)的完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至每100 μL含2000個(gè)細(xì)胞，向96孔板中加入細(xì)胞懸液100 μL，恒溫培養(yǎng)4 d 后加入 100 μL CellTiter，吹打混勻12～15次后吸出200 μL混合液轉(zhuǎn)移至黑色96孔板，靜置15 min后檢測(cè)熒光值。

2 結(jié)果

2.1 從FDA批準(zhǔn)的藥物庫(kù)中篩選到奧卡西平能夠特異性抑制GSC增殖

首先，我們向上述藥物庫(kù)中的化合物分別加入T4121 GSC和NHA細(xì)胞懸浮液，使藥物終濃度為10 μmol/L，恒溫培養(yǎng)4 d后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行高內(nèi)涵明場(chǎng)拍照。根據(jù)高內(nèi)涵細(xì)胞成像，按照?qǐng)D1所示標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥物庫(kù)進(jìn)行初步篩選，最終篩選出15種化合物（表1）能夠在10 μmol/L濃度下抑制T4121 GSC增殖且對(duì)NHA影響不大。前6種化合物對(duì)于T4121 GSC的殺傷作用更明顯，我們從中選擇了治療癲癇的奧卡西平作為進(jìn)一步研究對(duì)象。

圖1 GSC和NHA生長(zhǎng)狀態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)

2.2 奧卡西平對(duì)多株GSC的特異性抑制作用

用不同濃度的奧卡西平稀釋液分別處理T3691、T3832、T387、T4121、D456 GSC及NHA，培養(yǎng)4 d后檢測(cè)細(xì)胞活力。隨著藥物濃度的增加，奧克西平對(duì)GSC增殖的抑制作用也不斷增加，在濃度為5 μmol/L時(shí)已經(jīng)對(duì)多株GSC增殖起到了非常顯著的抑制效果，且對(duì)正常星形細(xì)胞NHA的抑制作用并不明顯，濃度為10 μmol/L時(shí)這一差別更加顯著（圖2）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明奧卡西平能夠比較特異地抑制GSC的增殖，可能為靶向治療腦腫瘤提供依據(jù)。

2.3 奧卡西平的藥物作用IC50在NHA中高于GSC

用Graphpad軟件計(jì)算奧卡西平小分子化合物在不同細(xì)胞中的半抑制濃度（IC50），結(jié)果如圖3。奧卡西平在NHA中的IC50（32.68 μmol/L）遠(yuǎn)高于GSC（平均值為4.5678 μmol/L），進(jìn)一步證明了奧卡西平特異性抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的潛能。

表1 篩選出的15種能夠特異性抑制GSC增殖的化合物

圖2 不同濃度奧卡西平處理下GSC和NHA的細(xì)胞相對(duì)活力

圖3 奧卡西平在不同細(xì)胞系中的IC50

3 討論

GBM是最常見(jiàn)、惡性程度最高的原發(fā)性腦腫瘤，目前針對(duì)GBM采取的治療方式主要是手術(shù)、放療和化療，但患者的中位生存期仍然小于16個(gè)月[17]。替莫唑胺是常用化療藥物，但作用效果短暫，且只對(duì)部分人有效，因此迫切需要改進(jìn)GBM的治療方法[18]。GSC對(duì)于傳統(tǒng)的癌癥治療方法包括放療和化療都具有很高的抵抗性，并且是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因[4]。靶向GSC的治療方法仍有待進(jìn)一步研究[5]。

奧卡西平是一種新型抗癲癇藥物，是卡馬西平的10-酮基衍生物[19]，與后者相比具有更好的耐受性，肝臟毒性更低，更加值得臨床使用[19-20]。我們通過(guò)對(duì)FDA批準(zhǔn)的藥物庫(kù)進(jìn)行篩選，鑒定到奧卡西平能夠特異性抑制GSC的生長(zhǎng)，且對(duì)人正常神經(jīng)細(xì)胞影響不大。本研究發(fā)現(xiàn)了奧卡西平靶向治療腦腫瘤的潛能，有望實(shí)現(xiàn)舊藥新用，為腦腫瘤的臨床治療提供潛在的新策略和新方法。