肉類微生物多樣性分析方法的研究進展

甄宗圓，胡雪潔，徐留艷，王藝霖，牛璽程

(1.安徽科技學院 食品工程學院，安徽 滁州 233100； 2.棗莊學院 食品科學與制藥工程學院，山東 棗莊 277160； 3.南昌大學 南昌大學中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047)

肉及肉制品中的微生物來源廣泛，種類繁多，包括細菌、真菌和病毒等。所謂微生物多樣性，是指一個集合群落中，眾多不同類型微生物的變化以及它們之間相對的豐度[1]。在發(fā)酵肉制品中，由于微生物的作用,肉制品中的大分子物質被降解，使發(fā)酵肉制品營養(yǎng)物質更易被吸收,且蛋白質和脂肪適度水解氧化呈現(xiàn)出特殊發(fā)酵風味[2]。我國肉產業(yè)已連續(xù)20年穩(wěn)居世界第一，肉類產量呈總體上升趨勢[3]。由微生物引起的腐敗變質造成的經濟損失巨大，而且被致病性微生物污染的肉及肉制品會對消費者的健康造成威脅。因此，研究肉及肉制品微生物多樣性在特定腐敗菌抑制技術研究、保障肉類產品品質和消費者安全等方面意義重大。本文中，筆者對肉類微生物多樣性分析方法進行綜述，為開展肉類微生物多樣性研究提供技術資料。

1 肉及肉制品中微生物的來源

對健康的動物來說，屠宰時肌肉組織內部幾乎是無菌的。但是，屠宰后的鮮肉卻或多或少地含有多種微生物，造成這種微生物污染的原因一般認為有兩個方面，即內源性污染和外源性污染[4]。內源性污染是指來自動物體內的微生物造成的污染。在活的動物體內，淋巴結、呼吸道和腸道等部位均含有大量微生物。在屠宰動物時，這些微生物都有可能越過組織屏障進入肌肉組織內部造成污染。外源性污染是指動物在屠宰、加工、運輸直到消費的整個過程中，由于用具、操作人員和環(huán)境的不潔等因素造成的微生物污染。外源性污染是肉類微生物污染的主要來源。肉品被微生物污染后引起的食源性疾病和食品腐敗變質是影響食品安全的最主要因素。此外，在發(fā)酵肉制品中為了確保產品的風味特色、質量，縮短生產周期，也會采用人工接種的方法。

2 肉類微生物多樣性分析方法

2.1 傳統(tǒng)方法

傳統(tǒng)的微生物分析方法依賴于培養(yǎng)基的培養(yǎng)、分離和鑒定，根據微生物的形態(tài)特征、生理生化反應特征、生態(tài)學特征以及血清學反應等作為鑒定依據，是過去進行微生物分析的唯一途徑。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法多用于研究自然或人為因素對肉類微生物多樣性的影響[5]，Pereira等[6]采用選擇性培養(yǎng)基，結合必要的生理生化反應的方法，對冷藏條件下不同包裝形式的兔胴體取樣，進行中溫好氧菌、嗜冷好氧菌、假單胞菌、乳酸菌、酵母菌、霉菌和腸桿菌科的培養(yǎng)分離和菌落計數，以確定不同包裝形式的優(yōu)勢菌，并以106cfu/g作為可接受限度，判定不同包裝形式兔胴體的貨架期。Rodríguez-Calleja等[7]也采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的方法，研究在(3±1) ℃有氧儲存期間兔胴體微生物種類和豐度變化，發(fā)現(xiàn)當需氧菌、嗜冷菌和假單胞菌的平均數量為108cfu/g左右時，胴體開始腐敗，貨架期被評估為大約6.8 d。Lan等[8]也采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的方法，使用平板計數瓊脂分別對-4、-2.5和4 ℃溫度下貯藏的伊拉兔胴體(雄)的菌落總數進行了測定，研究兩種超冷溫度對兔肉品質的影響。

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法在確定受自然和人為影響的環(huán)境中微生物群落結構方面是非常有用的[5]，然而，它們也有一定的局限性。例如，細菌在受到饑餓、溫度驟變、壓力、非最佳鹽度和酸堿度等環(huán)境因素影響時，會失去生長的能力，轉而進入一種活而不長(VNC)的狀態(tài)[9]。在這種狀態(tài)下，細菌的代謝活動和生長速率減慢，在常規(guī)的細菌培養(yǎng)基上不再能檢測到它[10]，無法全面評估微生物群落的多樣性。同時利用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法進行細菌鑒定，研究微生物對肉類腐敗的影響，只有不到1%的微生物可以被識別[11]。

2.2 分子生物學方法

隨著現(xiàn)代分子生物學技術的快速發(fā)展，變性梯度凝膠電泳(DGGE)、實時熒光定量PCR(RT PCR)和高通量測序(HTS)已廣泛應用于肉類微生物多樣性的研究，為研究肉類微生物群落結構和功能基因組提供了新的方法。

2.2.1 DGGE在肉類微生物多樣性研究中的應用

DGGE方法基于將16S rRNA特定區(qū)域進行聚合酶鏈式反應(PCR)，得到長度相同而堿基組成不同的片段，然后在凝膠中通過線性增加變性梯度，使不同序列的擴增產物分離。其原理是通過16S rRNA基因在含有梯度變性化合物配制的聚丙烯酰胺凝膠中的序列特異性融點不同實現(xiàn)的，部分解鏈的16S rRNA分子在凝膠中基本停止遷移，而完全螺旋形式的分子繼續(xù)向前移動，這樣不同的片段就被有效分離[12-13]。染色后，根據電泳條帶的多寡和條帶的位置可以快速辨別出樣品中微生物的種類和相對豐度，與GenBank中的標準序列比對可獲得它們的遺傳相關性[14]。

我國有多位學者應用此技術對肉類貯藏期間微生物多樣性進行研究。任靜等[15]應用PCR-DGGE 技術結合常規(guī)平板培養(yǎng)，對托盤包裝和真空包裝兩種包裝形式的調理預制烤豬肉在4 ℃貯藏期間微生物的生長特性進行研究，結果表明：托盤包裝的樣品在貯藏末期時的電泳條帶明顯比真空包裝的樣品更粗、更亮，表明真空包裝的樣品腐敗菌數量少于托盤包裝的樣品，并提出平板培養(yǎng)結合PCR-DGGE方法可使調理預制烤豬肉冷藏過程中微生物生長特性的測定結果更為準確、全面。牟廣磊[16]在提取不同處理組冷卻牛肉中細菌總DNA后，對16S rRNA基因的V3可變區(qū)進行PCR-DGGE分析，結合割膠測序，分析圖譜得到以下結果：在4 ℃貯藏條件下，圖譜中條帶種類和條帶明亮程度都會隨著時間的延長而發(fā)生比較明顯的變化，說明在貯藏期間微生物群落的種類和豐度發(fā)生變化。

2.2.2 RT PCR在肉類微生物多樣性研究中的應用

RT PCR定量檢測是指向反應體系中加入熒光基團，在PCR指數擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號的強弱變化，實時監(jiān)測特異性產物的量，最后通過標準曲線對目的基因進行定量分析的過程[17-18]。Rouger等[19]采用RT PCR技術對雞腿菌群的DNA進行擴增，將其與16S rDNA焦磷酸測序得到的結果進行對比，最終確定熱殺索絲菌(Brochothrixthermosphacta)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)和肉食桿菌屬(Carnobacteriumsp.)為雞腿的優(yōu)勢菌。該研究證實了RT PCR對目標微生物進行定量分析的優(yōu)勢。

2.2.3 HTS在肉類微生物多樣性研究中的應用

HTS又稱“第二代測序技術”或“深度測序技術”，是新興發(fā)展起來的免培養(yǎng)分子生物學技術，依賴于對樣本中存在的細菌16S rRNA、真菌18S rRNA或ITS(internal transcribed spacer)特定區(qū)域的部分擴增，可一次性對幾十萬到幾百萬條的DNA分子進行序列測定[20]，能夠同時分析多個樣品，被廣泛應用在動態(tài)監(jiān)測食品發(fā)酵過程中微生物多樣性和群落結構組成的研究中。高通量測序技術分析食品微生物群落的主要操作流程包括：①樣品中微生物總DNA或RNA提??；②引物選擇和PCR擴增；③測序；④生物信息學分析，包括操作分類單元(OTU)聚類、物種分類和多樣性分析[21]。

高通量測序主要包括ABI SOLiD連接酶測序、Roche 454 Life Sciences焦磷酸測序和Illumina Solexa聚合酶測序。在肉類產品微生物多樣性研究中，廣泛應用的是Roche 454 Life Sciences焦磷酸測序(特別是454 FLX技術)和Illumina Solexa聚合酶測序(特別是MiSeq技術)。近年來在發(fā)酵香腸微生物多樣性研究中普遍使用Illumina Solexa聚合酶測序，如Quijada等[22]在Illumina MiSeq平臺對萊昂香腸的原料肉及香腸發(fā)酵過程中微生物多樣性進行了分析。Wang等[23]也利用HTS技術在Illumina MiSeq平臺對薩拉米香腸的細菌和真菌生態(tài)系統(tǒng)進行了分析，細菌覆蓋率在0.99以上，真菌覆蓋率為0.96，說明大多數的微生物系統(tǒng)類型被檢測到，并提出高通量測序是評價發(fā)酵香腸中微生物多樣性和監(jiān)測食源性病原體的有效工具。Wang等[24]在另一篇報道中首次通過高通量測序，在Illumina MiSeq平臺研究了薩拉米香腸、中國干腌香腸和中國熏制香腸的細菌多樣性和組成。這些技術是將片段化的基因進行接頭連接形成單鏈，用不同的方式進行PCR擴增產生更多的單分子序列，隨后通過引物雜交和酶的延伸實現(xiàn)序列的測定，檢測每一步反應所產生的信號來獲得測序數據，最后由計算機分析獲得完整的序列信息[25-26]。由于各測序平臺測序原理不同，所以在測序深度、讀長、運行時間、錯誤類型以及測序成本等方面均有一定的差異。ABI SOLiD連接酶測序讀長最短(50 bp)，但其創(chuàng)新之處在于雙堿基編碼的應用，極大地降低了測序的錯誤率，由于其雙堿基編碼和校正系統(tǒng)原理與重測序相似，因此該測序平臺多應用于具有高質量參考基因序列物種的重測序，而很少應用于微生物生態(tài)學的研究[27]。Roche 454 Life Sciences焦磷酸測序的序列讀長在3種測序平臺中最大(600～1 000 bp)，但其測序通量最低(0.5～1.0 GB)、測序費用較高[28]。Illumina Solexa聚合酶測序平臺目前主要有HiSeq技術和MiSeq技術[29]，盡管Illumina與454測序技術相比，讀長短，但測序通量較高，且最新版本增加了讀長和測序通量，在單次測序運行中能夠完全分析數十個樣品[30]，已廣泛應用于發(fā)酵肉制品和調理肉制品微生物的研究(特別是MiSeq技術)，極大地改變了人們對肉類微生物學的認識，是評價肉類微生物多樣性和監(jiān)測食源性病原體的有效工具[11,19,23,31-33]。在未來幾年HTS將可能有效地檢測以前沒有從食物中獲取的物種，并且闡明其可能的功能和作用，但不是替代基于培養(yǎng)的方法。

HTS技術也被應用于分析肴肉、冷藏牛肉和法國雞肉切片的微生物多樣性。肖英[31]將傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)法與基于宏基因組學的焦磷酸測序技術相結合，對真空包裝水晶肴肉在4 ℃、30 d貯藏期內微生物的多樣性和動態(tài)變化進行研究，細菌純培養(yǎng)的方法共分離鑒定出真空包裝水晶肴肉在貯藏期內26個屬的36種細菌，而焦磷酸測序法共鑒定出169個屬的細菌，53 363個有效序列，能夠提供關于細菌群落變化更豐富和更準確的數據。Zhang等[32]同樣以真空包裝的肴肉為研究對象，在Illumina平臺DNA測序后評估微生物群落的多樣性和相對豐度，最初，芽孢桿菌科(Bacillaceae)是最主要的類群，平均豐度為62.5%，隨后，由于細菌間競爭導致的生長抑制，豐度急劇下降。腸桿菌科(E￣n￣t￣e￣r￣o￣b￣a￣c￣t￣e￣r￣i￣a￣c￣e￣a￣e)和莫拉氏菌科(Moraxellaceae)，除了0 d檢出率都很高，在試驗儲存期結束時達到70.5%。腸桿菌科的相對豐度在整個實驗儲存期間持續(xù)增加，并且在22～30 d穩(wěn)定，達到約45%的水平。上述結果表明，肴肉是腸桿菌科的良好基質，由此家族引起的污染是肴肉貯藏過程中的常見問題。Yang等[33]通過高通量測序評估了在改良氣調包裝(MAP)中冷藏牛排的微生物群落，測序數據經質量過濾，80% O2-MAP和CO-MAP的冷藏牛排分別獲得38 490和38 474個優(yōu)質序列，這些序列被分別聚類到681和716個不同的OTUs中；B.thermosphacta和Pseudomonasspp.是80%O2-MAP牛排的優(yōu)勢菌，假單胞菌屬從第10天起逐漸超過前者，明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳酸菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、徘徊球菌屬(Vagococcus)和沙雷氏菌屬(Serratia)在CO-MAP牛排中交替占優(yōu)勢，乳球菌最終成為最常見的細菌。

3 各種分析方法的特點和比較分析

傳統(tǒng)微生物分析方法存在一定的局限。如，細菌處在營養(yǎng)物質不足，非最佳溫度、鹽度和酸堿度的環(huán)境中時，會失去生長的能力，轉而進入一種“viable but non-culturable”狀態(tài)[9-10]。在這種狀態(tài)下，細菌的代謝活動和生長速率減慢，在常規(guī)的培養(yǎng)基上不再能檢測到，因此，無法全面評估微生物群落的多樣性。也有研究表明利用傳統(tǒng)方法進行細菌鑒定，只有不到1%的微生物可以被識別[34]。

分子生物學方法的興起，克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)的缺點，使微生物多樣性分析取得長足的進步。PCR-DGGE技術因不依賴于常規(guī)培養(yǎng)，檢測極限低，能檢測到難以培養(yǎng)或不能培養(yǎng)的微生物，發(fā)現(xiàn)一些原來沒有被檢測到的微生物，且儀器的成本相對較低，具有操作簡單、快捷和重復性好等特點，在肉類微生物多樣性分析中得到廣泛應用[35-36]。然而，由于低分辨率(只能分離<500 bp的小片段)，背景干擾以及基于帶強度定量數據[37]，使PCR-DGGE極可能低估微生物的物種組成并高估其豐度。

HTS與PCR-DGGE相比，檢測靈敏度高，其應用到微生物生態(tài)學研究為認識微生物多樣性及其生態(tài)功能提供了更加有利的手段。Poka等[38]以薩拉米香腸為研究對象，在提供相同樣本16S rRNA可變區(qū)的條件下，比較HTS(Illumina MiSeq平臺)和PCR-DGGE兩種方法分析薩拉米香腸成熟過程中的微生物群落變化，結果表明HTS以更好的分辨率檢測到由PCR-DGGE鑒定的物種，也檢測到不被PCR-DGGE所識別的物種。盡管HTS能快速高效地對微生物多樣性進行分析，但該技術的儀器設備昂貴、測序成本較高，由PCR擴增產生的嵌合序列在數據優(yōu)化過程中不能得到有效的去除及16S rDNA序列的高保守性，使HTS仍存在著難以區(qū)分在物種甚至屬水平OTU的問題。RT PCR技術可以測定樣品中特定微生物的具體數量，彌補了高通量測序只能獲得樣品中微生物相對豐度這一缺點，但為確保從樣品中分離得到的DNA來自活細胞，基于培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法是不可缺少的。

4 展望

HTS在微生物多樣性研究中的最新進展正在徹底改變人們對肉類微生物群落的評估和理解，特定區(qū)域的擴增結合高通量測序生成的數百萬條讀長，具有覆蓋全部微生物的潛力，并且能夠更深層次地研究群落中物種之間復雜的相互作用。肉類精深加工和新產品的研發(fā)與推廣逐漸展開，肉類微生物多樣性分析迫在眉睫。因此，每種方法都有其獨特的優(yōu)勢和不足之處，只有將多種方法結合起來，才能較為客觀全面地反映微生物種類、相對豐度和動態(tài)變化的真實信息，這將為肉及肉制品保鮮技術研究、貨架期預測鑒定提供理論基礎，有利于推動我國肉產業(yè)的發(fā)展。