糖尿病小鼠的周圍神經(jīng)病變檢測(cè)*

趙鉞沁 楊麗芬 周怡昆

(1. 昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650504)(2. 云南省第一人民醫(yī)院 昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌代謝科，昆明 650032)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是以持續(xù)高血糖為特征的代謝紊亂而損害周圍神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，是最常見(jiàn)的糖尿病慢性并發(fā)癥之一[1-3]。其危害性遠(yuǎn)高于糖尿病本身，高達(dá)50%的糖尿病患者深受其害，病情嚴(yán)重甚至?xí)職堉滤繹4-5]。由于DPN發(fā)病機(jī)制不明，尚缺乏特異性病因治療方法[6-7]。

人體和動(dòng)物在糖尿病前期就可能并發(fā)周圍神經(jīng)病變[8]。嚙齒動(dòng)物模型在糖尿病有關(guān)研究中應(yīng)用普遍，DPN動(dòng)物模型則是糖尿病動(dòng)物模型隨病情進(jìn)展而成。由于技術(shù)的進(jìn)步，價(jià)格低廉、生長(zhǎng)周期短且容易操作的小鼠逐漸成為研究DPN發(fā)生發(fā)展并評(píng)估潛在療法的重要工具，但相應(yīng)的診斷方法尚無(wú)通用標(biāo)準(zhǔn)。目前，關(guān)于糖尿病小鼠神經(jīng)病變的實(shí)驗(yàn)性文章較多，但鮮見(jiàn)描述檢測(cè)神經(jīng)病變方法的文獻(xiàn)。本文針對(duì)糖尿病小鼠模型和相關(guān)的神經(jīng)病變檢測(cè)方法進(jìn)行論述，旨在為進(jìn)行糖尿病小鼠神經(jīng)病變研究的科研人員提供參考。

1 糖尿病小鼠模型

糖尿病常見(jiàn)類型包括以胰島素缺乏為特征的1型糖尿病和以胰島素抵抗為特征的2型糖尿病，神經(jīng)病變多發(fā)于1型和2型糖尿病[9-10]。1型糖尿病患者常見(jiàn)小纖維損傷，而2型糖尿病患者常見(jiàn)大纖維損傷。一直以來(lái)，糖尿病動(dòng)物模型首選大鼠，但近年來(lái)小鼠的使用也越加廣泛。臨床上，雖然2型糖尿病患者居多，基礎(chǔ)研究卻多見(jiàn)于1型糖尿病小鼠模型。不過(guò)，兩種類型的糖尿病小鼠模型神經(jīng)病變癥狀相似，如神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢、熱痛過(guò)敏等[11]。然而，同一糖尿病類型的小鼠也會(huì)因品系、性別、造模方法的不同而出現(xiàn)疾病進(jìn)程和癥狀差異。

糖尿病小鼠模型來(lái)源多樣，如自發(fā)性模型、藥物造模、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等。自發(fā)性糖尿病小鼠模型(如NOD小鼠、ob/ob小鼠等)和轉(zhuǎn)基因模型的使用受到成本限制。而藥物誘導(dǎo)形成的糖尿病小鼠模型經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、操作簡(jiǎn)便，是研究糖尿病及其并發(fā)癥的重要載體。糖尿病造模的常用藥物為四氧嘧啶(ALX)和鏈脲佐菌素(STZ)，其機(jī)理都是選擇性破壞胰島β細(xì)胞擾亂機(jī)體代謝從而引發(fā)持續(xù)性高血糖。ALX建立的模型穩(wěn)定性差、模型死亡率高。相較之下，作用溫和、毒性小且模型存活率高的STZ使用更為廣泛[12]。STZ可以快速有效地誘發(fā)小鼠糖尿病，但單一的STZ注射誘導(dǎo)的模型與人類1型糖尿病病理特征和臨床癥狀更為相似[13]。高脂飲食是建立胰島素抵抗和肥胖的常見(jiàn)方法，聯(lián)合STZ使用能夠復(fù)制出符合2型糖尿病特點(diǎn)的小鼠模型[14-15]。但是，STZ的藥效有較大的批間差異，使用STZ需要設(shè)計(jì)完整合理的實(shí)驗(yàn)并謹(jǐn)慎操作以保證其藥效的發(fā)揮，從而降低糖尿病小鼠的成模率、存活時(shí)長(zhǎng)、胰島細(xì)胞損害以及神經(jīng)病變進(jìn)展的差異性。

2 感覺(jué)功能檢查

目前，普遍認(rèn)為糖尿病性神經(jīng)疼痛是周圍神經(jīng)病變?cè)斐傻?，尤其糖尿病?dòng)物模型的神經(jīng)病變主要特征是周圍神經(jīng)功能受損[6]。研究顯示，少數(shù)糖尿病患者和部分DPN患者有疼痛癥狀[1]。人類糖尿病初期一般呈現(xiàn)痛覺(jué)過(guò)敏，到DPN臨床期發(fā)展為痛覺(jué)減退[6]。糖尿病小鼠也有類似現(xiàn)象，并且出現(xiàn)痛覺(jué)減退的速度更快[10-11]。糖尿病患者痛覺(jué)異常可能與大的有髓鞘A-纖維和小的無(wú)髓鞘C-纖維損害有關(guān)[16]。但由于糖尿病不同階段的神經(jīng)病變程度不同，患者感覺(jué)過(guò)敏或減退的潛在機(jī)制尚不明確。糖尿病早期，針刺、溫度等不引起疼痛的正常刺激都可能誘發(fā)患者感覺(jué)異常，糖尿病小鼠也有相似情況。糖尿病小鼠感覺(jué)功能的評(píng)價(jià)方法多種，最常用的是觸覺(jué)和溫度覺(jué)的檢查。

2.1 觸覺(jué)檢查

觸覺(jué)檢查是基于對(duì)輕觸覺(jué)敏感的大的有髓鞘Aβ-纖維和對(duì)疼痛感知有關(guān)的小的無(wú)髓鞘C-纖維的檢查。糖尿病動(dòng)物模型呈現(xiàn)強(qiáng)烈的觸覺(jué)異常疼痛，類似人類糖尿病患者常抱怨的觸壓不適[3, 17]。糖尿病小鼠發(fā)病后2～4周對(duì)Von Frey探針刺激的敏感性增加，到后期敏感性逐漸降低[18]。Von Frey法類似于臨床常用的Semmes Weinstein單絲檢查[19]，通過(guò)糖尿病小鼠的機(jī)械刺激敏感度評(píng)估觸覺(jué)狀態(tài)。手動(dòng)Von Frey法以探針配合鑿孔工作臺(tái)，垂直刺激小鼠的足底。通過(guò)改變探針的粗細(xì)或伸出長(zhǎng)度調(diào)整刺激力度，記錄小鼠出現(xiàn)縮足反射的時(shí)間(即潛伏期)和刺激力度(即閾值)[20-21]。潛伏期較短為機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏，潛伏期延長(zhǎng)即為機(jī)械痛覺(jué)減退。電子von Frey觸痛儀也能獲得相似結(jié)果且檢測(cè)快速、不受探針尺寸的限制[22]，但是尚不清楚與手動(dòng)Von Frey法所測(cè)參數(shù)是否一致[11]。手動(dòng)Von Frey法雖然有效合理，但是精確性不足且操作費(fèi)時(shí)[23]，電子von Frey觸痛儀可能會(huì)成為觸覺(jué)檢測(cè)的主要工具。

2.2 溫度覺(jué)檢查

糖尿病患者周圍神經(jīng)病變臨床特征明顯之前就已出現(xiàn)溫度覺(jué)異常。STZ-大鼠誘發(fā)糖尿病后1～3周即表現(xiàn)出熱痛過(guò)敏[24]，而小鼠多觀察到熱痛減退[11]。雖然溫度覺(jué)異常與糖尿病患者的慢性疼痛無(wú)關(guān)，但輕度DPN患者普遍伴有該癥狀。而且，當(dāng)患者神經(jīng)病變癥狀顯著時(shí)，周圍神經(jīng)多半已發(fā)生不可逆的病理改變。因此，檢查機(jī)體對(duì)溫度刺激的反應(yīng)對(duì)DPN早期診斷意義重大。常用的糖尿病小鼠溫度覺(jué)檢查方法有四種：①甩尾法，將熱源施加于小鼠尾尖，其尾巴從一側(cè)轉(zhuǎn)移至另一側(cè)的時(shí)間即為潛伏期[6]；②Hargreaves法，與甩尾實(shí)驗(yàn)相似，唯一的不同是熱源施加在后爪，觀察小鼠后爪抬起的時(shí)間[8, 20]；③熱板法，先校準(zhǔn)熱板(50±5)℃，使正常小鼠在10 s內(nèi)發(fā)生縮足反射。然后，將糖尿病小鼠放至熱板，記錄其暴露于熱板產(chǎn)生舔足、縮足等反射的時(shí)間[4, 6]；④冷板法，與熱板法的差異在于溫度，冷板溫度一般在4 ℃左右，有人認(rèn)為最佳溫度為5 ℃[6, 25]。雖然糖尿病患者神經(jīng)損傷時(shí)存在冷、熱覺(jué)異常，但熱刺激比冷刺激更具優(yōu)勢(shì)。傷害性熱閾值的測(cè)定多用甩尾法和熱板法，而熱板能精確設(shè)置多種溫度環(huán)境且小鼠能自由活動(dòng)，減少了干擾和誤差。因此，多采用熱板法判斷糖尿病小鼠的溫度覺(jué)損害。不過(guò)，快速和慢速的溫度感覺(jué)傳導(dǎo)分別由Aδ-纖維和C-纖維負(fù)責(zé)，單一的溫度感知實(shí)驗(yàn)不能完全詮釋溫度覺(jué)異常，因此多種方法聯(lián)用可能更具參考價(jià)值。

3 神經(jīng)電生理

神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)減慢是糖尿病患者早期神經(jīng)功能紊亂的特征之一[26]，糖尿病動(dòng)物NCV也有不同幅度的降低[27]。神經(jīng)電生理是通過(guò)NCV診斷周圍神經(jīng)病變的金標(biāo)準(zhǔn)，也是DPN檢查的重要手段[28]。NCV檢查包括三種方法[29]：①體內(nèi)直接檢測(cè)，將經(jīng)藥物麻醉的糖尿病小鼠固定，刺激電極插入其后肢坐骨神經(jīng)切口，在同側(cè)坐骨神經(jīng)處的踝關(guān)節(jié)插入記錄電極，并將參考電極置于刺激和記錄電極之間，通過(guò)脈沖波刺激神經(jīng)，記錄小鼠產(chǎn)生的復(fù)合動(dòng)作電位[4, 30]；②體內(nèi)間接檢測(cè)，與體內(nèi)直接檢測(cè)的不同在于，記錄和刺激電極均作刺激電極，并將記錄電極置于小鼠腳趾第一骨間肌肉處[29]；③離體直接檢測(cè)，解剖小鼠分離坐骨神經(jīng)。刺激電極置于坐骨神經(jīng)結(jié)節(jié)處，記錄電極置于踝關(guān)節(jié)處，參考電極位于其他兩種電極之間[31]。

神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)檢測(cè)廣泛用于疾病診斷和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，促使該法在糖尿病小鼠神經(jīng)病變研究中得以推廣。糖尿病小鼠發(fā)病后可見(jiàn)NCV異常[32]，并且發(fā)生神經(jīng)傳導(dǎo)功能障礙的速度很快。隨著糖尿病小鼠存活時(shí)間延長(zhǎng)還呈現(xiàn)輕微的結(jié)構(gòu)異常，這可能是糖尿病患者神經(jīng)病變顯著的前兆[17]。然而，DPN早期多累及小纖維神經(jīng)，甚至早于大纖維受損或電生理證據(jù)。NCV只能反映大神經(jīng)纖維的功能狀態(tài)，對(duì)小神經(jīng)纖維及無(wú)髓鞘神經(jīng)纖維的病變不敏感，這也造成了 DPN 臨床檢出率偏低[9]。所以，單純的神經(jīng)傳導(dǎo)功能完好難以排除DPN的存在。而且，DPN是動(dòng)態(tài)的進(jìn)行性疾病且多發(fā)于急性代謝紊亂期，多種神經(jīng)功能損傷都是可逆的，并且人體與動(dòng)物NCV異常的發(fā)生機(jī)制可能不同，因此糖尿病小鼠NCV檢測(cè)的參考價(jià)值還有待商榷。

4 病理學(xué)檢查

DPN發(fā)病率高且起病隱匿，其病理變化與臨床表現(xiàn)往往不一致。進(jìn)行性結(jié)構(gòu)異常是DPN患者的主要病理學(xué)特征如軸突變性，引發(fā)多種臨床體征和癥狀如疼痛、麻木和感覺(jué)異常[1, 9]。DPN發(fā)展涉及神經(jīng)元、雪旺細(xì)胞和神經(jīng)纖維的喪失或退化等[17]，糖尿病小鼠的神經(jīng)病變研究也有類似發(fā)現(xiàn)。病理學(xué)檢查是評(píng)價(jià)DPN病情的標(biāo)準(zhǔn)之一，坐骨神經(jīng)、足部皮膚和背根神經(jīng)節(jié)(DRG)是研究糖尿病小鼠神經(jīng)病變病理改變的常用樣本。

正常的坐骨神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維髓鞘均勻密集、結(jié)構(gòu)完整、排列規(guī)則而層次分明，且軸索功能完好、神經(jīng)絲豐富，神經(jīng)內(nèi)膜結(jié)構(gòu)正常。糖尿病小鼠隨著病情發(fā)展，坐骨神經(jīng)逐漸出現(xiàn)組織學(xué)損傷如有髓神經(jīng)纖維分布稀疏、神經(jīng)內(nèi)膜水腫和軸突變性等，甚至某些神經(jīng)肽物質(zhì)如P物質(zhì)水平顯著下降[33]。通過(guò)HE染色、甲苯胺藍(lán)染色等便可觀察坐骨神經(jīng)的病理變化[34-35]，但很難明確定量有結(jié)節(jié)區(qū)域的神經(jīng)纖維變化。

泛神經(jīng)元標(biāo)記物PGP 9.5為神經(jīng)元和神經(jīng)纖維特異性標(biāo)記蛋白，能夠診斷小神經(jīng)纖維損傷，其免疫反應(yīng)顯示糖尿病患者神經(jīng)纖維明顯變薄[36]。對(duì)足底皮膚的檢測(cè)常用PGP 9.5抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)表皮神經(jīng)纖維(IENF)的可視化和定量檢查[20]。人類IENF密度降低與振動(dòng)覺(jué)等神經(jīng)功能障礙及神經(jīng)病變程度相關(guān)。在糖尿病小鼠發(fā)病后2～8周也可見(jiàn)IENF顯著減少， IENF丟失可能是DPN早期指標(biāo)[33, 37]。有人提出IENF損失造成熱覺(jué)喪失，但I(xiàn)ENF的完整性與痛覺(jué)異常的一致性，還有待驗(yàn)證[33]。

DRG是痛覺(jué)傳入的初級(jí)神經(jīng)元，影響著不同形式感覺(jué)(痛覺(jué)/溫覺(jué)/觸覺(jué))的傳遞。DRG神經(jīng)元異常可能是糖尿病患者并發(fā)DPN的原因。糖尿病小鼠神經(jīng)病變?cè)缙?，DRG便有神經(jīng)元細(xì)胞損傷，并隨病程延長(zhǎng)而加重[38]。諸多糖尿病性神經(jīng)病變實(shí)驗(yàn)也顯示糖尿病小鼠的DRG部分細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元丟失[39]，可能與痛覺(jué)減退有關(guān)。TdT原位細(xì)胞凋亡法、HE染色等能夠檢測(cè)DRG神經(jīng)元細(xì)胞的改變[40]。此外，轉(zhuǎn)錄激活因子3(ATF3)是神經(jīng)損傷的神經(jīng)元標(biāo)記物，現(xiàn)已廣泛作為DRG受損的指標(biāo)，可以通過(guò)免疫染色檢查其表達(dá)情況，進(jìn)而評(píng)價(jià)初級(jí)感覺(jué)傳入纖維的應(yīng)激水平[41-42]。

5 運(yùn)動(dòng)功能檢查

DPN患者早期并無(wú)明顯運(yùn)動(dòng)缺陷[43]，運(yùn)動(dòng)障礙多數(shù)在疾病后期出現(xiàn)甚至伴有嚴(yán)重病態(tài)包括足部或腳踝骨折易感性、足潰瘍和截肢，引起步態(tài)異常和肢體不協(xié)調(diào)[19, 44-45]。糖尿病小鼠運(yùn)動(dòng)功能檢查常用方法有步行軌跡法、斜坡試驗(yàn)和轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)三種。

坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)是評(píng)估周圍神經(jīng)功能的常用參數(shù)，經(jīng)藥物治療后糖尿病大鼠的SFI改善明顯[46]。步行軌跡法基于動(dòng)物足跡來(lái)獲取SFI進(jìn)而評(píng)估坐骨神經(jīng)功能，以不同顏色的液體對(duì)糖尿病小鼠前后爪著色，將其放在鋪有固定尺寸的白紙的行走箱中自由行走[46]。測(cè)得小鼠腳趾展開度、腳趾間距離、足跡長(zhǎng)度等步態(tài)參數(shù)通過(guò)Bain公式來(lái)計(jì)算SFI了解其神經(jīng)功能狀態(tài)[47]。該法操作簡(jiǎn)單，但依賴于有色液體和紙張獲得足跡，易產(chǎn)生偽足跡、變形足跡，難以獲得精確數(shù)據(jù)和動(dòng)態(tài)步態(tài)信息。Fricker等自制一套SFI紅外線評(píng)估系統(tǒng)，通過(guò)紅外裝置和相機(jī)捕捉動(dòng)物的足跡。該系統(tǒng)價(jià)格低廉還能使SFI數(shù)字化，并提供糖尿病鼠的動(dòng)態(tài)足跡，降低實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用量[48]。不過(guò)，這一儀器尚未普及，實(shí)驗(yàn)效果有待考查。

斜坡運(yùn)動(dòng)是通過(guò)小鼠在一定角度的斜坡上保持平衡的時(shí)間來(lái)研究四肢運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損傷程度和治療時(shí)期的體位維持能力的方法。設(shè)計(jì)一定尺寸的玻璃水槽，在其內(nèi)部鋪蓋粗糙橡膠墊。將糖尿病小鼠置于水槽中間，其身體軸線垂直于橡膠墊斜坡3～5 min，使之適應(yīng)環(huán)境。然后，勻速調(diào)整橡膠板來(lái)改變斜坡角度，記錄小鼠滑動(dòng)2 cm和保持體位5 s的最大傾斜角度，從而評(píng)價(jià)小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力[49]。

Heyser等曾用轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)檢測(cè)可卡因?qū)π∈筮\(yùn)動(dòng)能力的影響[50]。糖尿病小鼠的轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)表現(xiàn)正常，表明其無(wú)運(yùn)動(dòng)缺陷[11]。轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)是檢測(cè)糖尿病小鼠肢體協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)最常用的方法[45]。轉(zhuǎn)棒是懸掛于基座的系列圓桿，正常小鼠在圓桿上轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)分鐘，而糖尿病小鼠神經(jīng)病變后可能出現(xiàn)協(xié)調(diào)能力缺陷，容易從圓桿跌落，小鼠的跌落時(shí)間可以評(píng)價(jià)其神經(jīng)病變的嚴(yán)重程度。

6 角膜觀察

角膜共聚焦顯微鏡觀察角膜神經(jīng)狀態(tài)是診斷糖尿病患者早期周圍神經(jīng)病變的非侵入性手段[51]。由于角膜神經(jīng)與下肢神經(jīng)功能、其他神經(jīng)功能檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性還存在爭(zhēng)議，角膜神經(jīng)的改變尚不能作為DPN的可靠指標(biāo)[52]。但是，臨床發(fā)現(xiàn)糖尿病患者角膜損傷隨病程發(fā)展而加重[53]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示角膜神經(jīng)損失速度與糖尿病的嚴(yán)重程度有關(guān)[20]。近年來(lái)研究顯示，糖尿病小鼠的上皮下角膜神經(jīng)顯著減少[8, 20]。角膜共聚焦顯微鏡還可以跟蹤觀察小鼠角膜神經(jīng)的進(jìn)行性消耗，未來(lái)可能成為定量診斷糖尿病周圍神經(jīng)病變的一種高敏感性、高重復(fù)性且非侵入性方法。

7 總結(jié)

糖尿病小鼠在糖尿病發(fā)病后2～8周就有類似人體DPN的早期癥狀如感覺(jué)過(guò)敏或減退、IENF丟失等，并且其繁殖周期短、價(jià)格適宜、操作方便，這使其成為DPN研究的重要工具。但是，在DPN研究中任何小鼠模型的大小都是難以避免的缺點(diǎn)(如足部面積小使得觸覺(jué)檢查不易進(jìn)行)，這可能妨礙實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確采集。并且，小鼠壽命也限制了我們研究DPN的長(zhǎng)期變化[3]。此外，由于STZ-小鼠在無(wú)干預(yù)措施的情況下，也可能恢復(fù)正常的血糖水平，我們還需密切監(jiān)測(cè)小鼠血糖水平的波動(dòng)。

關(guān)于糖尿病小鼠DPN的篩查方法很多，但暫無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，感覺(jué)、神經(jīng)電生理和病理學(xué)檢查是最基本的方法。感覺(jué)檢查簡(jiǎn)單可靠且敏感性較高，但該法基于小鼠機(jī)體不適的指標(biāo)如舔足、縮足等，這些行為存在個(gè)體主觀性，與刺激強(qiáng)度、疼痛感知不完全相關(guān)。神經(jīng)電生理法具有良好的重復(fù)性、客觀性，但無(wú)法評(píng)估小神經(jīng)纖維損傷且操作費(fèi)時(shí)。病理學(xué)檢查可以評(píng)估多種纖維類型包括其他方法難以評(píng)估的小的無(wú)髓纖維，是量化小神經(jīng)纖維病變可靠且可重復(fù)的方法，能夠彌補(bǔ)感覺(jué)和電生理檢查的不足。不過(guò)要獲得準(zhǔn)確的病理學(xué)診斷, 需要保證取樣準(zhǔn)確性。運(yùn)動(dòng)學(xué)檢查的參考價(jià)值不如其他方法，多作為輔助手段來(lái)排除運(yùn)動(dòng)缺陷造成小鼠在其他實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)欠佳。糖尿病小鼠周圍神經(jīng)病變的檢查方法各有利弊，因此在實(shí)際應(yīng)用中，多種方法聯(lián)合應(yīng)用對(duì)我們深入探究DPN的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。