響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助裸燕麥蛋白/β-葡聚糖糖基化改性工藝

蔣 琳,楊志偉

(廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西高校特色農(nóng)產(chǎn)品精深加工與安全控制重點實驗室,廣西南寧 530004)

裸燕麥俗稱莜麥,是燕麥的一種,營養(yǎng)價值高,其中蛋白含量約13%～17%,是大米的3倍,面粉的1.6倍，具備人體所含的8種必需氨基酸,有“超級谷物”之稱[1]。裸燕麥蛋白含量在谷物蛋白中居于首位,其中球蛋白含量超過50%。由于裸燕麥蛋白本身的理化性質(zhì)較差,致使裸燕麥的加工特性低,限制其研發(fā)與應(yīng)用[2-3]。為了改良裸燕麥蛋白的相關(guān)理化性質(zhì),并使之具有一定功能性,擴(kuò)寬裸燕麥資源的開發(fā)前景,可以對裸燕麥蛋白進(jìn)行改性處理[4]。而糖基化改性是較為理想的一種改性方式,是在沒有任何化學(xué)試劑參與下,通過蛋白質(zhì)或多肽的游離氨基與還原糖中羥基化合物在常溫或者加熱時發(fā)生的共價結(jié)合的美拉德改性,生成蛋白-糖共價復(fù)合物[5]。

β-葡聚糖,一種結(jié)構(gòu)性非淀粉多糖,是葡萄糖通過β-(1→3),(1→4)糖苷鍵連接而成的高分子聚合物,特有的高黏性使其與蛋白質(zhì)復(fù)合能增加乳化液的乳化穩(wěn)定性,增強(qiáng)蛋白凝膠性,且具有降低血糖,增強(qiáng)免疫力的功效[6-7]。然而,β-葡聚糖作為一種功能性優(yōu)越的多糖,在蛋白質(zhì)的糖基化改性中應(yīng)用較少[8]。

此外,在近年來的研究中發(fā)現(xiàn),超聲波技術(shù)處理產(chǎn)生的熱效應(yīng)、剪切力、空化作用等對于提高改性速率,改善產(chǎn)物性質(zhì)有著重要的作用[9]。目前,關(guān)于超聲波輔助糖基化改性的研究多集中在谷物蛋白與葡萄糖、乳糖等小分子糖的復(fù)合,對于蛋白與分子量較大的葡聚糖的糖基化改性的工藝研究以及相關(guān)理化和功能性質(zhì)的研究較少[4,10-12]。因此,本文將采用超聲波輔助裸燕麥蛋白與β-葡聚糖進(jìn)行糖基化改性,研究超聲處理對裸燕麥蛋白分子結(jié)構(gòu)和溶解特性的影響,使溶液體系中的自由氨基數(shù)量增多,更多的游離氨基與β-葡聚糖發(fā)生共價結(jié)合,從而促進(jìn)糖基化產(chǎn)物的生成。研究不同反應(yīng)條件(超聲功率、超聲時間、超聲溫度、β-葡聚糖與裸燕麥蛋白質(zhì)量比)對裸燕麥蛋白糖基化改性的影響,通過響應(yīng)面優(yōu)化得到最優(yōu)工藝條件,為后續(xù)糖基化改性產(chǎn)物的理化和功能性的研究提供基礎(chǔ)[13-14]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

裸燕麥米 市售;β-葡聚糖(≥98%) 西安千葉草生物科技有限公司;鄰苯二甲醛(O Phthalic Aldehyde,OPA) 源葉生物有限公司;十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS)、無水碳酸鈉(≥99.8%) 天津博迪化工股份有限公司;酒石酸鉀鈉、四硼酸鈉 分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠;氫氧化鈉、硫酸銅 分析純,成都金山化學(xué)試劑有限公司;甲醇 分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司;Folin-酚 北京索萊寶科技有限公司。

HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋、HJ-3控溫磁力攪拌器 江蘇金怡儀器科技有限公司;TLE204E分析天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;JAC-300N型數(shù)控超聲波清洗機(jī) 山東省濟(jì)寧市奧波超聲電氣有限公司;TECAN酶標(biāo)儀 上海勒菲生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 裸燕麥蛋白的制備 裸燕麥粉碎過40目篩,正己烷1∶3 (W/V)振蕩脫脂,過濾后在通風(fēng)櫥下放置,待正己烷揮發(fā)完全后即可。脫脂裸燕麥粉與蒸餾水按1∶13 (W/V)的比例混合,用0.5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至10,40 ℃下磁力攪拌90 min,4000 r/min離心20 min,取上清液[15]。用 1 mol/L HCl調(diào)節(jié)上清液pH至4.3,靜置30 min后4000 r/min離心20 min,沉淀物水洗兩次調(diào)pH至7,透析48 h后冷凍干燥。

1.2.2 裸燕麥蛋白/β-葡聚糖糖基化復(fù)合物的制備 稱取一定量的裸燕麥蛋白(精確到0.001),用pH為7的磷酸鹽緩沖溶液配制濃度為1%的蛋白溶液,按照一定的糖/蛋白質(zhì)量比加入β-葡聚糖,磁力攪拌20 min使溶液混合均勻。密封后放入超聲裝置中,在一定的超聲功率、一定的超聲溫度下進(jìn)行糖基化改性反應(yīng),反應(yīng)一定時間后取出冰浴冷卻。5000 r/min離心20 min,將上清液冷藏備用[16]。

1.2.3 單因素實驗設(shè)計 為了使裸燕麥蛋白與β-葡聚糖糖基化反應(yīng)更完全,接枝度更高,糖基化產(chǎn)物理化性質(zhì)更好,本實驗采用超聲波輔助工藝,通過超聲處理改變裸燕麥蛋白的溶解特性,使體系中的自由氨基增多,促進(jìn)β-葡聚糖與裸燕麥蛋白的共價結(jié)合[10]。因此,本實驗的單因素實驗以溶解度和接枝度為指標(biāo),探究超聲波處理對裸燕麥蛋白糖基化改性的影響,為最優(yōu)實驗條件的確定提供依據(jù)。

1.2.3.1 超聲功率對裸燕麥蛋白/β-葡聚糖糖基化改性的影響 在β-葡聚糖與裸燕麥蛋白質(zhì)量比2∶1、超聲溫度70 ℃、超聲時間60 min、pH7.0條件下,以接枝度和溶解度為指標(biāo),研究超聲功率在0、120、180、240、300 W條件下對裸燕麥蛋白糖基化改性的影響。

1.2.3.2 超聲時間對裸燕麥蛋白糖基化改性的影響 在質(zhì)量比2∶1、超聲溫度70 ℃、超聲功率240 W、pH7.0條件下,以接枝度和溶解度為指標(biāo),研究超聲時間在0、30、60、90、120 min條件下對裸燕麥蛋白糖基化改性的影響。

1.2.3.3 超聲溫度對裸燕麥蛋白糖基化改性的影響 在質(zhì)量比2∶1、超聲功率240 W、超聲時間60 min、pH7.0條件下,以接枝度和溶解度為指標(biāo),研究超聲溫度在50、60、70、80、90 ℃條件下對裸燕麥蛋白糖基化改性的影響。

1.2.3.4β-葡聚糖與裸燕麥蛋白質(zhì)量比對裸燕麥蛋白糖基化的影響 在超聲功率240 W、超聲時間60 min、超聲溫度70 ℃、pH7.0條件下,以接枝度和溶解度為指標(biāo),研究β-葡聚糖與裸燕麥蛋白質(zhì)量比在1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、5∶1條件下對裸燕麥蛋白糖基化改性的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選取超聲時間、超聲功率、超聲溫度、β-葡聚糖與裸燕麥蛋白質(zhì)量比作為自變量,根據(jù) Box-Behnken 設(shè)計建立四因素三水平試驗,以接枝度為響應(yīng)值,通過響應(yīng)面分析對裸燕麥蛋白與β-葡聚糖的接枝條件進(jìn)行優(yōu)化,確定最優(yōu)糖基化改性工藝條件。水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計表Table 1 Factors and levels of RSM

1.2.5 接枝度的測定 稱取40 mg的OPA溶于1 mL甲醇中,分別加入20%(W/V)SDS溶液2.5 mL,0.1 mol/L硼砂溶液25 mL,β-巰基乙醇100 μL,混合均勻后用蒸餾水定容至50 mL,得到OPA試劑。取4 mL OPA試劑于試管中,加入200 μL糖基化后的上清液,混合均勻后于35 ℃水浴2 min,在340 nm處測定溶液吸光值,同時作空白對照[15]。

接枝度(%)=[A1-(A2-A0)]÷A1×100

式中:A1-相同條件下未參與糖基化改性的溶液吸光度值;A2-糖基化改性后溶液吸光度值;A0-相同條件下糖空白對照溶液的吸光度值。

1.2.6 溶解度的測定 采用福林酚法[16]測定上述上清液中溶解的蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)為5次重復(fù)的均值,均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示。數(shù)據(jù)采用Origin 8.0與Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析和圖像處理。用SPSS 20.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 超聲功率對裸燕麥蛋白糖基化改性的影響 從圖1可以看出,隨著超聲功率的增加,裸燕麥蛋白糖基化改性的接枝度和溶解度呈先增大后減小的趨勢。當(dāng)超聲功率達(dá)到240 W時,接枝度為最大值32.36%±1.16%,溶解度達(dá)到12.87%±0.12%,之后隨著超聲功率的增大，接枝度和溶解度都逐漸減小。這可能是因為超聲處理產(chǎn)生的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械剪切作用使得蛋白質(zhì)分子發(fā)生機(jī)械性振蕩,蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)遭到破壞,使原本有序的螺旋結(jié)構(gòu)中次級鍵斷裂,肽鏈打開,蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)疏松[17],同時,超聲處理使得蛋白質(zhì)分子表面的自由氨基和羧基之間的靜電引力被打斷,蛋白質(zhì)分散開來,隨著超聲功率的增大,蛋白質(zhì)溶解度增大,溶液體系中自由氨基增多,接枝改性結(jié)合位點也相應(yīng)增多,接枝度增大[18]。但是,過大功率的超聲處理產(chǎn)生的熱效應(yīng)會使得蛋白局部溫度過高,使得原本展開的肽鏈發(fā)生聚合,使得蛋白溶解度減小。接枝改性位點被掩蓋,使得蛋白糖基化改性受阻[19],接枝度下降。

圖1 超聲功率對裸燕麥蛋白 糖基化改性接枝度和溶解度的影響Fig.1 Effects of ultrasonic power on the degree of grafting and solubility of OP glycosylation

2.1.2 超聲時間對裸燕麥蛋白糖基化改性的影響 從圖2可以看出,隨著超聲時間的不斷增加,裸燕麥蛋白糖基化改性體系中,接枝度先增大后減小,在超聲時間為90 min時,接枝度達(dá)到最大值32.59%±1.34%。溶解度在90 min時達(dá)到12.3%±0.18%,之后趨于平緩。這可能是因為超聲波產(chǎn)生的空化作用和熱效應(yīng)使得蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)疏松[20],蛋白質(zhì)分子的擴(kuò)散速率增大,增強(qiáng)了蛋白的溶解性,同時也增加了自由氨基與β-葡聚糖分子的碰撞機(jī)率,接枝度升高。但當(dāng)超聲時間過長時,使得原本斷裂的肽鏈重新聚合,蛋白的疏水性基團(tuán)增多,溶解度降低[21-22],同時,可與糖分子結(jié)合的自由氨基位點被掩埋,接枝度下降。

圖2 超聲時間對裸燕麥蛋白 糖基化改性接枝度和溶解度的影響Fig.2 Effects of ultrasonic time on the degree of grafting and solubility of OP glycosylation

2.1.3 超聲溫度對裸燕麥蛋白糖基化改性的影響 從圖3可以看出,隨著超聲溫度的升高,接枝度呈現(xiàn)先增高后緩慢下降的趨勢。當(dāng)溫度在70 ℃時,接枝度達(dá)到最大值33.49%±1.66%。溶解度在70～80 ℃之間下降,80～90 ℃開始上升(通過差式掃描量熱儀測得,裸燕麥蛋白變性溫度為89 ℃)。這可能是由于隨著改性的進(jìn)行,蛋白質(zhì)分子與β-葡聚糖結(jié)合,引入了親水性羥基,在一定程度上從空間上保護(hù)了蛋白質(zhì),使蛋白質(zhì)不易聚集,溶解度增大[22]。溶液體系中自由氨基增多,接枝改性速率也就增大。隨著溫度的升高,改性進(jìn)一步進(jìn)行,裸燕麥蛋白糖基化改性進(jìn)入美拉德最終階段,產(chǎn)物進(jìn)一步反應(yīng)生成類黑精,并與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)作用阻礙了糖基化改性的進(jìn)行[22-23]。同時,高溫使得蛋白質(zhì)發(fā)生變性,空間結(jié)構(gòu)被破壞,鏈與鏈之間的分子間氫鍵容易聚集成團(tuán),不易被溶解[24],從而使得溶解度和接枝度降低。

圖3 超聲溫度對裸燕麥蛋白 糖基化改性接枝度和溶解度的影響Fig.3 Effects of ultrasonic temperature on the degree of grafting and solubility of OP glycosylation

2.1.4β-葡聚糖與裸燕麥蛋白質(zhì)量比對裸燕麥蛋白糖基化的影響 從圖4可以看出,隨著溶液體系中糖濃度的增高,接枝度先增大后減小。當(dāng)糖/蛋白質(zhì)量比為2∶1時,接枝度達(dá)到最大值31.66%±0.76%,隨后接枝度緩慢下降。這可能是因為在適當(dāng)?shù)奶菨舛确秶鷥?nèi),糖濃度的增大使得自由氨基與β-葡聚糖分子羥基的碰撞結(jié)合機(jī)率增大,促進(jìn)接枝改性的進(jìn)行,接枝度增大[25]。然而,當(dāng)糖濃度過高,溶液粘性變大,流動性變小,使得分子間的相互作用緩慢。另外,由于β-葡聚糖為大分子糖,過高的糖濃度產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)進(jìn)一步阻礙了接枝改性的進(jìn)行[26]。同時,溶解度隨著糖濃度的增高而增大之后趨于平穩(wěn)。這可能是由于接枝度的增大引入了更多的親水性基團(tuán),但當(dāng)接枝改性受阻后,溶液體系處于飽和狀態(tài),溶解度趨于平緩[27]。

圖4 糖/蛋白質(zhì)比對裸燕麥蛋白 糖基化改性接枝度和溶解度的影響Fig.4 Effects of mass ratio on the degree of grafting and solubility of OP glycosylation

2.2 響應(yīng)面法實驗結(jié)果與分析

表2 Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

對響應(yīng)面實驗結(jié)果進(jìn)行多元二次回歸分析,可以獲得接枝度關(guān)于超聲功率A、超聲時間B、超聲溫度C、糖/蛋白質(zhì)量比D的二次多元回歸方程為:

接枝度(%)=37.29+1.85A+4.93B+0.031C-1.288D+0.84AB+1.50AC+1.36AD+1.36BC+1.76BD+2.97CD-11.22A2-5.38B2-3.22C2-4.62D2

2.2.2 響應(yīng)面圖和等高線圖分析 圖5～圖10分別給出了超聲功率、超聲時間、超聲溫度、糖/蛋白質(zhì)量比對糖基化改性裸燕麥蛋白接枝度影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖。從響應(yīng)面圖可知,在因素較低水平條件下響應(yīng)值隨著每個因素的增大而增大,當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后,又逐漸減小。由表3和圖5分析可知,在響應(yīng)組合試驗中,超聲時間B不顯著(P>0.05),對裸燕麥蛋白糖基化改性的接枝程度影響不大,在一定時間內(nèi),隨著超聲溫度的升高,接枝度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,且超聲溫度C的一次項極顯著(P<0.0001)影響接枝度大小。同時,BC響應(yīng)面的等高線圖密集呈橢圓狀,由此也說明超聲時間和超聲溫度的交互作用顯著,交互作用對接枝度影響較大。從表3和圖6～圖10可知,超聲功率A、超聲時間B、糖/蛋白質(zhì)量比D的一次項均極顯著(P<0.0001)影響裸燕麥蛋白糖基化改性的接枝程度。同時,由方差表中可以看出,AB、AC、AD、BD、BC的交互項都呈現(xiàn)極顯著性(P<0.0001),且等高線圖呈橢圓狀,表明AB、AC、AD、BD、BC的交互項均極顯著影響接枝度的大小。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for the regression model

注:*:P<0.05表示顯著,**:P<0.01表示極顯著。

圖5 超聲時間與溫度交互作用對接枝度影響的曲面圖和等高線圖Fig.5 Surface and contour plots of mutual-influence of ultrasonic time and ultrasonic temperature on grafting reaction

圖6 超聲溫度與糖/蛋白質(zhì)量比交互作用對接枝度影響的曲面圖和等高線圖Fig.6 Surface and contour plots of mutual-influence of ultrasonic temperature and sugar/protein mass ratio on grafting reaction

圖7 超聲時間與糖/蛋白質(zhì)量比交互作用對接枝度影響的曲面圖和等高線圖Fig.7 Surface and contour plots of mutual-influence of ultrasonic time and sugar/protein mass ratio on grafting reaction

圖8 超聲功率與糖/蛋白質(zhì)量比交互作用對接枝度影響的曲面圖和等高線圖Fig.8 Surface and contour plots of mutual-influence of ultrasonic power and sugar/protein mass ratio on grafting reaction

圖9 超聲功率與溫度交互作用對接枝度影響的曲面圖和等高線圖Fig.9 Surface and contour plots of mutual-influence of ultrasonic power and ultrasonic temperature on grafting reaction

圖10 超聲功率與時間交互作用對接枝度影響的曲面圖和等高線圖Fig.10 Surface and contour plots of mutual-influence of ultrasonic power and ultrasonic time on grafting reaction

通過軟件Design-Expert 8.0對方程求極大值,得出超聲輔助裸燕麥蛋白糖基化改性的最優(yōu)理論條件為超聲功率240.93 W,超聲時間94.20 min,超聲溫度74.86 ℃,糖/蛋白質(zhì)量比2.11∶1,此時接枝度為37.33%±1.68%。結(jié)合到實際操作的可行性,選擇以下實驗條件:超聲功率240 W,超聲時間95 min,超聲溫度75 ℃,糖/蛋白質(zhì)量比2∶1。在此條件下,進(jìn)行三次平行驗證實驗得到裸燕麥蛋白糖基化改性的接枝度為35.79%±0.86%。達(dá)到預(yù)測值的95.03%,與未超聲處理,加熱溫度75 ℃,加熱時間95 min,糖/蛋白質(zhì)量比2∶1,條件下的接枝度15.3%±0.63%相比,提高了2.34倍。

3 結(jié)論

本實驗討論了不同改性條件對裸燕麥蛋白糖基化改性中接枝度的影響,通過單因素及響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計建立了超聲輔助裸燕麥蛋白糖基化改性工藝的模型,并對此模型進(jìn)行了優(yōu)化,得到裸燕麥蛋白糖基化改性的最優(yōu)工藝條件為超聲時間95 min,超聲功率240 W,超聲溫度75 ℃,糖/蛋白質(zhì)量比2∶1,在此條件下,糖基化改性的接枝度達(dá)35.79%±0.86%,約為未超聲條件下(溫度75 ℃,加熱時間95 min,糖/蛋白質(zhì)量比2∶1,接枝度為15.3%±0.63%)的2.34倍。采用超聲波輔助蛋白質(zhì)糖基化改性,成本低,效率高。同時,最優(yōu)工藝條件下的裸燕麥蛋白糖基化改性產(chǎn)物的制備也為后續(xù)研究其理化和功能性提供基礎(chǔ),有利于裸燕麥蛋白資源在食品中的開發(fā)和利用,提高經(jīng)濟(jì)效益。