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    異鼠李素激活PI3K/Akt/GSK-3β/CREB信號通路減輕魚藤酮誘導的PC12細胞損傷

    2020-02-18 09:17:04譚會潔宋俊科杜冠華郭常川
    中國藥理學通報 2020年2期
    關鍵詞:異鼠李素魚藤酮

    譚會潔,宋俊科,石 峰,張 雯,杜冠華,郭常川

    (1.山東省食品藥品檢驗研究院,濟南 250101;2.中國醫(yī)學科學院&北京協和醫(yī)學院藥物研究所,天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室,藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室,北京 100050)

    帕金森病(parkinson’s disease,PD)是第二大中樞神經系統退行性疾病,帕金森病的主要病理特征是中腦黑質多巴胺能神經元變性死亡并且殘存胞漿中形成路易小體[1-2]。尋找安全有效的藥物以防止多巴胺能神經元變性死亡對于PD治療具有重要作用。研究發(fā)現,異鼠李素(isorhamnetin,ISO)具有明確的內皮保護作用、能夠抗動脈粥樣硬化、抗心肌纖維化、抗血小板凝集、抗氧化等[3-5]。然而,異鼠李素對神經退行性疾病損傷模型中細胞保護作用及分子機制尚未完全清楚。

    環(huán)腺苷酸反應結合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)是通過自身磷酸化實現轉錄調節(jié)的重要轉錄因子。CREB能夠被多種激酶激活,調節(jié)細胞內基因轉錄,參與細胞的增殖、分化和凋亡[6-7]。磷酸肌醇3-激酶(phosphatidyl-inositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號通路與帕金森病聯系密切,在介導多巴胺能神經元存活中起重要作用。Phospho-Akt觸發(fā)下游靶標磷酸化,導致糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)和促凋亡B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族失活,進一步激活cAMP反應元件結合蛋白[8-9]。

    異鼠李素能否通過PI3K/Akt/GSK-3β/CREB信號通路抑制魚藤酮誘導的PC12細胞毒性損傷未見報道。本實驗通過建立魚藤酮損傷PC12細胞模型,探討異鼠李素是否能夠通過PI3K/Akt/GSK-3β/CREB信號通路抑制多巴胺能神經元損傷。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞PC12購自吉妮歐生物有限公司。異鼠李素(R018214)購自上海易恩化學技術有限公司。Roswell Park Memorial Institute-1640(RPMI-1640)培養(yǎng)基(31870082)、胎牛血清(10100147)、馬血清(26050088)均購自Thermo Fisher Scientific。魚藤酮(R8875)、LY294002(L9908)、氮乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC,A7250)、MTT(M2128)均購自Sigma-Aldrich;乳酸脫氫酶檢測試劑盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit,C0016)購自碧云天生物技術公司。CREB(sc-377154)、p-CREB(sc-81486)抗體均購自Santa Cruz Biotechnology。Akt(4685)、p-Akt(4060)、GSK3β(12456)、p-GSK3β(5558)和GAPDH(5174)抗體均購自Cell Signaling Technology。電泳儀(PowerPac Basic)、成像儀(Molecular Imager ChemiDoc XRS+System),美國Bio-Rad;酶標儀(SpectraMax M5),美國Molecular Devices。

    1.2 PC12細胞培養(yǎng)PC12細胞接種于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中,其中含有10%馬血清和5%胎牛血清,置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中,每隔一天換液,待細胞處于對數生長期時,接種于不同培養(yǎng)板中用于后續(xù)實驗。

    1.3 細胞分組實驗分為七組:(1)空白對照組;(2)ISO對照組,加入15 μmol·L-1ISO;(3)魚藤酮損傷組,加入10 μmol·L-1魚藤酮損傷24 h;(4)ISO低劑量組,在給予魚藤酮損傷之前,加入1.5 μmol·L-1ISO預孵育2 h;(5)ISO中劑量組,在給予魚藤酮損傷之前,加入5 μmol·L-1ISO預孵育2 h;(6)ISO高劑量組,在給予魚藤酮損傷之前,加入15 μmol·L-1ISO預孵育2 h;(7)NAC陽性對照組,在給予魚藤酮損傷之前,加入5 mmol·L-1NAC預孵育2 h。

    1.4 MTT檢測細胞存活率將PC12細胞接種于96孔板中,實驗終點,棄培養(yǎng)液,加入MTT工作溶液100 μL,繼續(xù)孵育4 h后棄MTT溶液,加入DMSO 100 μL,結晶溶解后測定吸光度。

    1.5 LDH釋放率檢測將PC12細胞接種于96孔板,設置空白對照組、樣品對照組、樣品最大酶活性組、藥物處理組。實驗終點前1 h,在樣品最大酶活性組中加入LDH釋放劑10 μL,繼續(xù)孵育1 h后取每孔120 μL上清液,進行測定。

    1.6 Western blot檢測蛋白表達將PC12細胞接種于6孔板,實驗終點,PBS洗一次,加入200 μL預冷的蛋白裂解液30 min后提取細胞總蛋白。加入5×loading buffer后沸水浴10 min,之后進行SDS-PAGE電泳,將蛋白轉印至PVDF膜。然后5% BSA室溫封閉2 h再分別用稀釋后的CREB、p-CREB、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β和GAPDH抗體孵育4 ℃過夜。TBST洗滌3次,置于對應二抗中孵育2 h,最終TBST洗滌3次后成像。

    2 結果

    2.1 ISO減輕魚藤酮誘導的PC12細胞損傷MTT檢測結果如Fig 1A所示,與空白對照組相比,15 μmol·L-1ISO單獨孵育PC12細胞24 h,對細胞活力沒有明顯影響。與空白對照組相比,10 μmol·L-1魚藤酮處理PC12細胞后,細胞存活率明顯降低(P<0.01),ISO 1.5,5和15 μmol·L-1及5 mmol·L-1NAC均能明顯提高PC12細胞存活率(P<0.05或P<0.01)。LDH檢測結果如Fig 1B所示,與空白對照組相比,ISO對照組PC12細胞LDH釋放量無明顯變化,魚藤酮損傷組PC12細胞LDH釋放量明顯增加(P<0.01),5和15 μmol·L-1ISO及5 mmol·L-1NAC均能明顯抑制魚藤酮誘增的LDH釋放(P<0.05或P<0.01)。

    A: The cell viability was determined using MTT assay;B: The LDH release was detected by the LDH Cytotoxicity Assay Kit.##P<0.01vssham group,*P<0.05,**P<0.01vsrotenone group.

    2.2 ISO提高魚藤酮損傷PC12細胞中CREB的磷酸化水平Western blot檢測結果表明,魚藤酮損傷PC12細胞模型組p-CREB/CREB比值明顯低于空白對照組(P<0.01)。與魚藤酮損傷組相比,1.5 μmol·L-1ISO預處理對p-CREB/CREB比值無明顯影響,5和15 μmol·L-1ISO預處理組p-CREB/CREB比值明顯提高(P<0.01)。結果如Fig 2。

    Fig 2 Phosphorylation of CREB in PC12 cells

    A: The expression of p-CREB and CREB were detected by Western blot. GAPDH was used as a loading control; B: p-CREB/CREB ratio.##P<0.01vsControl group,**P<0.01vsrotenone group.

    2.3 ISO增加魚藤酮損傷的PC12細胞中Akt和GSK-3β的磷酸化水平采用Western blot檢測魚藤酮損傷PC12細胞后,p-Akt/Akt比值和p-GSK-3β/GSK-3β比值變化。與空白對照組相比,魚藤酮損傷組PC12細胞中p-Akt/Akt比值和p-GSK-3β/GSK-3β比值明顯降低(P<0.01)。然而,與魚藤酮損傷組相比,5和15 μmol·L-1ISO預處理不同程度增強了p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β比值(P<0.05或P<0.01)。結果如Fig 3。

    2.4 ISO對魚藤酮損傷PC12細胞中PI3K/Akt信號通路的影響為進一步明確ISO對魚藤酮損傷PC12細胞的保護作用是否通過PI3K/Akt/GSK-3β信號通路實現,并且PI3K/Akt/GSK-3β通路的激活是否有助于CREB的磷酸化。加入PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002預處理PC12細胞。如Fig 4所示,與空白對照相比,魚藤酮損傷模型組PC12細胞后Akt,GSK-3β,CREB的磷酸化水平明顯降低,PC12細胞活力明顯降低(P<0.01)。與魚藤酮損傷組相比,ISO預處理組可以增強p-Akt,p-GSK-3β,p-CREB的表達,提高細胞活力(P<0.01)。加入LY294002后能夠部分阻斷ISO引起的p-Akt,p-GSK-3β,p-CREB的表達增加,抑制細胞活力增強(P<0.05)。

    Fig 3 Levels of p-Akt and p-GSK-3β elevatedby

    A:The levels of p-Akt,Akt,p-GSK-3β and GSK-3β were detected by Western blot. GAPDH was used as a loading control;B:p-Akt/Akt and p-GSK-3β/GSK-3β ratio.##P<0.01vscontrol group,*P<0.05,**P<0.01vsrotenone group.

    3 討論

    實驗結果表明,ISO預處理能夠激活CREB,增加Akt和GSK-3β磷酸化,發(fā)揮PC12細胞的保護作用,免受魚藤酮毒性導致的細胞凋亡。加入PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002,能夠抑制CREB和Akt的磷酸化,激活GSK-3β,最終部分阻斷ISO對PC12細胞的保護作用。

    魚藤酮是植物毛魚藤的有效成分,對中樞多巴胺神經系統有選擇性損傷,長期接觸可引起多巴胺神經退行性病變[2]。PC12細胞是大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞,能夠合成多巴胺等神經遞質,含有合成、分解多巴胺所需要的酶。本實驗以魚藤酮損傷構建PD細胞模型,探討異鼠李素對魚藤酮損傷PC12細胞的保護作用,應用PI3K抑制劑處理PC12細胞,觀察CREB磷酸化程度,闡明CREB對異鼠李素調控PC12細胞的作用機制。

    CREB是一種普遍存在的磷酸化依賴性轉錄因子,可以通過各種絲氨酸/蘇氨酸激酶在Ser133進行磷酸化而被激活。CREB的激活是多種適應性變化的基礎,能增強cAMP誘導的基因轉錄,調控相關的信號轉導通路,發(fā)揮生物學功能[6]。實驗結果表明,魚藤酮抑制CREB的磷酸化,而ISO預處理能夠促進CREB的活化,提高魚藤酮損傷PC12細胞的活力。GSK-3β是中樞神經系統中高表達的蛋白激酶,參與基因轉錄、蛋白質合成、細胞周期調控以及細胞程序性死亡等多種細胞過程。文獻報道抑制GSK-3β活化可以減少細胞凋亡提高細胞存活[10-11]。本實驗研究結果顯示,魚滕酮損傷PC12細胞中GSK-3β被激活,但ISO預處理能夠抑制GSK-3β活性,降低魚藤酮對PC12細胞毒性作用。

    Fig 4 Effects of ISO on activation of CREB and cell viability in presence of PI3K

    A:The levels of p-Akt,Akt,p-GSK-3β,GSK-3β,p-CREB and CREB were detected by Western blot. GAPDH was used as a loading control;B:p-Akt/Akt,p-GSK-3β/GSK-3β and p-CREB/CREB ratio; C: The protective effect of ISO on rotenone-induced PC12 cells was reversed by LY294002.##P<0.01vscontrol group,*P<0.05,**P<0.01vsrotenone group,△P<0.05vsISO group.

    GSK-3β能夠被多種信號通路調節(jié),影響細胞存活,PI3K/Akt是其中最重要的上游調節(jié)通路。研究表明PI3K/Akt通路的激活在預防細胞變性和細胞凋亡中起主導作用[8,12-13]。在外源性和內源性應激、胰島素、生長因子和細胞因子的刺激下,Akt磷酸化一系列下游靶標,使GSK-3β磷酸化和失活,激活CREB。不同神經毒素誘導神經元損傷后,Akt ser473的活化受到明顯抑制,磷酸化水平明顯降低,GSK3β ser9失活也明顯受抑制。我們的實驗顯示了類似的結果,魚藤酮損傷可降低Akt活性,激活GSK-3β,同時降低CREB磷酸化。目前,PI3K/Akt/GSK-3β途徑是研究細胞凋亡的重要通路。激活GSK-3β可能參與缺血再灌注后的神經保護。麥角黃毒素通過下調p-GSK3β和p-Akt水平,抑制6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞凋亡[14]。本實驗中,我們進一步加入PI3K抑制劑LY294002可逆轉ISO激活CREB,Akt,使GSK-3β失活,以上結果證實PI3K/Akt/GSK-3β/CREB的激活參與了ISO的神經保護作用。

    綜上所述,ISO預處理可以減輕魚藤酮對PC12細胞的損傷作用,其神經保護作用可能是通過激活PI3K/Akt/GSK-3β/CREB信號通路實現的。

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