褪黑素受體激動(dòng)劑Neu-p11改善T2DM大鼠的胰島素抵抗作用研究

高迎春，岳 穎，周 珺，馬慧萍，張汝學(xué)

(1.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院，全軍高原環(huán)境損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家中醫(yī)藥管理局臨床中藥學(xué)重點(diǎn)學(xué)科，甘肅 蘭州 730050；2. 蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州 730000)

線粒體是一個(gè)具有動(dòng)態(tài)特性的細(xì)胞器，是機(jī)體細(xì)胞最主要的能量代謝場所。在不同生理過程和機(jī)體環(huán)境刺激下，不斷融合和分裂，二者協(xié)同進(jìn)行，線粒體通過維持動(dòng)態(tài)平衡來保證其功能正常[1]。研究表明，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)及胰島素抵(insulin resistance，IR)時(shí)，線粒體發(fā)生數(shù)量減少，體積減小，線粒體呼吸功能減弱，DNA分布不均，ATP合成減少，線粒體生物合成下降等現(xiàn)象。充分說明線粒體平衡、線粒體功能障礙與T2DM有重要聯(lián)系[2]。

正常組織細(xì)胞內(nèi)腺苷酸激活蛋白激酶(AMP activated protein kinase， AMPK)磷酸化激活后，誘導(dǎo)沉默調(diào)節(jié)蛋白1(Sirt1)介導(dǎo)的過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，Coactivator-1α ，PGC-1α)通路，協(xié)同下游靶基因(estrogen related receptor α，ERRα)共同作用，調(diào)節(jié)線粒體融合蛋白(mitofusin2，Mfn2)，影響線粒體融合效率[3]。同時(shí)Sirt1/ PGC-1α通路，可啟動(dòng)核呼吸因子NRF-1/2，調(diào)控線粒體DNA表達(dá)，參與線粒體生物合成和氧化磷酸化過程，影響線粒體內(nèi)ATP的合成及其酶活性。T2DM時(shí)，線粒體在不同組織中ATP合成減少，酶活性降低，高糖狀態(tài)下機(jī)體細(xì)胞內(nèi)AMPK活性抑制，表達(dá)減少，導(dǎo)致PGC-1α、NRF-1/2的表達(dá)減少，生物合成失調(diào)，線粒體呼吸作用破壞，Mfn2蛋白表達(dá)降低，線粒體融合降低，動(dòng)態(tài)平衡失衡，線粒體功能降低，從而致使細(xì)胞對胰島素的敏感性減弱[4-5]。

褪黑素是一種可循環(huán)性激素，主要在松果體中合成分泌，也存在于其他組織內(nèi)。它對線粒體功能的維持及機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)的維持、T2DM導(dǎo)致的IR等都具有調(diào)節(jié)作用。另有一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，褪黑素可以改善不同病因造成的不同組織如：大腦、肝臟，以及心臟和骨骼肌內(nèi)的線粒體功能障礙和平衡失調(diào)，可通過影響信號傳導(dǎo)、線粒體呼吸以及氧化應(yīng)激等來達(dá)到改善病癥的效果。同時(shí)證實(shí)，褪黑素不僅可以改善線粒體呼吸功能和減輕氧化應(yīng)激，還可以直接抑制線粒體滲透性過渡孔(mPTP)，涉及到信號傳導(dǎo)凋亡與壞死細(xì)胞清理。Neu-p11，新型褪黑素受體激動(dòng)劑，相較褪黑素具有半衰期更長，選擇性更高，不良反應(yīng)小，易合成的優(yōu)勢。

本實(shí)驗(yàn)采用高脂膳食喂養(yǎng)，加小劑量STZ誘導(dǎo)建立T2DM大鼠模型，著重研究T2DM狀態(tài)下，肝臟線粒體平衡的動(dòng)態(tài)變化，功能異常及能量代謝變化。以線粒體融合分裂的動(dòng)態(tài)變化與線粒體功能的關(guān)系為基礎(chǔ)視角，探究褪黑素受體激動(dòng)劑Neu-p11不同給藥劑量是否能以調(diào)節(jié)T2DM大鼠肝臟線粒體平衡相關(guān)因子，維持線粒體動(dòng)態(tài)平衡為機(jī)制，改善其胰島素抵抗的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級雌性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(160～180)g，由蘭州大學(xué)提供，動(dòng)物合格證號：No 62000800000144，許可證號：SCXK(甘)2013-0002。飼養(yǎng)于蘭州總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科，定量攝食進(jìn)水，室溫(18～25) ℃。

1.2 主要藥品與試劑檸檬酸(20100304，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；檸檬酸三鈉(20090826，萊陽市雙雙化工有限公司)；胰島素放射免疫分析藥盒(S10950186，天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司)；Primescript RT Master Mix ，TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit ，TaKaRa SYBR Premix Ex Taq(RR036A，9767，RR802A，TakaRa公司)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，ELC超敏發(fā)光液，10×TBST，SDS(sodium dodecyl sulfate)，TRIS，甘氨酸，4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液(含β-巰基乙醇)，脫脂奶粉(20170506，20170629，909C0518北京索萊寶科技有限公司)；小鼠抗β-actin單抗，山羊抗小鼠抗體/辣根酶標(biāo)記，山羊抗兔抗體/辣根酶標(biāo)記(中山金橋)；小鼠單克隆抗體DRP1，兔多克隆抗體PGC1 alpha，兔單克隆抗體Mitofusin2(abcam)RIPA裂解液(強(qiáng))，100 mmol·L-1PMSF(S7506，碧云天生物技術(shù)研究所)；0.45 μm PVDF膜(K5PK92821，Immobilon-P?Transfer Membranes)高脂飼料(自備，基礎(chǔ)飼料40%、雞蛋34%、豬油20%、白砂糖 5.1%、熱量為22.1 kJ·g-1、糖類熱量25%、脂肪熱量60.17%，蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器BP210S電子天平，賽多利斯有限公司公司；PHS-3B型 PH計(jì)，雷磁儀器公司；HP-8453 紫外分光光度計(jì)，美國惠普公司；SpectraMax i3 全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀，美國 Molecular公司；Sigma 3K15低溫離心機(jī)，德國 Sigma公司；IEC- Micromax離心機(jī)，美國ThermoElectron公司；MG96G Long Gene PCR儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；AB ViiA7 Realtime PCR，美國Applied Biosystems公司。Powerpac TM Basic 基礎(chǔ)電泳儀電源和小型垂直電泳槽，Trans-Blot?TurboTMTransfer system半干轉(zhuǎn)儀BIO-RAD 公司；UVP型全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)，美國BioImaging Systems公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 T2DM大鼠模型的建立、分組及給藥雌性Wistar大鼠60只在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)10 d后，隨機(jī)抽取10只作為正常對照組，剩余50只作為造模組。正常對照組給予常規(guī)飼料飼養(yǎng)，造模大鼠均給予高脂飼料飼養(yǎng)，期間自由飲水。兩個(gè)月后，造模大鼠空腹16小時(shí)后，按體質(zhì)量腹腔注射STZ(30 mg·kg-1)，7天后測定空腹血糖，根據(jù)大鼠血糖狀態(tài)未達(dá)標(biāo)者再次注射STZ(15 mg·kg-1)，7天后測定空腹血糖，將血糖值>13.0 mmol·L-1的大鼠為造模成功，按照血糖和體質(zhì)量均分為糖尿病模型組、陽性藥組、褪黑素受體激動(dòng)劑Neu-p11低、高劑量組，每組10只。每天8:30 am給藥。正常對照組與模型組給等量水，陽性藥組給予10 mg·kg-1褪黑素，給藥低、高劑量組分別給予5 mg·kg-1、10 mg·kg-1褪黑素受體激動(dòng)劑Neu-p11；灌胃體積為1 ml·200 g-1，連續(xù)給藥4 w。

2.2 胰島素(INS)含量的測定及胰島素抵抗指數(shù)(HOME-IR)、胰島素敏感指數(shù)(ISI)的計(jì)算血清INS含量采用放免法測定，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。HOME-IR=FBG(mmol·L-1)×INS(m IU·L-1)/22.5

ISI=Ln 1/[FBG(mmol·L-1)×INS(m IU·L-1)]

2.3 RT-PCR法測定大鼠肝臟組織相關(guān)基因的表達(dá)大鼠處死后，剖取大鼠肝臟組織，稱取約20 mg，加Buffer RL試劑600 ml研磨勻漿，提取肝臟組織中的總RNA。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min；85 ℃，5 s；-20 ℃保存。根據(jù)AMPK、ERRα、Sirt1、Nrf1和Nrf2基因序列設(shè)計(jì)引物(如Tab 1)。RT-PCR：反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，31 s；40 個(gè)循環(huán)；-20 ℃保存。每批模板均同時(shí)進(jìn)行內(nèi)參β-actin 和目的基因的擴(kuò)增反應(yīng)。

Tab 1 primer sequence

2.4 Western blot測定大鼠肝臟組織相關(guān)蛋白的表達(dá)取肝臟組織50 mg，加入RIPA強(qiáng)效裂解液(含1% PMSF)制成約10%的勻漿液，冰上靜置30 min后，放置于4 ℃高速冷凍離心機(jī)，轉(zhuǎn)速12 000 rpm離心5 min，分離上清液至新的EP管中。取部分上清稀釋20到40倍后，BCA法測定蛋白濃度。再用RIPA強(qiáng)效裂解液將上清液蛋白濃度稀釋至10 μg·μL-1，以1 ∶3的比例吸取4×loading buffer與稀釋后的上清液混合，振蕩器混勻，再置于100 ℃的沸水水浴鍋中，加熱變性5 min，冷卻至室溫后，12 000 rpm離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管中，分裝上清后，-80 ℃保存。每孔上樣60 μg總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳后半干轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，β-actin一抗(1 ∶1 000)，目的蛋白一抗(1 ∶500)，室溫?fù)u床孵育2 h，4 ℃過夜，TBST洗滌PVDF膜8 min×5，二抗(1 ∶1 000)室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗滌PVDF膜8 min×5，滴加ECL，Tanon-4200SF全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)曝光。曝光圖片的灰度掃描測定應(yīng)用Image-Pro Plus6.0軟件進(jìn)行。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠胰島素(INS)水平與正常組相比，T2DM大鼠胰島素水平和HOMA-IR均有較大上升，而胰島素的敏感性降低；相較模型組，低劑量對胰島素抵抗有所緩解，但給藥組對于2型糖尿大鼠的胰島素敏感程度的改善效果微弱。(如Tab 2)

3.2 肝臟線粒體相關(guān)因子mRNA的表達(dá)相比較正常組，T2DM大鼠肝臟的AMPK、ERRα、Sirt1、Nrf1和Nrf2 mRNA的表達(dá)均呈現(xiàn)異常，其中模型組的ERRα mRNA呈現(xiàn)表達(dá)過量(P<0.01)，AMPK、Sirt1、Nrf1和Nrf2 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)；相較模型組，褪黑素和Neu-p11低劑量組對ERRα基因表達(dá)過量的趨勢有所緩解(P<0.01)，給藥組對AMPK、Sirt1、Nrf1和Nrf2 mRNA的基因表達(dá)有增加作用，其中低劑量最優(yōu)(P<0.05)。(如Tab 3，F(xiàn)ig 1)

3.3 ATP含量及其酶活力相比較正常組，T2DM大鼠肝臟的ATP含量顯著降低，其中模型組的ATP含量降低最為明顯(P<0.01)。相較模型組，給藥組對ATP的合成有所改善，Neu-p11低劑量組對其改善最為顯著(P<0.01)。(如Tab 4)

Tab 2 Effect of Neu-p11 on INS levels in T2DM rats(μ

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

Tab 3 Effect of Neu-p11 on liver mitochondrial balance-related factor gene expression in T2DM

*P<0.05,**P<0.01vsControl;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Tab 4 Effect of Neu-p11 on liver ATP content and ATPase activity in T2DM rats

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Fig 1 Effect of Neu-p11 on expression of AMPK and ERRα mRNA in liver of T2DM rats

Control: normal control group; Model: model group; MLT: melatonin group; Neu-L: Neu-p11 low dose group;Neu-H: Neu-p11 high dose group.**P<0.01,vscontrol;#P<0.05,##P<0.01,vsmodel.

3.4 PGC-1α、Mfn2蛋白的相對表達(dá)與正常組相比，T2DM大鼠肝臟的PGC-1α表達(dá)顯著升高，其中模型組的PGC-1α表達(dá)增加最為明顯(P<0.01)。相較模型組，給藥組對PGC-1α過度表達(dá)有所改善，Neu-p11高劑量組對其改善最為顯著(P<0.01)。

相比較正常組，T2DM模型組大鼠肝臟Mfn2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。相較模型組，褪黑素組和Neu-p11低組對Mfn2過度表達(dá)有所改善，其中褪黑素組和Neu-p11低劑量組對其改善最為顯著(P<0.01)。

4 討論

T2DM以IR為基礎(chǔ)的發(fā)病機(jī)制，以胰島素對肝臟、肌肉等周圍組織的主要攝取和葡萄糖利用能力降低為主要表現(xiàn)。IR的主要特點(diǎn)是代謝紊亂，T2DM狀態(tài)時(shí)，機(jī)體內(nèi)糖脂代謝紊亂，肝臟、肌肉等主要器官，胰島素的敏感性降低，胰島素作用能力減弱，對糖的利用和代謝降低，造成能量物質(zhì)堆積，形成IR的發(fā)展和加劇[6]。而線粒體功能與IR有重要聯(lián)系，線粒體是機(jī)體細(xì)胞內(nèi)最重要的能量代謝場所，由線粒體內(nèi)氧化磷酸化為主要途徑合成的ATP參與機(jī)體內(nèi)葡萄糖代謝，脂類代謝及多種代謝途徑，因此線粒體功能障礙則會(huì)導(dǎo)致肝臟中ATP合成減少，機(jī)體代謝紊亂，形成IR。而線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)平衡與功能調(diào)節(jié)有密切關(guān)系，維持線粒體基本形態(tài)和功能的根本就在于維持線粒體融合和分裂的動(dòng)態(tài)平衡[7-8]。

研究發(fā)現(xiàn)，線粒體融合依賴其主要蛋白之一為線粒體融合蛋白(Mfn2)，作用過程復(fù)雜，受多個(gè)相關(guān)因子的共同調(diào)節(jié)。機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子1α(PGC-1α)，它也是線粒體生物氧化的轉(zhuǎn)錄因子，它可協(xié)調(diào)下游靶基因雌激素相關(guān)受體α(ERRα)刺激線粒體Mfn2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)線粒體融合，同時(shí)也促進(jìn)線粒體能量代謝[9]。T2DM和IR時(shí)，Mfn2、PGC-1α表達(dá)降低，Mfn2與IR呈現(xiàn)相關(guān)性，Mfn2表達(dá)低下更容易造成IR的發(fā)生[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T2DM大鼠肝臟內(nèi)Mfn2和PGC-1α的蛋白表達(dá)上升，ERRα的mRNA表達(dá)異常增加，給予低劑量Neu-p11后，Mfn2、PGC-1α的蛋白及ERRαmRNA的表達(dá)異常明顯改善。

腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)作為PGC-1α上游重要的激活因子，同樣參與線粒體平衡的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，它作為重要的能量調(diào)節(jié)器，其活性直接影響了組織細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP的比值，由此影響PGC-1α的表達(dá)，參與機(jī)體內(nèi)的能量代謝活動(dòng)[11]。同時(shí)沉默蛋白調(diào)節(jié)因子(Sirt1)通過去乙?；饔?，激活PGC-1α促進(jìn)線粒體的生物合成，它在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、衰老、凋亡和代謝等方面發(fā)揮了重要作用。Sirt1/PGC-1α通路，可啟動(dòng)核呼吸因子NRF-1/2，調(diào)控線粒體DNA表達(dá)，參與線粒體生物合成和氧化磷酸化過程，影響線粒體的正常功能，影響線粒體內(nèi)ATP的合成及其酶活性[12]。IR發(fā)生時(shí)，AMPK、Sirt1表達(dá)降低，NRF-1/2表達(dá)減少，影響線粒體呼吸作用，進(jìn)而造成PGC-1α在機(jī)體內(nèi)表達(dá)降低，機(jī)體ATP合成減少，代謝失衡。本實(shí)驗(yàn)T2DM大鼠肝臟AMPK、Sirt1、Nrf-1/2 mRNA表達(dá)和ATP含量顯著降低，IR顯著，胰島素敏感性降低。給予藥物治療后， AMPK、Sirt1、Nrf-1/2 mRNAmRNA表達(dá)增加，ATP含量提升，ATP酶活力增加，IR改善明顯。

總而言之， Neu-p11通過改善T2DM大鼠肝臟內(nèi)PGC-1α、Mfn2的表達(dá)降低和相關(guān)因子ERRα、AMPK、Sirt1、NRF-1/2 mRNA的表達(dá)異常，增加肝臟ATP的含量，參與機(jī)體代謝，改善IR。線粒體功能的正常調(diào)節(jié)與其數(shù)量、形態(tài)和分布不可分割，這都需要通過維持線粒體融合與分裂的動(dòng)態(tài)平衡來實(shí)現(xiàn)。介入并干預(yù)T2DM與IR時(shí)線粒體融合與分裂，可能影響線粒體功能，影響其內(nèi)部的氧化磷酸化生成ATP，參與機(jī)體代謝而改善IR，可能是機(jī)體改善IR 和T2DM 的途徑之一。