miR-142-3p靶向HMGB1逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7對(duì)阿霉素的耐藥性

梁 璐，岑慧裕，洪 超，蔡曉彤，林忠曉，杜玲然，余細(xì)勇

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院、廣東省分子靶標(biāo)與臨床藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 511436)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是女性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是手術(shù)切除、放療和輔助化療。阿霉素(doxorubicin,DOX)常作為一線化療藥物用于治療乳腺癌[2]。目前，盡管開(kāi)發(fā)出了療效高、毒性小的化療藥物，但化療耐藥性仍是預(yù)后不良的主要原因。因此，了解阿霉素耐藥的分子機(jī)制可能會(huì)改善臨床治療效果。在眾多機(jī)制研究中，治療誘導(dǎo)的自噬是抗腫瘤治療的新機(jī)制[3]。

自噬是一個(gè)進(jìn)化上保守的過(guò)程，其特征是通過(guò)細(xì)胞的降解和循環(huán)來(lái)形成新的細(xì)胞[4]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，自噬有助于腫瘤化療耐藥的形成和各種壓力下的癌細(xì)胞存活[3]。最近，自噬抑制劑被用來(lái)提高癌癥對(duì)化療的敏感性[3]。因此，自噬抑制劑聯(lián)合治療可能有助于提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性。據(jù)報(bào)道，miRNAs可通過(guò)自噬調(diào)節(jié)化療和放療[3]。

MicroRNAs (miRNAs)是一類新的小分子非編碼內(nèi)源性RNAs，其長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸[5]。miRNAs可以通過(guò)切割、破壞靶向mRNAs的穩(wěn)定性或阻止其翻譯，轉(zhuǎn)錄后負(fù)性調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[5]。miR-142-3p最初在造血細(xì)胞中被鑒定，并作為T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的致癌標(biāo)志物[6]。此外，miR-142-3p被廣泛報(bào)道作為腫瘤抑制因子，參與到腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)、侵襲等病理過(guò)程[7]。

高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1,HMGB1)是一種非組蛋白核DNA結(jié)合蛋白，屬于高遷移率族蛋白超家族。HMGB1參與了DNA的組織和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，在炎癥、細(xì)胞分化和腫瘤細(xì)胞遷移等多種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮作用[8]。同時(shí)，抑制HMGB1的表達(dá)可以破壞端粒穩(wěn)態(tài)，抑制DNA損傷的修復(fù)，從而提高乳腺癌細(xì)胞的敏感性[8]。因此，HMGB1可能是促進(jìn)乳腺癌化療敏感性的關(guān)鍵基因。為了探討miR-142-3p在自噬和促進(jìn)乳腺癌化療敏感性中的調(diào)節(jié)作用，我們研究了miR-142-3p在提高人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞化療敏感性中的作用以及miR-142-3p與HMGB1之間的關(guān)系，本文將重點(diǎn)探討miR-142-3p通過(guò)靶向 HMGB1 參與乳腺癌化療敏感性調(diào)控的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2試劑 阿霉素(貨號(hào)：HZB1357)購(gòu)于華中海威基因科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基(貨號(hào)：12491-015)、胎牛血清(貨號(hào)：10099)購(gòu)于美國(guó) Gibco 公司；胰蛋白酶(貨號(hào)：T2601)、青-鏈霉素溶液(貨號(hào)：ZS507)、MTT(貨號(hào)：M2128)、DMSO(貨號(hào)：D2650)購(gòu)自美國(guó) Sigma公司；GAPDH抗體(貨號(hào)：TA-08)、抗兔二抗(貨號(hào)：ZDR-5118)、抗鼠二抗(貨號(hào)：ZDR-5117)購(gòu)自北京中杉金橋；HMGB1抗體(貨號(hào)：ABM24D3)、Atg5抗體(貨號(hào)：EPR1755)購(gòu)自Abcam公司；LC3抗體(貨號(hào)：L8918)購(gòu)自Sigma公司；Lipofectamine 2000(貨號(hào)：11668027)、 Trizol(貨號(hào)：10296010)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；熒光素酶報(bào)告試劑盒(貨號(hào)：KA3714)購(gòu)自美國(guó)Promege公司；Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：C1067S)購(gòu)自碧云天生物公司,Quantitect?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：204145)購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。

1.1.3儀器 低溫高速離心機(jī)(德國(guó) Hettich 公司)；垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó) Bio-Rad 公司) ；超凈工作臺(tái)( 蘇州儀器廠)；CO2培養(yǎng)箱( Thermo)；-80℃冰箱(Thermo Fisher Scientific Inc)；酶標(biāo)儀(美國(guó)加利福尼亞州森尼維爾市分子設(shè)備公司)；Agilent StrataGene Mx3000P QPCR(Agilent Technologies)；流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson-Facsort)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞系 以親本MCF-7細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞系)為材料，通過(guò)加入濃度逐漸升高的DOX處理細(xì)胞，建立阿霉素耐藥的MCF-7細(xì)胞系MCF/DOX。所有細(xì)胞均用含有10% FBS和1%青-鏈霉素的DMEM，在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MCF-7/DOX細(xì)胞在含1.0 mg·L-1DOX培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以維持MCF-7/DOX細(xì)胞耐藥性。

1.2.2MTT法 用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率和細(xì)胞毒性。按照說(shuō)明書(shū)操作。酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm處的吸光度值(OD值)。未經(jīng)DOX處理的細(xì)胞作為對(duì)照。按公式：細(xì)胞存活率/%=OD處理/OD對(duì)照×100%,求出各組的存活率，重復(fù)3次。計(jì)算并評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率。

1.2.3細(xì)胞凋亡測(cè)定 采用Annexin V-FITC/PI雙染聯(lián)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。用胰蛋白酶消化1 μmol·L-1DOX處理48 h后的各組細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液并用PBS洗滌兩次。每組加入5 μL Annexin V-FITC， 4 ℃下避光孵育10 min，加入10 μL PI 孵育10 min后，采用流式細(xì)胞儀讀取各組凋亡率。

1.2.4生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告分析 在熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)中，為了研究miR-142-3p是否調(diào)控HMGB1的表達(dá)，用QPCR方法從人類基因組DNA中擴(kuò)增出含有miR-142-3p結(jié)合序列的HMGB1基因的3′UTR片段的野生型(WT)及其突變體(MT)并構(gòu)建空白對(duì)照組(NC)。并將其插入PGL3熒光素酶載體中螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的3′UTR中。然后通過(guò)Lipofectamine 2000將WT或MT-pgl3-HMGB1-3′UTR與miR-NC、miR-142-3p、anti-miR-NC或anti-miR-142-3p聯(lián)合轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24 h后收集細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告分析試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定各組細(xì)胞中的熒光值。

1.2.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-142-3p mimics和相應(yīng)陰性對(duì)照miRNA control、si-HMGB1、pcDNA-HMGB1和相應(yīng)陰性對(duì)照(si-NC,pcDNA)的siRNA購(gòu)自上海吉瑪公司。將細(xì)胞接種到12孔板中，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。隨后，根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用Lipofectamine 2000對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，然后在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育6 h。隨后，用含有10% FBS的DMEM更換掉每孔中的培養(yǎng)基并孵育48 h。通過(guò)QPCR和Western blot測(cè)定轉(zhuǎn)染率。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量 PCR( QPCR)用TRIzol試劑提取總RNA。用Quantitect?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將500 ng的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。QPCR中使用的引物序列如下。取2 μL cDNA 于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀按SYBR Green PCR Master Mix說(shuō)明書(shū)進(jìn)行QPCR，反應(yīng)條件:95 ℃激活5 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min共50個(gè)循環(huán)。

Tab 1 Primers of QPCR

1.2.7Western blot 用RIPA提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，BCA液測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度，取等量的各組蛋白上樣,使用SDS-PAGE凝膠，在100 V恒壓下電泳，250 mA 恒流轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉封閉1 h，一抗 HMGB1(1 ∶5 000)、Agt5(1 ∶5 000)、LC3(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶10 000)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗孵育1 h，HRP化學(xué)發(fā)光液顯色。

2 結(jié)果

2.1 MCF-7和MCF-7/DOX細(xì)胞的特性驗(yàn)證用不同濃度的DOX(0.1625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5 μmol·L-1)處理MCF-7和MCF-7/DOX細(xì)胞48 h。Fig 1A的MTT結(jié)果顯示,與MCF-7/DOX細(xì)胞相比，MCF-7細(xì)胞對(duì)DOX的敏感性更高(P<0.05)。此外，用western blot和QPCR分別檢測(cè)MCF-7和MCF-7/DOX細(xì)胞中HMGB1和自噬相關(guān)蛋白(Atg5、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ)的水平，與MCF-7細(xì)胞相比，HMGB1在MCF-7/DOX細(xì)胞中的表達(dá)更高 (P<0.05)(Fig1B和C)。同時(shí)，MCF-7/DOX細(xì)胞中的自噬相關(guān)蛋白Atg5和LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的LC3-Ⅱ積累更明顯(P<0.05)(Fig 1D)。綜上所述，HMGB1和自噬可能與乳腺癌細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。

2.2 miR-142-3p對(duì)MCF-7和MCF-7/DOX細(xì)胞的影響為了研究miR-142-3p在乳腺癌化療耐藥中的作用，我們用QPCR檢測(cè)了MCF-7和MCF-7/DOX細(xì)胞中miR-142-3p的表達(dá)水平。Fig 2A 的 QPCR 結(jié)果顯示，與MCF-7細(xì)胞相比，MCF-7/DOX細(xì)胞中的miR-142-3p表達(dá)明顯降低(P<0.05) 。隨后，我們用miR-142-3p mimics提高miR-142-3p在MCF-7/DOX細(xì)胞中的表達(dá)(Fig 2B)。此外，miR-142-3p mimics 還可以提高M(jìn)CF-7/DOX細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性并且增強(qiáng)凋亡細(xì)胞比率(Fig 2C和D)(P<0.05)。上述結(jié)果表明，miR-142-3p的過(guò)表達(dá)可以提高M(jìn)CF-7/DOX細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。

Fig 1 Levels of HMGB1 and autophagy-related proteins in MCF-7/DOX and

A：Cell survival rates were detected by MTT assay in MCF-7 and MCF-7/DOX treated with various concentrations (0.1625,0.3125,0.625,1.25,2.5,5 μmol· L-1) of DOX for 48 hours; B,C and D：The levels of HMGB1 and autophagy-related proteins (Atg5,LC3-Ⅰ and LC3-Ⅱ). (D) MCF-7 and MCF-7/DOX cells were detected by Western blot and QPCR,respectively.*P<0.05vsMCF-7 cells.

Fig 2 Effect of miR-142-3p on MCF-7 and MCF-7/DOX

A：QPCR analysis of the relative miR-142-3p expression in parental MCF-7 and DOX-resistant MCF-7/DOX cells.*P<0.05vsMCF-7 cells. B：QPCR analysis of relative miR-142-3p expression in MCF-7/DOX cells transfected with miR-142-3p mimic.*P<0.05vsmiR-NC in MCF-7/DOX cells. C：MTT assay was applied to determine the IC50value in miR-NC or miR-142-3P transfected MCF-7/DOX cells after treatment with different doses of DOX (0.1625,0.3125,0.625,1.25,2.5,and 5 μmol·L-1) for 48 h.*P<0.05vsmiR-NC in MCF-7/DOX cells. D：Transfected MCF-7/DOX cells were treated with or without DOX for 48h,followed by the assessment of apoptotic rate by flow cytometry,respectively.*P<0.05vsmiR-NC in MCF-7/DOX cells. E. The statitics of apoptotic cells.*P<0.05 vs miR-NC in MCF-7/DOX cells.

2.3 miR-142-3p靶向HMGB1通過(guò)生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，miR-142-3p可能靶向調(diào)控HMGB1(Fig 3A)。為了確定miR-142-3p是否可以直接靶向HMGB1，我們?cè)贛CF-7/DOX 細(xì)胞中開(kāi)展雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在MCF-7/DOX 細(xì)胞中，與 Scramble 組相比，miR-142-3p mimics能夠抑制野生型 PGL3-WT-HMGB1 熒光素酶活性(P<0.05)。而當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)突變后miR-142-3p mimics對(duì)突變型 pGL3-MT-HMGB1熒光素酶活性無(wú)抑制效果( Fig 3B)(P<0.05)。隨后用Western blot檢測(cè)HMGB1的蛋白水平，如Fig 3C所示，miR-142-3p mimics可降低HMGB1的表達(dá)(P<0.05)。這說(shuō)明HMGB1和 miR-142-3p在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

2.4 沉默HMGB1提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性我們通過(guò)沉默MCF-7/DOX細(xì)胞中的HMGB1的表達(dá)來(lái)研究HMGB1的潛在機(jī)制 (Fig 4A)。如Fig 4B 和C所示，下調(diào)HMGB1可提高M(jìn)CF-7/DOX細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性并且增強(qiáng)凋亡細(xì)胞比率(P<0.05)。

2.5 miR-142-3p通過(guò)抑制自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，靶向HMGB1增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的化療敏感性為了研究miR-142-3p與HMGB1相互作用調(diào)節(jié)藥物敏感性的機(jī)制，分別用miR-NC、miR-142-3p 或miR-142-3p +pcDNA-HMGB1轉(zhuǎn)染MCF-7/DOX細(xì)胞。結(jié)果表明，HMGB1的過(guò)表達(dá)則大大削弱了MCF-7/DOX細(xì)胞中miR-142-3p產(chǎn)生的阿霉素敏感性(Fig 5A)(P<0.05)。此外，HMGB1的過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了MCF-7/DOX細(xì)胞中的miR-142-3p對(duì)凋亡的促進(jìn)作用(Fig 5B)(P<0.05)。這些結(jié)果表明，通過(guò)靶向HMGB1，miR-142-3p提高了乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。用 Western blot檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白水平的表達(dá)，miR-142-3p的過(guò)表達(dá)顯著降低了MCF-7/DOX細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Atg5和LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ的水平，而HMGB1的過(guò)表達(dá)有效地恢復(fù)了miR-142-3p導(dǎo)致的自噬相關(guān)蛋白水平的降低(Fig 5C)(P<0.05)。綜上所述，通過(guò)靶向HMGB1抑制自噬，miR-142-3p提高了乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。

Fig 3 HMGB1 expression inhibitedby miR-142-3p via binding to its

A：Diagram of putative miR-142-3p binding sequence in HMGB1 3′UTR and its mutant in luciferase reporter assay. B：Luciferase reporter assay was performed to measure luciferase activity in MCF-7/DOX cells,respectively. C：Western blot analysis of HMGB1 protein levels in MCF-7/DOX cells.*P<0.05vsmiR-NC in MCF-7/DOX cells.

3 討論

阿霉素是治療各種癌癥最常用的抗癌藥物之一。然而，阿霉素產(chǎn)生耐藥性是臨床上常見(jiàn)的事件。研究表明，耐藥性的發(fā)展與癌細(xì)胞中的miRNAs表達(dá)改變密切相關(guān)[9]。miRNAs被廣泛認(rèn)為是細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)展、生長(zhǎng)、增殖和癌癥耐藥性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[5]。在乳腺癌治療中，一系列的miRNAs參與了化療敏感性的調(diào)節(jié)，如miR-186-5p[10]和miR-129-5p[11]。miR-142-3P參與多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。例如，miR-142-3p的過(guò)度表達(dá)可以抑制骨肉瘤細(xì)胞[12]、宮頸癌[13]和結(jié)腸癌[14]的增殖。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p的過(guò)表達(dá)可增加MCF-7細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。

HMGB1作為一種自噬和凋亡調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移和腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[12]。在非小細(xì)胞肺癌[13]、心肌細(xì)胞[14]中發(fā)現(xiàn)HMGB1是miR-142-3p的直接作用靶點(diǎn)。隨后，我們進(jìn)一步揭示了miR-142-3p增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感性的作用機(jī)制。通過(guò)生物信息學(xué)和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)HMGB1是miR-142-3p的直接作用靶點(diǎn)，HMGB1在許多類型的腫瘤中過(guò)表達(dá)，包括乳腺癌[15]。我們發(fā)現(xiàn)與親本MCF-7細(xì)胞相比，在MCF-7/DOX細(xì)胞中HMGB1的mRNA和蛋白質(zhì)水平都有很高的表達(dá)。此外，沉默HMGB1增強(qiáng)了阿霉素敏感性，并促進(jìn)了阿霉素誘導(dǎo)的MCF-7/DOX細(xì)胞凋亡。同時(shí)，在MCF-7/DOX細(xì)胞中，HMGB1過(guò)表達(dá)后則大大削弱了miR-142-3p產(chǎn)生的阿霉素敏感性。上述結(jié)果表明，miR-142-3p通過(guò)靶向HMGB1增強(qiáng)了耐藥細(xì)胞系對(duì)阿霉素的敏感性。

自噬是細(xì)胞自我消化的過(guò)程，通過(guò)降解和再利用細(xì)胞中那些不需要的或功能失調(diào)的成分來(lái)維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[4]。自噬在腫瘤發(fā)育中起著雙重作用。自噬可以清除突變或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，并在腫瘤形成初期減輕細(xì)胞應(yīng)激，起到抑制作用；另一方面，自噬使腫瘤細(xì)胞在應(yīng)激條件下形成藥物化療的屏障[3]。因此，我們推測(cè)抑制自噬可克服耐藥性，有利于癌癥治療。我們的結(jié)果表明，阿霉素可導(dǎo)致自噬活性增加，miR-142-3p的過(guò)度表達(dá)通過(guò)抑制自噬顯著提高了阿霉素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。miR-142-3p/HMGB1參與乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程，為提高乳腺癌對(duì)藥物的敏感性提供了新的靶點(diǎn)，具有一定應(yīng)用價(jià)值。

Fig 4 Sensitivity of breast cancer cells to DOX enhanced by

A：Western blot analysis of HMGB1 protein level in transfected MCF-7/DOX cells. B：MTT assay was applied to determine the cell viability and DOX. IC50value in si-NC- or si-HMGB1-transfected MCF-7/DOX cells after treatment with different doses of DOX (0.1625,0.3125,0.625,1.25,2.5,and 5 μmol· L-1) for 48 h. C：Flow cytometry analysis of apoptosis in si-NC or si-HMGB1-transfected MCF-7/DOX cells with or without DOX treatment.*P<0.05vssi-NC in MCF-7/DOX cells.D. The statitics of apoptotic cells.*P<0.05vssi-NC in MCF-7/DOX cells.

Fig 5 Drug sensitivity of breast cancer cells enhancedby miR-142-3p upregulationthrough suppressing

A：Transfected MCF-7/DOX cells were treated with different doses of DOX (0.1625,0.3125,0.625,1.25,2.5,and 5 μmol· L-1) for 48 h,respectively,then MTT assay was used to determine the cell viability and IC50value. B：Transfected MCF-7/DOX cells were treated with 3 μmol· L-1DOX for 48 h,respectively,followed by the detection of apoptotic rate by flow cytometry. C：The level of autophagy related proteins Atg5,LC3-Ⅰ and LC3-Ⅱ in MCF-7/DOX cells transfected with miR-NC,miR-142-3p,or miR-142-3p +pcDNA-HMGB1 were detected by Western blot.*P<0.05 vs miR-142-3p in MCF-7/DOX cells.