不同產(chǎn)地澤瀉HPLC 指紋圖譜建立及模式識別

金立陽，汪英俊，葉淑青，李存玉，彭國平，鄭云楓

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023）

澤瀉是澤瀉科植物澤瀉Alisma orientale（Sam.）Juzep.的干燥塊莖［1］，其傳統(tǒng)主產(chǎn)地為四川、福建與江西。然而根據(jù)近幾年文獻報道與實地考察發(fā)現(xiàn)，四川產(chǎn)量最大，廣西次之，福建與江西由于市場因素影響已逐漸退出主產(chǎn)區(qū)［2］。目前，已有澤瀉指紋圖譜的相關(guān)報道［3-7］，但針對四川、廣西產(chǎn)地澤瀉指紋圖譜與差異性成分的研究較少。

本研究收集了19 批四川產(chǎn)地澤瀉、11 批廣西產(chǎn)地澤瀉，通過指紋圖譜結(jié)合模式識別（聚類分析、主成分分析和正交最小二乘法判別分析）進行綜合分析［8-11］，將這2 個產(chǎn)地藥材進行區(qū)分，并探討它們之間成分的差異，以期為其質(zhì)量控制與評價、制劑生產(chǎn)、臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

Waters e2695 型高效液相色譜儀（配置2998PDA 二極管陣列檢測器，美國Waters 公司）；Triple TOFTM5600 型質(zhì)譜儀（美國AB Sciex 公司）；KH-250B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AL210 型電子分析天平（萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；HP-02 型多功能粉碎機（永康市帥通電器廠）。

對照品澤瀉醇A（批號JBZ-1648）、24-乙酰澤瀉醇A（批號JBZ-1665）、澤瀉醇B（批號JBZ-1649）、23-乙酰澤瀉醇B（批號JBZ-1419）質(zhì)量分數(shù)均大于98.0%，均購于南京金益柏生物技術(shù)有限公司。乙腈（色譜純，美國Tedia 公司）；甲酸（色譜純，德國Merck 公司）；冰醋酸為分析純。30 批澤瀉分別收購于四川和廣西，具體見表1，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院嚴輝副教授鑒定為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientale（Sam.）Juzep.的干燥塊莖。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B 對照品適量，加乙腈溶解，即得。

2.2 供試品溶液制備 稱取澤瀉粉末（過5 號篩）2.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入10 mL 乙腈，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ?50 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，乙腈補足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜。精密吸取1 mL 續(xù)濾液，加入2 μL 冰醋酸，搖勻，即得。

2.3 色譜條件 Hanbon Hedera ODS-2 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～15 min，60%～45%A；15～32 min，45%～5%A；32～50 min，5%～3%A；50～55 min，3%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；檢測波長210 nm；進樣量10 μL。

2.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正離子模式檢測；掃描范圍m／z50～2 000；噴霧電壓5 500 V；解簇電壓100 V；碰撞電壓40、20 V；離子源溫度600 ℃；霧化器壓力413.7 kPa；輔助加熱器壓力413.7 kPa；氣簾氣壓力275.8 kPa。

3 方法學(xué)考察

3.1 精密度試驗 取澤瀉1 份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項條件下連續(xù)進樣6 次。以澤瀉醇B 為對照峰，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD 均小于2.08%，表明儀器精密度良好。

3.2 重復(fù)性試驗 取同一澤瀉6 份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項條件下進樣，以澤瀉醇B 為對照峰，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD 均小于2.93%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗 取澤瀉1 份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項條件下于0、2、4、8、12、24 h 進樣，以澤瀉醇B 為對照峰，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD 均小于2.53%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4 不同產(chǎn)地澤瀉指紋圖譜建立

4.1 相似度分析 30 批澤瀉按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項條件下進樣，記錄55 min 色譜圖。將30 批圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012 版）”，計算各批澤瀉與對照圖譜的相似度。結(jié)果，四川產(chǎn)地澤瀉相似度為0.937～0.968，廣西產(chǎn)地澤瀉相似度為0.240～0.364，表明兩地藥材成分差異性較大，而同一產(chǎn)地差異較小。因此，不能建立同一指紋圖譜，而應(yīng)各自進行分析。

4.2 指紋圖譜建立 分別將19 批四川產(chǎn)地澤瀉（S1～S19）、11 批廣西產(chǎn)地澤瀉（S20～S30）圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012 版）”進行分析，結(jié)果見圖1。S1～S19的相似度分別為0.995、0.995、0.975、0.976、0.995、0.977、0.997、0.967、0.994、0.973、0.990、0.991、0.992、0.987、0.997、0.996、0.993、0.996、0.992，而S20～S30 分別為0.982、0.960、0.987、0.978、0.963、0.980、0.994、0.948、0.976、0.998、0.990，兩地均在0.94 以上，表明同一產(chǎn)地澤瀉成分接近，穩(wěn)定性較好。

圖1 不同產(chǎn)地樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of samples from different growing areas

4.3 共有峰標定與分析 根據(jù)指紋圖譜分析結(jié)果，分別從19 批四川產(chǎn)地澤瀉中標定了17 個共有峰，11 批廣西產(chǎn)地澤瀉中標定了12 個，按保留時間進行排序，共有21 個色譜峰，見圖2。由此可知，峰1、2、11、13～14、16、18～19 為兩地共有，峰3～7、9～10、20～21 為四川獨有，而峰8、12、15、17 為廣西獨有；四川峰14、16、18 較高，而廣西峰11 較高。根據(jù)對照圖譜可以直觀看出，四川、廣西產(chǎn)地澤瀉成分差異明顯。

圖2 不同產(chǎn)地樣品對照圖譜Fig.2 Reference chromatograms of samples from different growing areas

5 化學(xué)模式識別

5.1 聚類分析 將不同產(chǎn)地、批次樣品指紋圖譜標定的21 個色譜峰峰面積導(dǎo)入SPSS 24.0 軟件（若在該保留時間下無對應(yīng)色譜峰，則將峰面積定為0），峰面積數(shù)據(jù)進行Z 得分標準化后以平方Euclidean 距離為度量標準，采用組間聯(lián)接法，對標準化的數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類，結(jié)果見圖3。根據(jù)聚類分析結(jié)果，在度量距離為10 時，30 批澤瀉可聚為2 類，其中S1～S19 聚合為一類，S20～S30 聚合為一類，不同批次樣品按產(chǎn)地聚合，與相似度分析結(jié)果一致。

圖3 30 批樣品聚類樹狀圖Fig.3 Dendrogram of thirty batches of samples

5.2 主成分分析 將不同產(chǎn)地、批次樣品指紋圖譜標定的21 個色譜峰峰面積導(dǎo)入SIMCA14.1 軟件（若在該保留時間下無對應(yīng)色譜峰，則將峰面積定為0），采用無監(jiān)督模式識別-主成分分析，用前2個主成分進行區(qū)分。建立模型的R2Y（累計解釋參數(shù)）為0.863，Q2（預(yù)測能力參數(shù)）為0.751，表明其區(qū)分與預(yù)測能力良好，可進行產(chǎn)地區(qū)分。主成分分析得分圖見圖4，以中軸為界限，左邊為廣西產(chǎn)地澤瀉，右邊為四川產(chǎn)地澤瀉。

圖4 30 批樣品主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis plot for thirty batches of samples

5.3 正交最小二乘法判別分析 相似度分析、聚類分析、主成分分析都可以發(fā)現(xiàn)2 個產(chǎn)地澤瀉差異性較大，為了進一步探究它們之間成分的差異性，使用正交最小二乘法判別分析，生成變量重要投影，見圖5，得出各標定峰對于區(qū)分兩地澤瀉的貢獻程度。以VIP 大于1 作為標準，篩選出了6 個對區(qū)分2 個產(chǎn)地澤瀉貢獻較大的變量，按影響大小排列依次為峰16、峰11、峰19、峰18、峰14、峰13，兩地共有峰中都包括這6 種成分。

圖5 變量重要性投影圖Fig.5 VIP plot of OPLS-DA

以上結(jié)果表明，四川、廣西產(chǎn)地澤瀉中這6 種成分區(qū)別較大，可能是導(dǎo)致其相似度較差的主要原因，可據(jù)此對2 個產(chǎn)地樣品進行鑒別。

5.4 共有峰定性分析 為了確認四川、廣西產(chǎn)地澤瀉之間的差異性成分，采用HPLC-MS／MS 結(jié)合對照品比對，對上述標定的21 個色譜峰進行鑒定，在“2.3”“2.4”項條件下進樣（為了提高檢出靈敏度，流動相中的水換為0.1%甲酸［12］），結(jié)果見表2。

表2 樣品成分二級質(zhì)譜鑒定結(jié)果Tab.2 MS／MS identification results of constituents in samples

除11～13 號峰外，各成分均存在準分子離子［M＋H］＋。以11 號峰為例，正離子模式下掃描顯示m／z473［M ＋H-H2O］＋，455［M ＋H-2H2O］＋，437［M＋H-3H2O］＋，383［M＋H-H2O-C4H10O2］＋，339［M＋H-H2O-C6H14O3］＋。依據(jù)文獻［14］中澤瀉醇A 裂解數(shù)據(jù)結(jié)合相應(yīng)對照品，鑒定11 號峰為澤瀉醇A。其余成分按該方法，依照相關(guān)文獻數(shù)據(jù)［13-15］及對照品，結(jié)合一級、二級離子碎片信息進行鑒定。

6 討論

本實驗用甲醇、80%乙腈、90%乙腈、乙腈進行超聲提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈提取時較甲醇基線更穩(wěn)定，較80%、90% 乙腈出峰多，峰形好，此外2015 年版《中國藥典》中澤瀉也采用該溶劑提?。?］。因此，本實驗選擇乙腈。

澤瀉作為常用的傳統(tǒng)中藥，其產(chǎn)地在不斷變遷，由內(nèi)陸向沿海地區(qū)擴張［16］。自從清代以來，其道地產(chǎn)區(qū)一直是福建，但目前當?shù)胤N植面積與市場占有率嚴重下降［2］，故對比四川、廣西這2 個主要產(chǎn)區(qū)的澤瀉更具有實際意義。

結(jié)果顯示，四川、廣西產(chǎn)地澤瀉成分差異較大，通過化學(xué)模式識別結(jié)合HPLC-MS／MS，篩選并鑒定出6 種主要差異性成分，按影響大小排列依次為澤瀉醇B、澤瀉醇A、11-去氧澤瀉醇C、23-乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇O、24-乙酰澤瀉醇A。今后，可進一步以這6 種成分為指標，對兩地澤瀉進行區(qū)分，如針對其中差異性最大的澤瀉醇B 進行含有量測定；制定兩地澤瀉醇B 含有量限度標準以判別藥材產(chǎn)地。

四川、廣西產(chǎn)地澤瀉成分的差異性可能是由種質(zhì)差異與生長環(huán)境差異造成的，四川種質(zhì)來源于當?shù)?，并進行了雜交留種實驗；廣西種質(zhì)來源于福建，后為當?shù)亓舴N，并且未經(jīng)過擇優(yōu)選育［2］；由于地理位置不同，導(dǎo)致兩地水質(zhì)、土壤、日照、溫度等方面存在差別。有研究針對澤瀉根際土壤與塊莖中無機元素進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)塊莖中部分元素積累受土壤影響明顯［17］，表明不同土壤背景也可能是導(dǎo)致澤瀉成分變化的原因之一。

現(xiàn)代研究表明，澤瀉中24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇A 都具有降血脂活性，但澤瀉醇B 卻不能抑制血脂升高［18］，表明四川、廣西產(chǎn)地澤瀉成分的明顯差異可能會導(dǎo)致其藥理作用區(qū)別較大。本研究篩選出的6 種主要差異性成分需要作進一步藥理分析，結(jié)合與藥效之間的關(guān)系探究可能導(dǎo)致的藥效差別。在當前成分與藥效之間關(guān)系還不明確的情況下，制劑生產(chǎn)與臨床應(yīng)用時應(yīng)注意澤瀉來源，并使用固定產(chǎn)地的藥材以保障質(zhì)量穩(wěn)定、療效確切。