分子診斷技術(shù)在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

尤明亮

天津市西青區(qū)疾病預(yù)防控制中心 300393

無(wú)論是引起感染甚至傳染病的微生物，還是食源性病原微生物，都會(huì)給人類(lèi)健康造成不同程度的威脅，且兩種病原微生物之間存在一定的共性，突出表現(xiàn)為種類(lèi)繁多，變異速度異常迅猛，現(xiàn)有的病原微生物主要包括細(xì)菌、病毒等幾種類(lèi)型。針對(duì)病原微生物進(jìn)行科學(xué)合理的檢測(cè)與判斷，可起到預(yù)防并控制疾病的作用，也給后續(xù)用藥奠定了基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)和判斷以病原微生物分離為主，還存在過(guò)度依賴病原微生物生理生化特征和形態(tài)學(xué)觀察等問(wèn)題。這種方法雖然起到了一定的作用，但是存在明顯的局限性。加之不斷發(fā)現(xiàn)的病原微生物的影響，病原微生物檢測(cè)工作的難度與日俱增，如何更好地完成病原微生物檢測(cè)，已經(jīng)成為各級(jí)研究人員重點(diǎn)研究的問(wèn)題。

1 以雜交為核心發(fā)展起來(lái)的分子診斷技術(shù)

1.1 基因芯片技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展 基于核酸分子雜交發(fā)展而來(lái)的基因芯片也可稱之為DNA芯片，基因芯片技術(shù)主要是借助特殊的功法，將核酸探針?lè)肿优帕兄撂幚磉^(guò)的玻璃片或者硝酸纖維素膜表面，最為常用的方法為光導(dǎo)原位合成，還可適當(dāng)使用微量點(diǎn)樣法。值得注意的是，用于承載核酸探針?lè)肿拥闹С治锝y(tǒng)一為2cm2。排列工作完成后需要進(jìn)行雜交，雜交對(duì)象以標(biāo)記樣品分子為主，從而利用先進(jìn)的計(jì)算機(jī)軟件和信息技術(shù)判斷樣品信號(hào)，將信號(hào)的強(qiáng)弱作為著手點(diǎn)，明確樣品中是否存在病原微生物，如果發(fā)現(xiàn)病原微生物的存在，還要了解其數(shù)量信息[1]。相對(duì)于以往的檢測(cè)技術(shù)而言，基因芯片技術(shù)的特異性更強(qiáng)，且擁有高通量化的優(yōu)勢(shì)。但是受到成本的影響，基因芯片技術(shù)還未大面積的推廣與使用。另外，基因芯片技術(shù)的專業(yè)性較強(qiáng)，涉及多個(gè)學(xué)科，推廣難度較高[2]。在醫(yī)學(xué)技術(shù)和檢測(cè)水平不斷提高的同時(shí)，人們發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的特異性記憶，這給基因芯片技術(shù)的發(fā)展注入了全新的活力。長(zhǎng)此以往，基因芯片技術(shù)一定會(huì)在基層大面積推廣并使用，檢測(cè)結(jié)果更是會(huì)得到跨越式的提升。

1.2 DNA傳感器技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展 DNA是DNA傳感器技術(shù)的重要組成部分，扮演著極為重要的角色，起著敏感元件的作用，而核酸雜交則是DNA傳感器技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)與核心。利用DNA傳感器技術(shù)進(jìn)行病原微生物檢測(cè)時(shí)，需要在傳感器上固定一條單鏈DNA，此時(shí)的DNA序列為已知狀態(tài)，然后通過(guò)與互補(bǔ)單鏈DNA雜交的方式對(duì)病原微生物中的信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)[3]。檢測(cè)工作主要是圍繞可檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行，而現(xiàn)階段的可檢測(cè)信號(hào)分為光或電幾種。因此應(yīng)利用相應(yīng)的技術(shù)或信號(hào)轉(zhuǎn)化器，將原本不可檢測(cè)的濃度轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓹z測(cè)信號(hào)[4]。如今，DNA傳感器主要由兩大部件組成。分別是識(shí)別元件還有信號(hào)轉(zhuǎn)換器，而敏感元件還可細(xì)分至兩個(gè)類(lèi)別，分別為免疫傳感器，還有DNA傳感器。DNA傳感器并不是像我們想象中的那樣強(qiáng)大，雖然說(shuō)其速度較快，準(zhǔn)確性較高，但是靈敏度卻遠(yuǎn)不及其他類(lèi)型的傳感器，且存在特異性較差的問(wèn)題。有學(xué)者將三種技術(shù)聯(lián)合起來(lái)創(chuàng)造了創(chuàng)新型的DNA傳感器檢測(cè)系統(tǒng)，這個(gè)基于DNA生物傳感技術(shù)，還有真菌核糖體分型技術(shù)建立起來(lái)的真菌檢測(cè)DNA傳感器檢測(cè)系統(tǒng)，有效地縮短了檢測(cè)時(shí)間，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法需要3d左右才能全部完成診斷工作，而該系統(tǒng)將診斷時(shí)間縮短至6h，為病原微生物的分型研究提供了全新的思路[5]。

2 以擴(kuò)增為核心發(fā)展起來(lái)的分子診斷技術(shù)

2.1 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展 作為一種核苷酸引物，可在基因組DNA區(qū)域中起到擴(kuò)增PCR的作用，這是RAPD最為顯著的作用，但是對(duì)溫度提出了較高的要求，必須處于低復(fù)性溫度之下，且基因組DNA區(qū)域必須擁有較高的同源性[6]。因?yàn)?，菌株之間存在一定的差異性，所以任意引物雜交的位置也會(huì)因?yàn)榫曛g的差異而發(fā)生變化，數(shù)目也不相同。從理論上講，模板任意引物雜交可形成特定的圖譜。要想在檢測(cè)過(guò)程中了解菌株基因組DNA的特點(diǎn)，必須善于利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳，這是利用多態(tài)性檢測(cè)反映出不同菌株特點(diǎn)的重要舉措[7]。從某種角度來(lái)說(shuō)，基于脈沖場(chǎng)凝膠電泳進(jìn)行的多態(tài)性檢測(cè)是一種用于DNA分型的重要手段，在菌株分子分型鑒定中起著極為重要的作用，也是分子診斷技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。經(jīng)諸多實(shí)踐證明，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)擁有簡(jiǎn)便且快速的特性，但是其重復(fù)性有待提升，并對(duì)聚合酶類(lèi)型提出了較為苛刻的要求，只有在規(guī)定量的DNA濃度或質(zhì)量中才可使用[8]。

2.2 數(shù)字PCR技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展 數(shù)字PCR技術(shù)的研究與應(yīng)用，逐步實(shí)現(xiàn)了絕對(duì)定量樣品的目標(biāo)。該技術(shù)主要是通過(guò)微球乳糜液化的作用，將乳糜液成功的分散至芯片微孔當(dāng)中，每個(gè)芯片微孔當(dāng)中至少有一個(gè)核酸模板的存在[9]。然后利用恰當(dāng)?shù)脑噭┖腿玖蠈?duì)芯片微孔釋放的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。這樣做的目的是判斷反應(yīng)體系中是否有靶核酸模板的存在，有把核酸模板的芯片微孔會(huì)在檢測(cè)過(guò)程中釋放出相應(yīng)的熒光信號(hào)，通過(guò)對(duì)兩種信號(hào)的數(shù)目和比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后，即可明確絕對(duì)定量[10]。從本質(zhì)上來(lái)說(shuō)，數(shù)字PCR與定量PCR之間存在極大的不同，最為突出的就是數(shù)字PCR擺脫了定量PCR必須應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線的難題，且不會(huì)對(duì)模板Ct值產(chǎn)生過(guò)多地依賴，并在絕對(duì)定量當(dāng)中起到了極為重要的作用。靈敏度較高，準(zhǔn)確度良好。當(dāng)前，微滴式數(shù)字PCR已經(jīng)得到了大面積的應(yīng)用，并以商品化的形式應(yīng)用于多項(xiàng)臨床領(lǐng)域，例如牛丘疹病毒、口腔病毒還有巨細(xì)胞病毒的檢測(cè)當(dāng)中[11]。

2.3 核酸適配體技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展 經(jīng)過(guò)不斷的實(shí)踐和發(fā)展，核酸適配體技術(shù)的應(yīng)用范圍越來(lái)越廣，現(xiàn)已成功應(yīng)用于臨床診斷當(dāng)中，臨床治療也有核酸適配體技術(shù)的身影。所謂核酸適配體技術(shù)，就是利用必要的手段尋找寡核苷酸片段，這種片段可以是蛋白或者酶，也可以是小分子物質(zhì)，其具備親和力較高的特征，需要在隨機(jī)寡核苷酸序列庫(kù)中進(jìn)行反復(fù)的篩選，篩選時(shí)多使用配體系統(tǒng)凈化技術(shù)[12]。該技術(shù)主要由擴(kuò)增、調(diào)節(jié)、分離等5個(gè)步驟組成，還有結(jié)合和洗脫。雖然，每個(gè)步驟都相當(dāng)重要，但是最為核心的就是分離，這也是適配體靶分子篩選的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。適配體的特征相當(dāng)明顯，擁有較高的特異性，親和力較強(qiáng)，靶標(biāo)范圍極為廣泛，修飾較為簡(jiǎn)單。可大面積應(yīng)用于某種特定蛋白的適配體當(dāng)中，核酸的適配體也可對(duì)其進(jìn)行使用。不久的將來(lái)，適配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)極有可能完全取代抗體，但是現(xiàn)有的技術(shù)仍舊無(wú)法達(dá)成抗體取得的成就，在適配體種類(lèi)方面仍有一定的局限。但是已經(jīng)有學(xué)者對(duì)核酸適配體技術(shù)的應(yīng)用提出了全新的思路，無(wú)論是特異性傳遞系統(tǒng)，還是基因治療，都為核酸適配體技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展指明了確切的方向[13]。

3 以序列為核心發(fā)展起來(lái)的分子診斷技術(shù)

高通量測(cè)序主要由3個(gè)部分構(gòu)成，分別為第二代邊合成邊測(cè)序、第三代單分子測(cè)序和第四代納米孔測(cè)序技術(shù)[14]。高通量測(cè)序的特征十分鮮明，優(yōu)勢(shì)也較為明顯，可應(yīng)用于大樣品當(dāng)中。但是其專業(yè)性較強(qiáng)，對(duì)操作人員的技術(shù)水平和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)均提出了較高的要求。無(wú)論是在結(jié)核病的早期分型和計(jì)算分析當(dāng)中，還是對(duì)耐藥基因進(jìn)行的研究，都可利用高通量測(cè)序?？梢?jiàn)，高通量測(cè)序在病原微生物檢測(cè)中做出了突出的貢獻(xiàn)。在不斷研究與深化的過(guò)程中，基于雜交而發(fā)展起的擴(kuò)張分組技術(shù)極有可能被高通量測(cè)序所取代，用于預(yù)防流行性疾病的爆發(fā)與惡化。

如今，第二代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)取得了極為顯著的成就，并在不斷運(yùn)行過(guò)程中形成了完善且成熟的測(cè)序技術(shù)。但成本昂貴的問(wèn)題并沒(méi)有得到改善，甚至?xí)跍y(cè)序過(guò)程中出現(xiàn)低級(jí)錯(cuò)誤，這也是制約第二代測(cè)序技術(shù)推廣的直接因素。在第二代測(cè)序的基礎(chǔ)之上，第三代測(cè)序技術(shù)完成了測(cè)序時(shí)間和成本的改善，且將單分子測(cè)序的目標(biāo)落實(shí)到了整個(gè)檢測(cè)工作當(dāng)中。但是過(guò)于昂貴的儀器成本和數(shù)據(jù)分析等因素，仍舊制約了第三代測(cè)序技術(shù)的推廣與使用[15]。納米孔測(cè)序技術(shù)就是指第四代基因測(cè)序技術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)可以說(shuō)是以下兩種技術(shù)的結(jié)合，也就是單分子檢測(cè)技術(shù)，還有電子信號(hào)檢測(cè)技術(shù)。雖然說(shuō)納米孔檢測(cè)技術(shù)擁有極強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，并進(jìn)行了多次實(shí)踐與使用，但是還未形成成熟的運(yùn)行體系，并未進(jìn)入商用階段。

4 討論

雖然，分子診斷技術(shù)在診斷效率和結(jié)果準(zhǔn)確性方面占據(jù)無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，但是其應(yīng)用范圍仍舊不如傳統(tǒng)的檢測(cè)方法。就目前來(lái)看，大多數(shù)食源性病原微生物檢測(cè)和醫(yī)學(xué)性病原微生物檢測(cè)仍然依靠傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，這不僅是因?yàn)閭鹘y(tǒng)的病原微生物檢測(cè)相對(duì)可靠，還因?yàn)樾屡d的分子診斷技術(shù)存在試劑成本高、儀器價(jià)格昂貴等多種局限。如今，只有國(guó)家級(jí)科研機(jī)構(gòu)或者海關(guān)開(kāi)始應(yīng)用分子診斷技術(shù)，大多數(shù)基層單位還是使用傳統(tǒng)方法進(jìn)行檢測(cè)。值得注意的是，現(xiàn)階段仍然沒(méi)有一種單一的分子診斷技術(shù)，可滿足高靈敏度和自動(dòng)化等多項(xiàng)要求?？梢?jiàn)，不僅要克服分子診斷技術(shù)在推廣與應(yīng)用中的不足，還要利用多學(xué)科聯(lián)用的方式提高分子診斷技術(shù)的自動(dòng)化水平。這有助于病原微生物檢測(cè)取得更為理想的成果，并朝向自動(dòng)化的方向發(fā)展。在多個(gè)部門(mén)和各級(jí)研究人員的努力之下，新型分子診斷技術(shù)一定會(huì)實(shí)現(xiàn)高通量、多組學(xué)聯(lián)合判斷的目標(biāo)，更好地作用于病原微生物檢測(cè)中。