實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用*

高 紡 李 丹 余新雅

安徽中醫(yī)藥大學(xué) 1 中醫(yī)學(xué)院 2 門診部 3 針灸推拿學(xué)院，安徽省合肥市 230038

隨著時(shí)代的快速發(fā)展，先進(jìn)的科學(xué)研究技術(shù)層出不窮。1987年，科學(xué)家Kary Mullis發(fā)明的聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)得到了生命科學(xué)界的一致認(rèn)可，并于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。從此，PCR作為一種先進(jìn)的研究技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究，然而傳統(tǒng)的PCR技術(shù)在研究中只能進(jìn)行“定性”分析，不能進(jìn)行準(zhǔn)確的定量研究，從而在臨床應(yīng)用中受到很大限制。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，加入熒光基團(tuán)，融合了傳統(tǒng)PCR高靈敏度，DNA技術(shù)的高特異性以及光譜技術(shù)的準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn)，克服了PCR技術(shù)不能定量研究的缺點(diǎn)，同時(shí)具有高靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性的一種定量研究技術(shù)，能夠更早地做到腫瘤基因早期診斷[1]，已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)中重要的研究技術(shù)之一。目前該技術(shù)已逐漸成為醫(yī)學(xué)腫瘤研究中的重要手段，將在未來(lái)腫瘤發(fā)病機(jī)制研究中占有重要位置。本文就qRT-PCR在腫瘤研究中的應(yīng)用做一簡(jiǎn)要綜述如下。

1 qRT-PCR技術(shù)概述

1.1 原理 qRT-PCR技術(shù)是以傳統(tǒng)的PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，將熒光基團(tuán)加入PCR反應(yīng)體系中，通過(guò)熒光信號(hào)長(zhǎng)時(shí)間累積進(jìn)行的檢測(cè)，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。在qRT-PCR技術(shù)中，Ct是指PCR技術(shù)檢測(cè)的過(guò)程中，熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值所循環(huán)的次數(shù)，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。

1.2 特點(diǎn) 相對(duì)于傳統(tǒng)PCR技術(shù)，qRT-PCR技術(shù)具有高靈敏度、高效率、高準(zhǔn)確性等優(yōu)勢(shì)。qRT-PCR技術(shù)將傳統(tǒng)的PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)和激光技術(shù)進(jìn)行融合，提高檢測(cè)的靈敏性；可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成多個(gè)樣品的實(shí)時(shí)定量分析，大大地節(jié)約了醫(yī)務(wù)工作者的時(shí)間；采取針對(duì)性的靶序列鑒別定量分子，極大地提升了物體的特異性，提高實(shí)驗(yàn)的精確度。

1.3 分類 qRT-PCR技術(shù)可以分為熒光探針和熒光染料，都是檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的增加量，使擴(kuò)增的熒光分子信號(hào)與PCR產(chǎn)物的增加相一致。熒光探針是通過(guò)分離報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)，監(jiān)測(cè)擴(kuò)增的DNA鏈所形成熒光分子；熒光染料是在PCR技術(shù)過(guò)程中，加入熒光染料，使熒光染料滲入DNA雙鏈，從而檢測(cè)出熒光信號(hào)。

2 qRT-PCR技術(shù)在腫瘤中的應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR是一項(xiàng)新型的檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)的應(yīng)用能夠使檢測(cè)從之前的“定性”轉(zhuǎn)變化為“定量”，而且具有強(qiáng)特異性，提高了檢測(cè)準(zhǔn)確性，其操作簡(jiǎn)便，基本能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化，臨床上廣泛運(yùn)用于腫瘤基因表達(dá)的檢測(cè)。腫瘤的實(shí)質(zhì)是指人體細(xì)胞內(nèi)的基因發(fā)生異變，是一種基因發(fā)生改變的疾病，這些不同的改變用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)都能夠檢測(cè)出來(lái)。尤其近年來(lái)qRT-PCR技術(shù)在預(yù)防、診斷以及治療腫瘤發(fā)生率較高領(lǐng)域(肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌等)方面最為盛行。

2.1 在肺癌相關(guān)特殊基因表達(dá)的臨床檢測(cè) ZXF1在肺腺組織中的異常表達(dá)與腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，在臨床中，其高表達(dá)可推測(cè)患者預(yù)后較差，并推斷ZXF1可能通過(guò)增強(qiáng)靶蛋白BMP-5和SCFR的表達(dá)而影響肺腺癌的進(jìn)展，臨床運(yùn)用qRT-PCR能夠靈敏精確地檢測(cè)ZXF1 mRNA的表達(dá)量[2]。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因作為藥物治療肺癌的重要靶向基因，運(yùn)用qRT-PCR法檢測(cè)EGFR的異常表達(dá)，具有易操作、快速高效、靈敏精確，且超低成本等優(yōu)點(diǎn)，有益于臨床推廣[3]。王曉楠等[4]為了尋找高效的檢測(cè)肺癌早期診斷手段，收集肺鱗狀細(xì)胞癌患者28例，正常人10例，結(jié)果顯示，肺鱗癌患者與正常人外周血的鱗狀細(xì)胞癌抗原1(SCCA1)有差異，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明了RT-PCR技術(shù)通過(guò)檢測(cè)肺鱗癌SCCA1 mRNA基因的表達(dá)水平，用于肺鱗癌患者的早期診斷，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。楊上英等[5]通過(guò)對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者HLJ1基因進(jìn)行qRT-PCR分析，顯示HLJ1基因在NSCLC患者癌組織的表達(dá)明顯低于癌旁組織，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，結(jié)果表明qRT-PCR技術(shù)能準(zhǔn)確檢測(cè)出HLJl基因在腫瘤組織中呈降低的趨勢(shì)，HLJl基因可能在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有著重要作用。王逸飛等[6]應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)原發(fā)性肺腺癌患者基因變化情況，探討克唑替尼臨床運(yùn)用治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)克唑替尼對(duì)于肺腺癌有著較高的控制率，表明了qRT-PCR技術(shù)通過(guò)檢測(cè)肺腺癌，能夠指導(dǎo)克唑替尼臨床應(yīng)用。 以上在臨床檢測(cè)中運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)能夠更好地有助于肺癌的診斷與治療。

2.2 在肝癌相關(guān)特殊基因表達(dá)的臨床檢測(cè) 甲胎蛋白(AFP)是一種糖蛋白，是白蛋白家族中一種，主要由胎兒肝細(xì)胞及卵黃囊合成。胎兒期，甲胎蛋白血液循環(huán)中具有較高的濃度，出生后則逐漸下降，到2～3個(gè)月后甲胎蛋白基本被白蛋白替代，血液中較難檢出，故在成人血清中含量極低。甲胎蛋白與肝癌及多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在多種腫瘤中均可表現(xiàn)出較高濃度，可作為多種腫瘤的陽(yáng)性檢測(cè)指標(biāo)。目前臨床上主要作為原發(fā)性肝癌的血清標(biāo)志物，用于原發(fā)性肝癌的診斷及療效監(jiān)測(cè)[7]。miRNAs除了在腫瘤組織表達(dá)外，在外周循環(huán)血液中，分泌尿液中，胸膜水中等也有所發(fā)現(xiàn)，且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能夠持續(xù)監(jiān)測(cè)。因取血運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)操作簡(jiǎn)單且創(chuàng)傷小，故有望作為腫瘤早期診斷標(biāo)志物，而血清中miR-493-5p或miR-125b聯(lián)合AFP對(duì)肝細(xì)胞肝癌的診斷比兩者單獨(dú)使用更具有靈敏性和特異性，對(duì)早期診斷原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌具有潛在的臨床意義[8-12]。另外運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)血漿中的高爾基體蛋白73(GP73)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long-chain non-coding RNAs,lncRNAs)HOTTIP和ROR在AFP陰性肝細(xì)胞癌中的診斷評(píng)估腫瘤細(xì)胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)移有重要的臨床意義。因?yàn)樵缙诟渭?xì)胞癌患者臨床癥狀不明顯，借助影像學(xué)和腫瘤單獨(dú)標(biāo)志物易漏診，一旦發(fā)現(xiàn)已經(jīng)處于晚期階段，喪失最佳治療時(shí)機(jī)，降低臨床生存率。所以運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)增加血漿中具有明顯變化的生化指標(biāo)的檢測(cè)能夠提高AFP陰性肝細(xì)胞癌的早期診斷[13]。

2.3 在胃癌相關(guān)特殊基因表達(dá)的臨床檢測(cè) 癌胚抗原(Car-cinoembryonic antigen,CEA)是一種具有人胚胎抗原決定簇的酸性糖蛋白，胚胎期主要在胃腸道等器官，出生后含量很低，是一種廣譜的腫瘤標(biāo)記物。其臨床主要檢測(cè)手段為qRT-PCR，對(duì)其實(shí)時(shí)定量檢測(cè)在血清中的濃度含量，用于腫瘤的鑒別診斷、病情監(jiān)視、療效判斷等方面。糖類抗原199(Carbohydrate antigen 199，CA199)屬低聚糖腫瘤相關(guān)抗原，為一種新的腫瘤標(biāo)志物，為細(xì)胞膜上的糖脂質(zhì)。是血液中胃腸道腫瘤相關(guān)敏感抗原之一。如劉羽等采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)胃癌患者外周血中CEA的高表達(dá)，與正?；颊呦啾?，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[14]。麗敏等檢測(cè)外周血中CEA、CA199、CA72-4、CA125等四種腫瘤標(biāo)志物時(shí)，采用qRT-PCR擴(kuò)增人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因段，然后再進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)大大提高了特異性和靈敏性[15]。qRT-PCR在胃癌生化檢測(cè)方面應(yīng)用廣泛，除了以上經(jīng)典指標(biāo)外，如應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)胃腺癌和正常胃黏膜組織SIX6 mRNA及miR-203的表達(dá)，結(jié)果顯示，胃腺癌組織SIX6 mRNA基因的表達(dá)明顯增高，在一定程度上調(diào)節(jié)腫瘤的形成和發(fā)展，表明了SIX6蛋白的表達(dá)與胃腺癌預(yù)后有關(guān)；在胃癌組織中，miR- 203處于低表達(dá)狀態(tài)，影響胃癌患者預(yù)后[16-17]。

2.4 在乳腺癌相關(guān)基因表達(dá)的臨床檢測(cè) 乳腺癌是女性常見并且多發(fā)的惡性腫瘤之一，與乳腺癌密切相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物有CA153、CA125、CEA、CA199等。這些腫瘤標(biāo)志物在監(jiān)測(cè)乳腺癌病情進(jìn)展，以及了解治療的療效方面起著重要的作用，對(duì)于乳腺癌的診斷也起到一定的輔助診斷作用。但僅僅通過(guò)這些腫瘤標(biāo)志物是不能確診的，生化指標(biāo)往往是通過(guò)多種聯(lián)合方式，借助于影像技術(shù)手段，綜合考慮并確診。而聯(lián)合qRT-PCR技術(shù)監(jiān)測(cè)乳腺癌相關(guān)基因表達(dá)有助于臨床診斷。 Mattie等[18]認(rèn)為高通量qRT-PCR技術(shù)的出現(xiàn)，使miRNA成了一個(gè)獨(dú)立參數(shù)，能夠在活檢組織中檢測(cè)出ErbB2 miRNA的陽(yáng)性與陰性，表明ErbB2 miRNA可以作為新的腫瘤標(biāo)志物，應(yīng)用于乳腺癌這樣活檢標(biāo)本小的腫瘤。蘇謙等[19]應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)血清miR-598-3p的表達(dá)水平，用化學(xué)發(fā)光法技術(shù)檢測(cè)血清CA153的水平表達(dá)，二者聯(lián)合檢測(cè)能夠提高診斷乳腺癌的敏感性和特異性。

2.5 在宮頸癌相關(guān)基因表達(dá)的臨床檢測(cè) 人乳頭瘤病毒(HPV)是一種球形DNA乳頭瘤空泡病毒，能引起人體皮膚黏膜的鱗狀上皮增殖。有研究表明，患有宮頸癌的女性中感染HPV病毒的比例占到90%以上，大部分人都是感染HPV病毒導(dǎo)致的宮頸癌。所以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于HPV預(yù)防與檢測(cè)顯得尤為重要。qRT-PCR是當(dāng)今較流行的一種監(jiān)測(cè)技術(shù)，用于指導(dǎo)臨床診斷。如賈政軍等[20]采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè) HPV mRNA 表達(dá)量，其表達(dá)量隨著宮頸癌的發(fā)展增加，呈正相關(guān)性，故可作為臨床檢測(cè)患者病情的發(fā)生發(fā)展及術(shù)后治療等指導(dǎo)依據(jù)。陳剛等[21]認(rèn)為qRT-PCR是一種臨床檢驗(yàn)技術(shù)，其對(duì)HPV-DNA的表達(dá)水平檢測(cè)可廣泛應(yīng)用于臨床篩查宮頸癌預(yù)防與診斷的首選方法。臨床上，也可用qRT-PCR檢測(cè)宮頸癌鱗狀細(xì)胞癌中HIC1基因表達(dá)，結(jié)果表明qRT-PCR對(duì)于宮頸癌HIC1基因檢測(cè)具有準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，針對(duì)該疾病早期診斷、癌變分型、預(yù)后判斷，HIC1基因的準(zhǔn)確檢測(cè)有著重要的意義[22]。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

傳統(tǒng)的PCR技術(shù)有cDNA與差異顯示兩大高通量技術(shù)，但是缺乏定量分析， 而qRT-PCR技術(shù)能夠解決這一問(wèn)題，使檢測(cè)結(jié)果經(jīng)過(guò)定量分析，從而得到差異性表達(dá)。腫瘤基因的突變和表達(dá)量的增加，在許多癌癥早期就出現(xiàn)。qRT-PCR技術(shù)不僅能有效地檢測(cè)出基因突變，還可以準(zhǔn)確地檢測(cè)基因的表達(dá)量[23]。因此，qRT-PCR技術(shù)在臨床上具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，能夠在腫瘤早期診斷、癌變分期分型過(guò)程中起到重要的檢測(cè)作用。有研究發(fā)現(xiàn)[24]，與傳統(tǒng)的DNA及mRNA表達(dá)的診斷方式相比較，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA，在時(shí)間與準(zhǔn)確性上都能更好地發(fā)現(xiàn)并提示癌變。同時(shí)，miRNA作為重要的腫瘤抑制基因或癌基因，qRT-PCR技術(shù)還可以為癌癥的治療提供檢測(cè)手段，特異性敲除癌基因miRNA，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。目前，端粒酶hTERT基因、ER基因、MDRI基因等都能用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)，盡管腫瘤疾病的分子機(jī)制改變尚未明確，但基因的遺傳學(xué)異變則是腫瘤發(fā)病的根本原因之一，已得到普遍承認(rèn)。

隨著研究技術(shù)方法的不斷創(chuàng)新、改進(jìn)與完善，qRT-PCR將會(huì)在未來(lái)臨床疾病診斷、前沿科學(xué)研究等領(lǐng)域擁有廣闊應(yīng)用空間及重要的地位，是生命科學(xué)研究中一種不可或缺的研究技術(shù)，該技術(shù)將于分子生物學(xué)、基礎(chǔ)研究醫(yī)學(xué)、疾病診斷、食品安全、藥物開發(fā)等一系列領(lǐng)域中得到更加廣泛的應(yīng)用。