p63基因在婦科惡性腫瘤中的研究進(jìn)展

于婷，楊惠娟，韓旭

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，哈爾濱150001)

研究顯示，超過50%的人類癌癥的特征是p53基因發(fā)生突變[1]。p53基因是維護(hù)體細(xì)胞基因組穩(wěn)定性并在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用的“基因衛(wèi)士”，作為明確的抑癌基因被廣泛深入的研究[2]。p63基因于20世紀(jì)90年代末被鑒定出來[3]，作為p53基因的同源基因，p63基因在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能上與p53基因相互聯(lián)系，p63基因介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖、凋亡、分化及細(xì)胞黏附遷移過程中起重要的調(diào)控作用[2，4]。不同的是，p63基因在人類腫瘤中極少發(fā)生突變，但在多種鱗狀上皮源性惡性腫瘤中表達(dá)異常，參與子宮頸癌和膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展[5]。在人類腫瘤的研究進(jìn)展中，各種p63亞型的表達(dá)水平與臨床結(jié)果的關(guān)系存在矛盾[6]。研究發(fā)現(xiàn)，TAp63α(p63選擇性剪切的產(chǎn)物)在胚胎細(xì)胞向表皮細(xì)胞的分化、增殖、自我更新以及抑制衰老和凋亡方面具有致癌功能，而ΔNp63α具有維持上皮干細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、衰老和凋亡的腫瘤抑制功能[2]。另一項(xiàng)研究則表明，ΔNp63α是鱗狀上皮細(xì)胞中主要的p63亞型，定位于基底細(xì)胞，而且在包括皮膚、頭頸部和肺在內(nèi)的多個(gè)組織的鱗狀細(xì)胞癌中過表達(dá)[7]。目前不同p63亞型的表達(dá)水平在婦科惡性腫瘤中的差異、與臨床結(jié)果的聯(lián)系以及能否更好地應(yīng)用于婦科腫瘤的臨床診療及預(yù)后均受到廣泛關(guān)注。現(xiàn)就p63基因在婦科惡性腫瘤中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 p63的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能

1.1p63的結(jié)構(gòu) 人類p63基因位于染色體的3q27～3q29區(qū)，由15個(gè)外顯子和2個(gè)啟動(dòng)子組成[8]。p63基因主要包括N端的轉(zhuǎn)錄激活域、核心DNA結(jié)合域和寡聚域，根據(jù)C端剪接不同分為p63α、p63β和p63γ，根據(jù)N端剪接不同，分為具有轉(zhuǎn)錄激活域的全長(zhǎng)p63(TAp63)和缺失轉(zhuǎn)錄激活域的截短p63(ΔNp63)；另外，p63還具有獨(dú)特的C端SAM(sterile amotif)域，控制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的重要調(diào)控序列[9-10]。TAp63含有39-氨基-酸性N端延伸，可以模擬p53功能[3，9]；ΔNp63起始于一個(gè)獨(dú)特的14個(gè)氨基酸的N端，缺少結(jié)構(gòu)域，但可以通過反式激活結(jié)構(gòu)域來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[7，9]。TAp63功能類似于p53，能夠調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)凋亡，而ΔNp63可通過競(jìng)爭(zhēng)DNA結(jié)合位點(diǎn)拮抗p53和TAp63，發(fā)揮類癌基因的作用[9]。近年來，已經(jīng)報(bào)道了幾種新的p63亞型，例如，Moses等[7]發(fā)現(xiàn)，在p63蛋白N端存在一種亞型，位于第4外顯子替代翻譯的起始位點(diǎn)，它在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中缺少ΔNp63亞型的前26個(gè)氨基酸。

1.2p63的生物學(xué)功能 p63與p53基因家族在結(jié)構(gòu)和功能上具有同源性，p63蛋白可以作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合p53應(yīng)答元件(response element，RE)及p63-RE，直接或間接調(diào)節(jié)下游靶基因，激活各種信號(hào)通路，參與多種生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，而p63處于這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵點(diǎn)，在細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、分化、細(xì)胞黏附遷移以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。

DNA損傷誘導(dǎo)TAp63通過激活外源性及內(nèi)源性凋亡途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在Saos-2細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染TAp63，過表達(dá)的TAp63可導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子表達(dá)上調(diào)，阻滯細(xì)胞周期，TAp63還能夠通過轉(zhuǎn)錄抑制增殖相關(guān)基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖[7]。ΔNp63能夠激活與細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖相關(guān)的基因，被ΔNp63持續(xù)激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3可參與多種癌細(xì)胞的過度增殖，還可介導(dǎo)ΔNp63對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體的激活，表皮生長(zhǎng)因子受體反過來通過磷脂酰肌醇-3-激酶通路誘導(dǎo)ΔNp63的表達(dá)[12]，而磷脂酰肌醇-3-激酶通路的活性與許多人類疾病有關(guān)，包括糖尿病和癌癥[10]。有研究表明，在80%肺鱗狀細(xì)胞癌中，ΔNp63過表達(dá)的同時(shí)下調(diào)Ras相似物A(Ras homologous A，RhoA)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2受體(RhoA和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2在肺鱗狀細(xì)胞癌中具有腫瘤抑制作用)，進(jìn)而發(fā)揮ΔNp63癌基因的作用[13]。另外，ΔNp63還可通過負(fù)調(diào)節(jié)某些細(xì)胞周期抑制因子，促進(jìn)細(xì)胞增殖。有研究表明，在鼻咽癌細(xì)胞周期中，ΔNp63基因剔除導(dǎo)致了細(xì)胞周期素依賴激酶抑制劑上調(diào)，包括p27和p57在信使RNA和蛋白的表達(dá)，增加了G1期細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的數(shù)量[10]。不同p63亞型在參與不同腫瘤系細(xì)胞周期調(diào)控及凋亡過程中可能發(fā)揮相似或相反的作用，調(diào)控機(jī)制也存在差異，需要進(jìn)一步深入系統(tǒng)的研究。

p53家族成員在基因表達(dá)和翻譯后修飾水平上受到調(diào)控，也可通過泛素化及類泛素化的修飾來維持其在細(xì)胞中的穩(wěn)定性及活性[10]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾種p63的泛素E3連接酶，它們能夠泛化TAp63和ΔNp63，調(diào)控p63蛋白質(zhì)水平的穩(wěn)定，但鼠雙微粒體基因(murine double minute，MDM)2/MDMX介導(dǎo)的p63蛋白穩(wěn)定性仍有待研究[4]。

近年來，微RNA(microRNA，miRNA)成為研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)p63可以調(diào)節(jié)一組不同的miRNA，其中一個(gè)公認(rèn)的靶點(diǎn)就是miR-205，它是膀胱癌和胰腺癌上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移的抑制因子[14]。相反，p63是miR-20a-5p的靶基因，miR-20a-5p可直接與p63的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制其翻譯，進(jìn)而調(diào)節(jié)p53和人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因在肝糖原合成過程中的表達(dá)，而p63基因剔除可以逆轉(zhuǎn)miR-20a-5p抑制誘導(dǎo)的蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)和糖原合成酶激酶的生成減少和激活，表明p63對(duì)胰島素信號(hào)通路有不利影響[15]。此外，在結(jié)腸癌細(xì)胞中，TAp63過表達(dá)可顯著抑制糖原合成酶激酶-3β依賴的脂肪酸合成[16]。p63蛋白與代謝紊亂的相關(guān)性正被逐漸認(rèn)知[17]，對(duì)于研究代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制可能有幫助。

p63與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系各文獻(xiàn)報(bào)道不盡相同，目前尚無定論。已有研究證實(shí)，ΔNp63α可調(diào)節(jié)參與細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)和遷移的基因[包括神經(jīng)鈣黏素、β聯(lián)蛋白和E盒鋅指結(jié)合蛋白(zinc finger E-box binding homeobox，ZEB)1/2]，抑制癌癥進(jìn)展和上皮向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變[18]。粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)和Src是已知的細(xì)胞遷移調(diào)節(jié)因子，在E6/E7-人包皮角質(zhì)形成細(xì)胞中，p63的表達(dá)可促進(jìn)依賴Src-FAK機(jī)制的細(xì)胞遷移和侵襲，而剔除p63基因后，許多細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)均發(fā)生了改變，如Src、FAK、Akt、c-Jun和基質(zhì)金屬蛋白酶14的表達(dá)均降低[19]。在乳腺癌雌激素受體α陽性的MCF7細(xì)胞中，雌激素激活雌激素受體α轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而誘導(dǎo)ΔNp63的表達(dá)，而ΔNp63能夠誘導(dǎo)整合素β4表達(dá)，使Akt磷酸化，增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力[20]。一項(xiàng)有關(guān)宮頸癌的研究表明，TRIM(tripartite motif)29基因可調(diào)控p63介導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞的黏附和侵襲，TRIM29基因剔除改變了整合素的表達(dá)，增加了ZEB1和整合素1的表達(dá)，同時(shí)顯著降低了TAp63α的表達(dá)，進(jìn)而抑制TAp63α誘導(dǎo)的細(xì)胞黏附活性增強(qiáng)[21]。腫瘤細(xì)胞通過上調(diào)或抑制不同亞型p63的表達(dá)影響細(xì)胞黏附和遷移，可能作為關(guān)鍵因子參與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，但其機(jī)制目前尚不明確，還有待進(jìn)一步研究。

p63還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞分化，但詳細(xì)機(jī)制目前尚不清楚。有研究表明，p63與Notch通路交叉作用，維持角化細(xì)胞自我更新和分化的平衡[8,10,14]。一項(xiàng)研究顯示，β和γ亞型TAp63是人類皮膚終末分化過程中必不可少的轉(zhuǎn)錄開關(guān)，可以被人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的E6癌蛋白特異性降解，與Notch協(xié)同作用，有可能在HPV相關(guān)的癌變過程中作為腫瘤抑制因子發(fā)揮重要作用[22]。

2 p63與婦科腫瘤的關(guān)系

2.1p63與宮頸癌 宮頸癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率居生殖道惡性腫瘤的第二位，在某些發(fā)展中國(guó)家甚至位居首位[23]。隨著宮頸癌篩查技術(shù)的普及，近年來宮頸癌的發(fā)病率和病死率有所降低，在美國(guó)，2018年有4 170位女性死于宮頸癌[24]。

宮頸癌是一種感染性疾病，HPV感染與宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，持續(xù)反復(fù)感染HPV是宮頸細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的主要病因，HPV含有8個(gè)基因編碼區(qū)，其中E6、E7基因起主要作用[25]。Martens等[26]在研究宮頸癌時(shí)發(fā)現(xiàn)，p63蛋白與HPV感染密切相關(guān)。賈英等[27]的研究表明，ΔNp63與HPV16 E7的表達(dá)在CIN中具有較好的一致性。朱靖等[28]進(jìn)一步證實(shí)，p63α在宮頸癌細(xì)胞株中有表達(dá)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HPV E6后，p63α的表達(dá)顯著降低，提示p63α降低在宮頸癌發(fā)生過程中發(fā)揮作用。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)p63與HPV相互作用機(jī)制的研究較少，一項(xiàng)國(guó)外研究表明，HPV E7蛋白可誘導(dǎo)p63轉(zhuǎn)錄，該轉(zhuǎn)錄可調(diào)控DNA損傷反應(yīng)通路，促進(jìn)DNA損傷的修復(fù)，這可能為宮頸癌的治療提供新途徑[29]。

經(jīng)過不斷的探索研究，p63在CIN和宮頸癌中的表達(dá)取得了一定的進(jìn)展。趙時(shí)梅等[30]的研究表明，ΔNp63在宮頸腺癌中無表達(dá)，在宮頸鱗癌中，低分化組ΔNp63陽性表達(dá)率高于中、高分化組，臨床Ⅲ～Ⅳ期高于0～Ⅰ期，提示ΔNp63可能與預(yù)后有關(guān)，陳瑋和趙涌[31]的研究結(jié)果與此一致。吳瑾等[32]通過免疫組織化學(xué)法研究ΔNp63在各級(jí)別CIN中的表達(dá)，選取的對(duì)照組為慢性宮頸炎組，結(jié)果顯示，慢性宮頸炎組ΔNp63陽性表達(dá)率為4.76%，CINⅠ級(jí)組為84.21%，CINⅡ級(jí)組為100%，CIN Ⅲ級(jí)組為100%，而且CIN各組的染色強(qiáng)度均隨病情進(jìn)展而增強(qiáng)。

雖然p63的表達(dá)與宮頸病變方面的研究取得了一定的進(jìn)展，但不同p63亞型在宮頸癌中的表達(dá)目前尚不明確。Park等[33]進(jìn)一步應(yīng)用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)正常宮頸組織和宮頸癌組織中的TAp63和ΔNp63信使RNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，ΔNp63信使RNA的過表達(dá)參與了宮頸癌的發(fā)生，而非TAp63信使RNA的過表達(dá)；進(jìn)一步分析得出，ΔNp63/TAp63信使RNA在宮頸癌組織中的表達(dá)比值顯著高于正常宮頸組織，較ΔNp63信使RNA具有更好的敏感性和診斷價(jià)值，ΔNp63/TAp63信使RNA表達(dá)率陽性的宮頸癌患者的生存率低于ΔNp63/TAp63信使RNA表達(dá)率陰性的宮頸癌患者，故ΔNp63/TAP63信使RNA表達(dá)比值可作為宮頸癌的診斷和預(yù)后指標(biāo)。此外，宮頸癌中ΔNp63/TAp63信使RNA陽性表達(dá)率與腫瘤大小和增殖標(biāo)志物Ki-67的高表達(dá)有關(guān)，并且ΔNp63/TAp63信使RNA在低度宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變和高度宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組織中的表達(dá)水平高于正常宮頸組織，低于宮頸癌組織。由此可見，不同p63亞型可以相互作用或干擾，最終p63對(duì)生物學(xué)行為的影響可以通過各亞型之間的平衡進(jìn)行調(diào)控，這種失衡同樣存在于Ⅰ/Ⅱ級(jí)子宮內(nèi)膜腺癌中[34]。

2.2p63與卵巢癌 卵巢癌是一組在腫瘤起源、病理分級(jí)、危險(xiǎn)因素、預(yù)后和治療方面均具有異質(zhì)性的惡性腫瘤，是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，目前主要通過手術(shù)和鉑類為主的化療進(jìn)行治療，早期多無癥狀，疾病易復(fù)發(fā)，預(yù)后差。在美國(guó)，卵巢癌占女性所有惡性腫瘤的2.5%，病死率約為5%，2018年有14 070位女性死于卵巢癌[24]。在一項(xiàng)小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，p63基因缺失小鼠的活卵母細(xì)胞數(shù)量略高于無基因缺失小鼠，進(jìn)一步研究表明，在缺乏TAp63的情況下，重要的卵母細(xì)胞編輯功能喪失，這些效應(yīng)伴隨著TAp63磷酸化[3]。目前關(guān)于TAp63與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后方面的研究較少，p63蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合p53-RE和p63-RE，直接或間接調(diào)節(jié)下游靶基因，參與大量信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。未來能否利用TAp63的生物學(xué)功能克服卵巢癌化療的耐藥性，更好地保護(hù)卵巢功能，值得研究者關(guān)注。

死亡相關(guān)蛋白激酶-1(death-associated protein kinase-1，DAPK1)是一種鈣離子/鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸激酶，能夠介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，DAPK1下調(diào)可見于多種癌癥，包括胰腺癌、肺癌和頭頸部腫瘤[35]。有研究表明，DAPK1基因沉默阻止了TAp63介導(dǎo)的多藥耐藥基因1和多藥耐藥相關(guān)蛋白3的下調(diào)以及膠質(zhì)毒素和紫杉醇連續(xù)治療后的自噬細(xì)胞死亡，DAPK1介導(dǎo)的TAp63上調(diào)是誘導(dǎo)耐藥腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵途徑之一[36]。在對(duì)卵巢癌進(jìn)行再次化療前，DAPK1和TAp63水平可用作診斷或判斷耐藥的因素，但具體機(jī)制目前尚不清楚。

另一項(xiàng)針對(duì)489例高級(jí)別漿液性卵巢癌患者的研究表明，激活p63可觸發(fā)細(xì)胞周期停滯、凋亡和衰老，即使在沒有p53的情況下，也可觀察到p63在遺傳毒性應(yīng)激下補(bǔ)償癌細(xì)胞中p53的丟失[7]。miR-130b是被TAp63反式激活結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活的直接下游靶標(biāo)，它可以建立反饋環(huán)路，在轉(zhuǎn)錄上激活TAp63，并下調(diào)致癌亞型ΔNp63，具有克服p53突變的潛力[37]。目前已有研究表明，p53家族成員可通過相關(guān)反饋環(huán)調(diào)節(jié)彼此的表達(dá)，尤其在錯(cuò)綜復(fù)雜的各種信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)中[4，7]。同時(shí)，還有研究表明，Scl-miR-130b不僅在人卵巢癌的原位小鼠模型中靶向并有效地傳遞miR-130b，而且還可以增強(qiáng)卵巢腫瘤對(duì)一線治療劑順鉑的反應(yīng)[37]。因此，miR-130b/TAp63軸是臨床上有前景的卵巢癌治療策略，但仍需進(jìn)一步研究確定p63特定亞型在卵巢癌miRNA轉(zhuǎn)錄中的作用。

了解化療誘導(dǎo)卵巢早衰的分子機(jī)制可以確定預(yù)防靶點(diǎn)。有研究表明，激活TAp63α需要啟動(dòng)激酶細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶2和Ⅰ型酪蛋白激酶，而抑制這些激酶及其上游激酶可使小鼠卵巢中的卵母細(xì)胞免于凋亡；將經(jīng)過處理的卵巢轉(zhuǎn)移到不孕的雌性宿主體內(nèi)可以恢復(fù)其生育能力，并容易產(chǎn)生正常后代[38]。通過干擾激活TAp63α激酶進(jìn)一步抑制TAp63α，有望成為卵巢癌治療期間預(yù)防卵巢早衰的一種有價(jià)值的方法。

3 小 結(jié)

目前p63基因在婦科惡性腫瘤中的研究取得了較大進(jìn)展。p63基因作為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中大量的信號(hào)通路，受正負(fù)反饋調(diào)節(jié)[14]，與宮頸病變組織分類、臨床分級(jí)和預(yù)后相關(guān)，并在克服卵巢癌耐藥性和保護(hù)生育能力方面發(fā)揮作用。但目前對(duì)不同p63亞型的生物學(xué)功能尚無完整、系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步了解婦科惡性腫瘤形成過程中不同p63亞型使癌細(xì)胞更易具備侵襲性表型并維持其在同一組織細(xì)胞中表達(dá)平衡的機(jī)制，有助于通過p63介導(dǎo)的通路解決惡性腫瘤耐藥性的問題，具有潛在的研究意義和臨床應(yīng)用價(jià)值，這也為婦科惡性腫瘤的診斷和治療提供了新思路。