腸道微生態(tài)與肝硬化

宦 徽 劉 超 唐承薇

人體腸道內(nèi)定植有大量微生物，以細(xì)菌為主，同時(shí)也包括古生菌、病毒、原生動(dòng)物等其他微生物。腸道菌群作為人體內(nèi)最大的微生物貯藏庫，可與宿主互利共生，一定程度上影響人類的生理健康狀況。在健康的人體中，腸道菌群可幫助人體消化食物，提供豐富的必需營養(yǎng)物質(zhì)(如生成維生素、增加必需營養(yǎng)物質(zhì)的生物利用度等)，抵御腸道病原體入侵、與黏膜免疫系統(tǒng)相互作用，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用等。因此，人體內(nèi)的腸道菌群可被看作為一個(gè)虛擬但又必不可少的“器官”。

傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為健康的人類胚胎在無菌環(huán)境中生長。近期有證據(jù)表明，孕期子宮內(nèi)的羊水就已存在細(xì)菌，盡管其數(shù)量較少、微生物多樣性相對(duì)欠豐富[1]。出生后，新生兒所接觸的微生物及其衍生物持續(xù)暴增。不同的生產(chǎn)方式，極大地影響了新生兒的微生物群落組成。此外, 人體宿主的遺傳背景、年齡、免疫系統(tǒng)的發(fā)育、藥物、飲食習(xí)慣如飲酒、吸煙等因素均可影響腸道菌群的組成和功能。人體微生物作為相互作用的動(dòng)態(tài)體系，具有極為復(fù)雜的特點(diǎn)，不僅個(gè)體間存在菌群多樣性，甚至同一個(gè)體的不同部位腸道菌群的構(gòu)成也存在一定程度的差異。

正常成人腸道微生物呈相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，這種狀態(tài)一直持續(xù)到老年?？傮w來說，成人體內(nèi)微生物總數(shù)多達(dá)40000種，其總體基因組比人類基因組超出100倍。其中在菌門層面上，擬桿菌門和硬壁菌門為健康成人的主要菌門。目前越來越多的證據(jù)顯示，腸道菌群失調(diào)如腸道微生物種屬豐度、多樣性和(或)組分改變均可能導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如一系列的肝臟疾病、原發(fā)性硬化性膽管炎、炎癥性腸病等[2～4]。不同的疾病是否顯示了相對(duì)獨(dú)特的腸道微生物組變化，尚需開展深入的研究進(jìn)一步明確。

一、腸道菌群的研究方法

人們對(duì)成人腸道菌群的認(rèn)識(shí)最早來源于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法，然而此方法敏感度低，且目前有超過70%的細(xì)菌因難以鑒定種屬或不能提供優(yōu)化的培養(yǎng)生長環(huán)境而無法培養(yǎng)。因此，僅僅依賴于微生物培養(yǎng)的方法不足以徹底了解腸道固有菌群的完整情況。近年來，DNA測序和分子生物學(xué)的快速發(fā)展，使得微生物16s核糖體RNA基因序列分析成為微生物研究的主要方法。而高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，不僅能夠完整地描述復(fù)雜的微生物組分，同時(shí)使大規(guī)模發(fā)現(xiàn)新的微生物群成為可能。而基于大規(guī)模人群的全微生物組——人類微生物組計(jì)劃可從腸道菌群結(jié)構(gòu)及功能代謝方面出發(fā)，整體宏觀的深入研究健康成人腸道微生物組情況。

在腸道微生物的系統(tǒng)進(jìn)化研究中，肝硬化菌群失調(diào)比例(the cirrhosis dysbiosis ratio, CDR)被用來判斷定值菌和非定值菌的比例，即有益菌與侵襲菌之比[5]。其中以雙歧桿菌與腸桿菌比值評(píng)分體系最為常用，其比值能有效區(qū)分肝硬化與健康成人，而且還可用于評(píng)估肝硬化患者出現(xiàn)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，因此目前被廣泛運(yùn)用于臨床試驗(yàn)中。

二、肝硬化中的腸道微生物

肝臟與消化道相鄰，70%的供血來自于門靜脈，這一特殊的解剖位置(肝-腸軸)，可導(dǎo)致肝臟特異性與經(jīng)消化道運(yùn)輸?shù)臓I養(yǎng)物質(zhì)相互作用，持續(xù)暴露于大量的細(xì)菌及其產(chǎn)物中。在腸道菌群分類構(gòu)成方面，大量研究顯示，不同病因所致的肝硬化患者不僅具有相似的糞便腸道微生物群落，而且與健康人比較，肝硬化患者腸道菌群普遍表現(xiàn)為有益菌(如毛螺菌科、擬桿菌門)減少，同時(shí)潛在致病菌比例增多(如鏈球菌、腸桿菌科、腸球菌科、葡萄球菌科等)[6～10]。其中，基于中國漢族人口的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者腸道菌群的最大改變是口腔細(xì)菌菌種大量侵入消化道，推測可能與胃酸分泌減少，防御屏障破壞有關(guān)[9]。還有研究發(fā)現(xiàn),肝臟疾病惡化時(shí)，肝硬化患者的腸道菌群也會(huì)隨之改變，其中微生物基因組中豐度較高的細(xì)菌種屬與疾病的嚴(yán)重性有明顯關(guān)系[11]。筆者推測肝硬化的疾病分期或許是決定微生物組成分豐度的一個(gè)重要因素。值得注意的是，在酒精性肝硬化患者的大便中發(fā)現(xiàn)普雷沃菌科基因豐度高于乙肝相關(guān)性肝硬化患者[12]。推測酒精相關(guān)性病因或許可影響終末期肝臟疾病患者的腸道菌群組成，但這一推斷需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

此外，國內(nèi)的一項(xiàng)研究通過宏基因組定量分析顯示15個(gè)腸道微生物基因具較高的特異性，因而推薦這些微生物基因用來作為肝硬化的生物診斷指標(biāo)，這或許可為肝硬化的監(jiān)測和預(yù)防提供新的思路[9]。然而，考慮到缺乏這些微生物基因在不同疾病中的敏感度和效益研究，因此真正將腸道菌群作為腸內(nèi)或腸外疾病診斷的生物學(xué)指標(biāo)或藥物療效的評(píng)估指標(biāo)，還有一定的距離，需設(shè)立更多合理的臨床研究。

其次，傳統(tǒng)觀念中的有益菌如厚壁菌門中可能存在致病菌，如葡萄球菌科和腸球菌科，這兩者在肝硬化患者中的基因表達(dá)豐度異常增多，因此有研究認(rèn)為對(duì)于腸道菌群基于菌門水平的分析不適于肝硬化的微生物組研究[13]。目前的臨床研究之間，在研究方法上無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，如研究收集的標(biāo)本從大便樣本、腸腔抽吸物、腸道分泌物、腸道黏膜,到唾液等均有涵蓋。其中，大便標(biāo)本因容易收集，故在腸道菌群的研究中最為常用，但往往僅能反應(yīng)腸腔內(nèi)微生物情況。而腸道黏膜的微生物作為腸道生物膜結(jié)構(gòu)，與其下的腸道上皮層密切接觸，更能反映腸道固有定植菌特點(diǎn)。腸道黏膜表面黏附微生物和管腔內(nèi)微生物組成存在區(qū)別，且可能在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮不同的作用。因此，基于不同人體樣本的臨床試驗(yàn)，可導(dǎo)致不同研究之間微生物組構(gòu)成分析產(chǎn)生異質(zhì)性。

還需注意的是，在細(xì)菌基因水平上，肝硬化的病理特征或許應(yīng)從微生物組基因豐度變化和功能兩方面進(jìn)行具體描述，然而目前的研究多側(cè)重于肝硬化患者腸道菌群的宏觀構(gòu)成，存在功能研究明顯不足。肝硬化與腸道微生物之間的關(guān)系，是互為因果，亦或是肝臟疾病調(diào)控腸道細(xì)菌改變，或是腸道菌群失調(diào)是導(dǎo)致肝硬化的發(fā)生原因，目前尚無定論。

三、腸道菌群在肝硬化中的機(jī)制研究

1.膽汁酸代謝:膽汁酸的肝腸循環(huán)可介導(dǎo)肝臟和腸道相互聯(lián)系，即初級(jí)膽汁酸在腸道細(xì)菌的作用下轉(zhuǎn)化為次級(jí)膽汁酸，由末端回腸重吸收回肝臟，再與結(jié)合膽汁酸一同經(jīng)膽道排入腸道。例如擬桿菌屬可產(chǎn)生膽酸鹽水解酶，后者可促進(jìn)初級(jí)膽汁酸轉(zhuǎn)化為次級(jí)膽汁酸。這一過程，同時(shí)也為擬桿菌屬細(xì)菌提供了能量。然而，在進(jìn)展期肝硬化患者的糞便中，總膽汁酸的含量較正常人減少了5倍，其中次級(jí)膽汁酸與初級(jí)膽汁酸比例下降的最為明顯[14]。目前認(rèn)為因進(jìn)入腸道內(nèi)的膽汁酸減少，導(dǎo)致如腸桿菌科等致病菌群和促炎性微生物組過度生長，而依賴于脫羧基功能的菌群減少[15]。此外，韋榮球菌屬在肝硬化患者中的異常增多，可水解聚合的膽鹽，阻礙腸道中微膠粒形成，最終導(dǎo)致消化道中的脂肪酸等脂肪代謝產(chǎn)物不易被腸黏膜吸收，膽汁進(jìn)而淤積，最終加重肝硬化。膽汁酸的微生物調(diào)控作為腸道微生物與宿主相互作用的重要機(jī)制，除了影響肝臟疾病，同時(shí)也參與代謝綜合征的發(fā)病過程。

2.小腸細(xì)菌過度生長:目前的研究發(fā)現(xiàn)在肝硬化患者中，總膽汁酸減少可能導(dǎo)致小腸細(xì)菌過度生長的發(fā)生。如在肝硬化大鼠模型中，予以結(jié)合膽汁酸治療的大鼠，可出現(xiàn)腸道細(xì)菌過度生長和細(xì)菌移位明顯減少的現(xiàn)象。小腸細(xì)菌過度生長作為在肝硬化患者中常見的現(xiàn)象，其病理因素除膽汁酸減少這一原因外，還包括小腸蠕動(dòng)異常，腸道轉(zhuǎn)運(yùn)延遲，腸道通透性增加，抗菌防御減弱，小腸細(xì)菌過度生長等。此外，小腸細(xì)菌過度生長還與內(nèi)毒素血癥、病理學(xué)細(xì)菌移位的發(fā)生有關(guān)，不僅可導(dǎo)致腸道細(xì)菌感染如自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎的發(fā)生率升高，同時(shí)還可增加肝臟疾病失代償?shù)娘L(fēng)險(xiǎn)[16]。

3.病理性細(xì)菌移位:細(xì)菌移位被定義為活微生物或其產(chǎn)物如脂多糖、細(xì)菌DNA等通過腸道屏障從腸腔遷移進(jìn)入腸系膜淋巴結(jié)及其他腸外器官。雖然目前的觀點(diǎn)將小腸細(xì)菌過度生長視為促使病理學(xué)細(xì)菌移位發(fā)生的主要因素，然而在肝硬化動(dòng)物模型中僅僅出現(xiàn)小腸細(xì)菌過度生長，不足以導(dǎo)致細(xì)菌移位的發(fā)生。還需連同其他因素如局部免疫下降等，協(xié)調(diào)作用最終才可導(dǎo)致這一病理過程的發(fā)生。移位的細(xì)菌最為常見的為腸桿菌、糞腸球菌屬和變形菌屬等[16]。移位的細(xì)菌及其片段可通過釋放細(xì)胞因子和一氧化氮引發(fā)炎性反應(yīng)，最終導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)的紊亂。而腸道內(nèi)固有定植菌的減少，可導(dǎo)致短鏈脂肪酸、抗菌肽合成減少，腸道黏膜屏障相應(yīng)遭受破壞，進(jìn)而引起一系列病理反應(yīng)如炎癥、門脈高壓等出現(xiàn)。

4.內(nèi)毒素：肝硬化患者中腸道細(xì)菌過度生長及細(xì)菌移位均可導(dǎo)致韋榮球菌屬和腸桿菌科在結(jié)腸中顯著增多。革蘭陰性菌的異常增多可導(dǎo)致內(nèi)毒素生成明顯增加。肝硬化患者因肝臟庫普弗細(xì)胞清除功能降低，消化道通透性增加，連同門-體側(cè)支循環(huán)形成，均導(dǎo)致血中內(nèi)毒素水平明顯升高。

5.其他因素如全身性和局部性免疫防御受損可能也參與這一機(jī)制過程，但目前相關(guān)的研究較為匱乏，且缺少相應(yīng)有效的研究方法。事實(shí)上，肝硬化患者菌群失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)較高，推測可能是多因素協(xié)調(diào)作用的結(jié)果。

四、腸道菌群在肝硬化的主要并發(fā)癥中發(fā)揮的作用

1.肝性腦病：人們對(duì)腸道菌群在肝臟疾病中作用的了解，最早來源于肝昏迷與腸道的含氮代謝產(chǎn)物之間存在聯(lián)系的發(fā)現(xiàn)。目前在肝硬化腸道微生物的研究中，大部分研究都側(cè)重于對(duì)肝性腦病的研究?？傮w來說，有肝性腦病病史的患者的大便和唾液樣本中均發(fā)現(xiàn)非固有定植微生物數(shù)量增多，而固有定植微生物數(shù)量減少的現(xiàn)象[7,11]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)堿菌科或卟啉單胞菌增多與HE患者所表現(xiàn)出的認(rèn)知能力差明顯相關(guān)；而腸桿菌科與肝性腦病患者的炎癥有強(qiáng)相關(guān)性[6]。還有研究發(fā)現(xiàn)腸球菌、巨型球菌、克雷伯菌屬與肝性腦病患者的認(rèn)知能力和炎性反應(yīng)有關(guān)[7]。有趣的是，在動(dòng)物模型中定植有某些細(xì)菌的腸道微生物能夠通過影響神經(jīng)元回路參與對(duì)運(yùn)動(dòng)和行為的控制[17]。通過微生物-腸道-腦軸，腸道細(xì)菌可通過生成氨以及內(nèi)毒素驅(qū)使的炎性反應(yīng)，協(xié)同參與肝性腦病的發(fā)展過程[18]。此外，還有研究認(rèn)為微生物產(chǎn)生的物質(zhì)如酚類、短鏈或中鏈脂肪酸等可能也參與這一發(fā)病過程[19]。

2.自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎：腸道中細(xì)菌過度生長和(或)腸道細(xì)菌移位被認(rèn)為是自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎的重要發(fā)病機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，盡管這些肝硬化患者的腹腔積液微生物培養(yǎng)為陰性且未被診斷為自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎，近50%的酒精性肝硬化患者的腹腔積液中可檢測出細(xì)菌DNA，且與在肝臟標(biāo)本中所發(fā)現(xiàn)的移位細(xì)菌一致[8]。目前認(rèn)為，引起自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎的細(xì)菌大都為革蘭陰性桿菌如大腸桿菌和腸桿菌科的部分成員[6,12]。

五、治療措施

1.抗生素:在肝硬化的管理中，調(diào)控腸道微生物是一種可取的治療手段，現(xiàn)階段的研究多偏重于對(duì)肝性腦病的療效分析。目前主流的治療手段是使用吸收較差的抗生素如諾氟沙星和利福昔明以達(dá)到腸道凈化的作用[5]。諾氟沙星不能完全被腸道吸收，對(duì)需氧性革蘭陰性菌敏感，且很少引起耐藥。而利福昔明全身毒性弱、不易耐藥，可調(diào)節(jié)革蘭陽性菌，減少腸道細(xì)菌產(chǎn)生脂多糖。在動(dòng)物模型中，與對(duì)照組小鼠比較，使用利福昔明治療的小鼠門脈壓降低，肝纖維化程度明顯降低[20]。臨床試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)利福昔明在肝性腦病和亞臨床肝性腦病中可明顯改善患者的認(rèn)知功能，并減少肝性腦病的發(fā)生[21]。自從美國藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)利福昔明可用于治療肝性腦病以來，人們對(duì)利福昔明更為關(guān)注。然而有研究發(fā)現(xiàn)利福昔明并不能改變腸道菌群本身，推測其療效可能歸因于對(duì)致病菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用[22]。因此，為明確這些抗生素在肝臟疾病中對(duì)微生物組和微生物-宿主相互作用的具體作用及影響，尚需更多的研究去明確。

2.益生菌:近幾年來越來越多非抗生素治療手段被應(yīng)用于肝臟疾病，如益生元(食物補(bǔ)充或直接添加)、益生菌等。其中，益生菌作為目前研究的熱點(diǎn)，其療效的主要機(jī)制包括調(diào)節(jié)腸道微生物及改善腸道屏障等作用機(jī)制。盡管在肝前性門脈高壓動(dòng)物模型中，乳酸菌發(fā)酵的奶制品沒能達(dá)到有效減少細(xì)菌移位發(fā)生的研究結(jié)局。然而，在輕癥肝性腦病動(dòng)物模型中，研究發(fā)現(xiàn)益生菌混合物能夠有效降低肝性腦病的發(fā)生，降低血氨和內(nèi)毒素水平，并且可明顯緩解肝臟損傷和炎性反應(yīng)[22]。近期基于臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的Meta分析顯示，益生菌在治療肝性腦病中存在一定的希望，但因不同研究之間存在明顯的偏移及隨機(jī)誤差，尚不能明確得出益生菌有效的結(jié)論。目前的研究之間存在益生菌使用濃度、療程、肝臟疾病嚴(yán)重性異質(zhì)的現(xiàn)象，且缺乏益生菌對(duì)特異性腸道菌群組分影響的研究。因此，進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)需著重研究益生菌對(duì)腸道微生物具體成分的影響與其臨床療效的相關(guān)性分析，并最終明確益生菌在肝臟疾病中的最佳有效劑量。

六、展 望

肝硬化患者菌群失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)較高，考慮與多因素協(xié)調(diào)作用的有關(guān)。腸道菌群在肝硬化的主要并發(fā)癥中發(fā)揮著重要作用，然而目前大部分研究僅停留在微生物的變化這一表觀現(xiàn)象，且主要集中在屬水平層面。精準(zhǔn)到種水平的宏基因組學(xué)將是未來研究的重要方法，這可為展現(xiàn)肝硬化腸道微生物的多樣性、功能活性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系等提供更多細(xì)節(jié)信息。聯(lián)合蛋白及代謝組學(xué)等方式，可進(jìn)一步探究腸道菌群在肝硬化中的機(jī)制作用。益生菌在治療上目前尚不能得出明確有效的結(jié)論。因此有賴于更多隨機(jī)、大樣本、多中心、高質(zhì)量的研究，分析益生菌對(duì)腸道微生物具體成分的影響與其臨床療效，為臨床提供更多可靠依據(jù)。