代謝組學(xué)在篩選腎移植潛在生物標(biāo)志物中的應(yīng)用

馬馳宇, 薛 雯綜述, 湯冬娥, 戴 勇審校

0 引 言

腎具有維持體內(nèi)電解質(zhì)、水、酸堿度平衡，排泄有害物質(zhì)、調(diào)節(jié)血壓等功能，與人類健康息息相關(guān)。終末期腎病患者生活質(zhì)量會(huì)受到嚴(yán)重影響甚至可能危及生命，腎移植手術(shù)是目前治療終末期腎病的最佳方法[1]。我國(guó)的腎移植實(shí)驗(yàn)開(kāi)展于20世紀(jì)50年代，1960年吳階平院士開(kāi)展了我國(guó)第1例人體腎移植[2-3]。20世紀(jì)70年代末，腎移植作為治療慢性腎衰竭和尿毒癥等終末期腎病的有效方法在我國(guó)得到了推廣[4]。然而，腎移植仍面臨許多挑戰(zhàn)，移植腎失功、術(shù)后早期腎功能不全和晚期腎功能衰退以及排斥反應(yīng)等術(shù)后并發(fā)癥嚴(yán)重影響移植腎的存活率[5]。其中以排斥反應(yīng)最引人注目，對(duì)于機(jī)體而言移植腎作為外來(lái)器官，自然會(huì)被免疫系統(tǒng)識(shí)別并攻擊[6-7]。為方便醫(yī)師能夠及時(shí)準(zhǔn)確了解患者病情，針對(duì)性治療，臨床上需要一種高特異性、敏感性的非侵入的方法用于術(shù)后診斷腎功能障礙及排斥反應(yīng)。目前常用方法包括臨床生物化學(xué)檢測(cè)、彩色多普勒超聲、免疫抑制劑的血藥濃度監(jiān)測(cè)、移植物穿剌組織病理學(xué)檢查等[8]。但這些方法都有不同程度上的缺點(diǎn)，不能提供足夠的敏感性和特異性，且移植物穿刺組織病理學(xué)檢查是有創(chuàng)性的[9]。人們通過(guò)對(duì)代謝組的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體受到環(huán)境或自身改變影響時(shí)，細(xì)胞、組織甚至整體的代謝水平會(huì)發(fā)生變化，打破原本的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致體液中代謝物種類和濃度的改變[10]。這為臨床上篩選生物標(biāo)志物提供了新思路，在疾病診治，器官移植，藥效評(píng)價(jià)等諸多方面已有廣泛應(yīng)用。

1 代謝組學(xué)簡(jiǎn)介

1.1 代謝組學(xué)的概念在基因組學(xué)、翻譯組學(xué)、蛋白組學(xué)的研究逐漸成熟以后，科學(xué)家將注意力轉(zhuǎn)到了小分子化合物的研究上，代謝組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生，它可以對(duì)樣本中的小分子物質(zhì)(相對(duì)分子量小于1500)進(jìn)行大規(guī)模分析[11]。其研究手段主要依賴核磁共振或質(zhì)譜技術(shù)。其研究對(duì)象是細(xì)胞、組織或器官中所有代謝組分的集合。其研究結(jié)果可以理解為機(jī)體對(duì)基因水平、腸道微生物，蛋白酶活動(dòng)以及內(nèi)環(huán)境改變所作出的最終應(yīng)答?；蚪M學(xué)和蛋白組學(xué)從根源上解釋了機(jī)體內(nèi)可能發(fā)生的活動(dòng)及其過(guò)程，而代謝組學(xué)則直觀的告訴我們機(jī)體內(nèi)正在發(fā)生或已經(jīng)發(fā)生的活動(dòng)[12]。

代謝組學(xué)的研究方式可分為靶向與非靶向兩種。非靶向代謝組學(xué)的研究對(duì)象是樣本中的所有小分子化合物，包含未鑒定的化合物，因此非靶向代謝組學(xué)在發(fā)現(xiàn)新的差異代謝物方面有不錯(cuò)的效果，并能對(duì)差異代謝物進(jìn)行定性和相對(duì)變化的分析。而靶向代謝組學(xué)則針對(duì)特定代謝物，主要是同非靶向代謝組學(xué)聯(lián)用，針對(duì)非靶向代謝組學(xué)篩選的差異代謝物，進(jìn)行定量分析，達(dá)到對(duì)非靶向代謝組學(xué)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證的目的，同時(shí)利用更為詳細(xì)的數(shù)據(jù)對(duì)代謝模式進(jìn)行深入研究[13]。

1.2代謝組學(xué)臨床應(yīng)用在臨床研究中，代謝組學(xué)技術(shù)已廣泛用于疾病的診斷與預(yù)后，病理學(xué)研究，個(gè)性化用藥，以及藥物療效評(píng)價(jià)[14]。比如，利用代謝組學(xué)手段，發(fā)現(xiàn)了一系列診斷胰島素抵抗的生物標(biāo)志物。其中alpha-hydroxybutyrate可用于早期篩選，這項(xiàng)研究結(jié)果的發(fā)表，說(shuō)明人類在二型糖尿病發(fā)病的監(jiān)測(cè)和預(yù)防工作中更進(jìn)了一步[15-16]。此外，在腫瘤領(lǐng)域也引入了代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)各類腫瘤比如結(jié)直腸癌、乳腺癌等的發(fā)病機(jī)制、早期診斷及治療產(chǎn)生了推動(dòng)作用[17-18]。

然而代謝組學(xué)的諸多研究中，能夠在臨床醫(yī)療中取得實(shí)際應(yīng)用的卻很少。代謝組學(xué)研究對(duì)樣本數(shù)量、質(zhì)量和樣本處理技術(shù)要求較高，這使得大部分研究都停留在初級(jí)階段，難以發(fā)現(xiàn)有效的標(biāo)志物，且后續(xù)需要復(fù)雜、完整驗(yàn)證方法才能被用于臨床，這個(gè)過(guò)程較為漫長(zhǎng)[19]。美國(guó)梅奧診所測(cè)試目錄中有關(guān)代謝組學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目?jī)H有40余項(xiàng)，包括違禁藥物檢測(cè)、疾病診斷等，涉及代謝物不過(guò)幾十種。例如，對(duì)接受尼古丁替代法戒煙治療的病人監(jiān)測(cè)血清尼古丁、黃麻堿等代謝物的濃度，判定尼古丁替代品的使用劑量；對(duì)雌性激素的檢測(cè)，包括雌醇、雌二醇、雌三醇，用于乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估和母嬰疾病的診斷，并且在早產(chǎn)診斷方面比傳統(tǒng)的臨床評(píng)估更準(zhǔn)確。

2 代謝組學(xué)在腎移植中的研究現(xiàn)狀

腎具有排泄和重吸收功能，涉及多種物質(zhì)的生成及平衡，腎功能的穩(wěn)定決定了人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，也影響著人體新陳代謝。因此在腎相關(guān)研究中引入代謝組學(xué)技術(shù)是完全可行的。在腎移植領(lǐng)域，已有很多學(xué)者以腎移植患者的血清、糞便、尿液等為標(biāo)本，通過(guò)代謝組學(xué)的方法對(duì)樣本進(jìn)行處理并分析數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了一系列新的潛在小分子診斷標(biāo)記物。

2.1代謝組學(xué)與腎移植急性排斥反應(yīng)急性排斥反應(yīng)(acute graft rejection,AR)對(duì)移植腎發(fā)揮功能具有重大影響，在腎移植術(shù)后并發(fā)癥中屬于最常見(jiàn)的，可由感染、間質(zhì)性腎炎或急性腎小管壞死導(dǎo)致。近些年免疫抑制劑的使用使AR發(fā)生得到有效控制，但如果可以在術(shù)前發(fā)現(xiàn)可能發(fā)生急性排斥的患者的代謝特征，則可根據(jù)患者免疫狀態(tài)指導(dǎo)免疫抑制劑的使用，優(yōu)化治療方案。Long等[20]對(duì)15例腎移植患者進(jìn)行尿液代謝組學(xué)分析，結(jié)果顯示，蘇糖醇、肌醇、乙醇酸、3-羥基異戊酸、十八烷酸和磷酸鹽等共14種代謝物在急排組和正常組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Zhao等[21]采用非靶向液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-Mass spectrometry,LC-MS)的代謝組學(xué)方法，對(duì)11名AR患者和16名非AR患者術(shù)前及術(shù)后的代謝物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)肌酐、犬尿氨酸、多不飽和脂肪酸、磷脂酰膽堿及鞘磷脂等一些代謝物在AR發(fā)生時(shí)出現(xiàn)了血清濃度的變化。其中犬尿氨酸濃度在非AR組中的增加是一個(gè)較為重要的發(fā)現(xiàn)，犬尿氨酸由色氨酸的降解形成，是通過(guò)吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)加工合成，IDO的表達(dá)有助于抑制T細(xì)胞增殖并促進(jìn)免疫耐受，這可能成為為治療AR的潛在策略。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)在移植前，AR組的硫酸化類固醇含量較非AR組低。

2.2代謝組學(xué)與腎移植狀態(tài)的監(jiān)測(cè)腎移植術(shù)后的腎存活率受多種因素影響，為提高治療效果保證移植物存活，需對(duì)腎移植不同時(shí)期患者的代謝產(chǎn)物進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，因?yàn)樵S多代謝物都可表示腎功能，這有助于在移植腎發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷之前指導(dǎo)用藥修正腎功能。戴勇等[22]利用核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技術(shù)，對(duì)不同時(shí)期的術(shù)后腎功能正常的腎移植患者(術(shù)前、術(shù)后1 d、術(shù)后7 d)做連續(xù)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，并與健康組做對(duì)照，鑒定出甘氨酸、肌酸、氧化三甲胺(trimethylamine-N-oxide,TMAO)等共10個(gè)代謝物在腎移植不同時(shí)期發(fā)生顯著變化，可推薦為生物標(biāo)志物，利用偏最小二乘判別模型診斷的敏感性為98.7%，特異性為95.4%。這些代謝物參與了能量、氨基酸、脂質(zhì)及核苷酸代謝，其中TMAO在多項(xiàng)研究中被檢測(cè)到，TMAO由腎髓質(zhì)產(chǎn)生，作用是維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，它的出現(xiàn)常為了平衡腎應(yīng)激反應(yīng)中高濃度的尿素、胍和胍類衍生物，這提示移植腎功能障礙可能由于髓質(zhì)細(xì)胞的損傷[23]。該研究關(guān)注患有終末期腎病需要進(jìn)行腎移植手術(shù)治療的患者，對(duì)術(shù)前腎功能異常到術(shù)后腎功能逐漸穩(wěn)定的整個(gè)治療過(guò)程進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)，其結(jié)果為探索腎移植作用機(jī)制和臨床治療效果評(píng)估作出了基礎(chǔ)貢獻(xiàn)。

2.3代謝組學(xué)與移植腎功能延遲恢復(fù)移植物功能延遲恢復(fù)(delayed graft function,DGF)的發(fā)生率為20%～25%，在術(shù)后早期有概率導(dǎo)致近端腎小管上皮細(xì)胞丟失影響移植腎功能，出現(xiàn)此癥狀的患者需要在術(shù)后第一周進(jìn)行透析，大大影響了生活質(zhì)量。缺血再灌注損傷是導(dǎo)致DGF的一大原因[24]。Kostidis[25]等為了預(yù)測(cè)患者腎移植功能延遲恢復(fù)的持續(xù)時(shí)間，采用核磁共振光譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)的方法對(duì)90名患者的尿液代謝物進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)1年的跟蹤監(jiān)測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，纈氨酸、對(duì)羥基富馬酸、富馬酸、2-乙基丙烯酸酯、亮氨酸和乳酸等多種代謝物在DGF不同時(shí)期的患者中具有顯著差異，并通過(guò)計(jì)算代謝物比例的方式建立診斷模型，得出兩組比例即乳酸鹽/富馬酸鹽和支鏈氨基酸 /焦谷氨酸鹽用以預(yù)測(cè)DGF的持續(xù)時(shí)間，AUC達(dá)到了0.85，具有較高的診斷價(jià)值。依托NMR技術(shù)的高重現(xiàn)性，這將為臨床上監(jiān)測(cè)DGF和指導(dǎo)術(shù)后管理提供幫助。

2.4代謝組學(xué)與腎缺血/再灌注損傷腎缺血再灌注損傷(renal ischemic reperfusion injury,RIRI)是指由腎缺血和血液灌注恢復(fù)后引起的組織、細(xì)胞功能破壞，并伴隨代謝異常的現(xiàn)象[26]。發(fā)病時(shí)，可能出現(xiàn)氧自由基大量生成，鈣離子濃度上升，炎癥因子的激活等現(xiàn)象，這些最終會(huì)導(dǎo)致移植物功能障礙[27]。Serkova等[28]基于NMR技術(shù)對(duì)中度和重度RIRI的代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，尿囊素和TMAO的濃度隨RIRI程度加深上升，兩者之間呈正相關(guān)，尿囊素是氧化應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志物，而TMAO是髓質(zhì)損傷的標(biāo)志物，這與RIRI發(fā)生的機(jī)制不謀而合，提示尿囊素和TMAO作為生物標(biāo)志物在監(jiān)測(cè)RIRI方面有較大潛力。TMAO的發(fā)現(xiàn)也再一次印證了RIRI與DGF相關(guān)?；谶@些研究基礎(chǔ)，F(xiàn)uller[29]等探討了N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)預(yù)處理對(duì)于RIRI的影響，結(jié)果顯示，NAC預(yù)處理組的尿囊素和TMAO濃度顯著降低，這預(yù)示NAC治療可能通過(guò)改善游離氧自由基的有害作用來(lái)改善RIRI。

2.5代謝組學(xué)與免疫抑制劑應(yīng)用終末期腎病的患者在進(jìn)行腎移植手術(shù)后，需要使用免疫抑制劑來(lái)抑制免疫系統(tǒng)對(duì)移植腎的攻擊。然而免疫抑制劑也存在著副作用，因此在免疫治療時(shí)，免疫抑制劑的用法用量顯得非常重要。臨床上往往采用聯(lián)合用藥的方式，發(fā)揮多種藥物抑制排斥反應(yīng)的協(xié)同作用的同時(shí)，降低單一藥物的副作用[30]。在治療過(guò)程中，如果免疫抑制劑使用不足，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生排斥反應(yīng)，若使用過(guò)量，又會(huì)引起不良反應(yīng)，加之個(gè)體對(duì)免疫抑制劑的反應(yīng)不盡相同，急需建立一種評(píng)價(jià)免疫抑制劑效果的方法，準(zhǔn)確設(shè)計(jì)及調(diào)整免疫抑制劑的使用方案。Xia等[31]利用靶向代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)使用他克莫司進(jìn)行免疫治療的腎移植患者尿液樣本中的代謝物進(jìn)行定量分析研究，認(rèn)為對(duì)稱二甲基精氨酸(symmetricdimethylarginine,SDMA)和絲氨酸(Ser)的變化可用來(lái)診斷因他克莫司腎毒性引起的腎損傷。該研究首次對(duì)尿液中的氨基酸和生物胺進(jìn)行靶向代謝組學(xué)定量分析，深入研究，其結(jié)果揭示了他克莫司腎毒性對(duì)腎過(guò)濾負(fù)荷、腎小管重吸收和尿量的影響。同時(shí)，臨床尿液樣本具有收集方便、無(wú)創(chuàng)、可重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)，因此對(duì)尿液代謝物的深入研究相對(duì)更容易開(kāi)展并普及。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

接受腎移植手術(shù)的患者，由于在手術(shù)過(guò)程中可能會(huì)受到不同程度的器官功能受損，導(dǎo)致術(shù)后產(chǎn)生一定程度的代謝紊亂，加之術(shù)后免疫系統(tǒng)的復(fù)雜反應(yīng)和免疫抑制劑的長(zhǎng)期使用，使得術(shù)后機(jī)體生理狀態(tài)復(fù)雜，且有患術(shù)后并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)存在，單一的生物標(biāo)志物或傳統(tǒng)的臨床檢驗(yàn)指標(biāo)很難對(duì)移植腎的功能、狀態(tài)做出及時(shí)準(zhǔn)確的判斷。由于代謝組學(xué)檢測(cè)的高敏感性和特異性，在生物標(biāo)志物的篩選和診斷模型的建立上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，為腎移植術(shù)后早期診斷及移植物監(jiān)測(cè)帶來(lái)了新的契機(jī)[32]。

現(xiàn)在，質(zhì)譜技術(shù)的普及為臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)，統(tǒng)計(jì)軟件的優(yōu)化及生物信息學(xué)的發(fā)展為處理和分析龐大的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)提供了支撐，不斷豐富的代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)和不斷先進(jìn)的代謝組學(xué)技術(shù)，拓寬了代謝組學(xué)的影響范圍，加深了代謝組學(xué)的研究層次[33]。代謝組學(xué)方法在應(yīng)用時(shí)如能與上游的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)以及影響人類代謝及健康的腸道微生物組進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，將在疾病機(jī)制的研究中發(fā)揮巨大的作用。