肝細(xì)胞癌細(xì)胞中差異表達(dá)環(huán)狀RNA與microRNA-1相關(guān)的生物信息學(xué)分析

董葉萍，周心怡，費(fèi)思力，樓 淳，童 甜，龐夢(mèng)婷，王 穎

0 引 言

Micro RNA(miRNA)是由20～25個(gè)堿基組成的，長(zhǎng)度為 19～24 nt的非編碼小分子RNA。在細(xì)胞中，miRNA通過(guò)堿基序列互補(bǔ)的原則來(lái)識(shí)別靶基因的mRNA，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因蛋白的表達(dá)。MiRNA的表達(dá)失調(diào)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并且miRNA可能發(fā)揮抑癌基因或癌基因的作用[1-5]。近些年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)證明micro RNA與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-7]。MicroRNA-1定位于人染色體 20q13.33和人染色體 18ql1.2，在平滑肌、骨骼肌的分化成熟中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。MicroRNA-1一般是由AGO蛋白家族介導(dǎo)靶向到靶基因的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)靶基因發(fā)揮抑制和/或降解作用。據(jù)報(bào)道，microRNA-1可通過(guò)調(diào)控其下游靶基因的表達(dá)進(jìn)而影響肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展[9]。

真核細(xì)胞中存在共價(jià)閉合的環(huán)狀RNA(circRNAs)[10]。CircRNAs具有高穩(wěn)定性、高豐度以及發(fā)育特異性等特征，較線性RNA更為穩(wěn)定。很多circRNAs現(xiàn)已被證明具有重要的生物學(xué)功能，可以通過(guò)海綿作用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNAs，可以順式調(diào)控親本基因的表達(dá)，甚至有些可以翻譯具有功能的蛋白[11]。研究表明circRNAs 也與腫瘤的表達(dá)失調(diào)與腫瘤發(fā)生、進(jìn)程及其他疾病的發(fā)生密切相關(guān)。在肝細(xì)胞癌中，與癌旁組織比較，肝細(xì)胞癌組織有一些顯著差異表達(dá)的circRNAs[12-13]。需進(jìn)一步思考研究的是，與肝細(xì)胞癌中靶基因蛋白的高表達(dá)或低表達(dá)相關(guān)的差異性表達(dá)的circRNAs，這部分circRNAs是否調(diào)控親本基因的轉(zhuǎn)錄與microRNA-1共同調(diào)控下游靶基因的表達(dá)進(jìn)而影響肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)microRNA-1的靶基因進(jìn)行分析，進(jìn)一步篩選與靶基因相關(guān)且在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中差異表達(dá)的circRNAs，為臨床篩選與肝細(xì)胞癌相關(guān)的分子標(biāo)志物及靶點(diǎn)治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及數(shù)據(jù)來(lái)源利用Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)、miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)和miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)預(yù)測(cè)microRNA-1的靶基因；利用circRNADb數(shù)據(jù)庫(kù)、CircBank數(shù)據(jù)庫(kù)、Circular RNAs 數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)預(yù)測(cè)與microRNA-1下游靶基因相關(guān)的circRNAs。

1.2方法

1.2.1microRNA-1下游靶基因預(yù)測(cè)利用Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)、miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)和miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)預(yù)測(cè)microRNA-1的靶基因，取預(yù)測(cè)結(jié)果的交集，將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)均預(yù)測(cè)到的靶基因作為進(jìn)一步分析的集合，選取Context+值(通過(guò)加權(quán)平均數(shù)計(jì)算的一系列功能的貢獻(xiàn)之和)較小的，且預(yù)測(cè)可能性最大的miRNA-1影響最密切相關(guān)的靶基因。

1.2.2miRNA-1的靶基因的GO功能富集分析利用生物信息數(shù)據(jù)庫(kù) DAVID6.7 進(jìn)行microRNA-1靶基因的功能富集分析(GO-analysis)，其在線分析的網(wǎng)址為https://david-d.ncifcrf.gov/，根據(jù)P值的高低和microRNA-1靶基因的數(shù)量進(jìn)行排序，得到microRNA-1的靶基因的生物學(xué)功能信息。

1.2.3microRNA-1的靶基因的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析利用生物信息數(shù)據(jù)庫(kù) DAVID6.7 進(jìn)行microRNA-1靶基因的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析，其在線分析的網(wǎng)址為https://david-d.ncifcrf.gov/，其中X軸為P值，Y軸是富集的通路，點(diǎn)的面積正比例于Count基因數(shù)量，點(diǎn)的顏色深度正比例于P值，點(diǎn)越大、P值越小，得到microRNA-1靶基因在KEGG通路中與microRNA-1相關(guān)靶基因的生物學(xué)通路信息。

1.2.4與microRNA-1下游靶基因有相互調(diào)控關(guān)系的circRNAs再次利用生物信息學(xué)的方法在3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行高通量的數(shù)據(jù)篩選，通過(guò)circRNADb數(shù)據(jù)庫(kù)、CircBank數(shù)據(jù)庫(kù)、Circular RNAs 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的對(duì)比分析，選取篩選結(jié)果的交集，再通過(guò)DeepBase數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)交集結(jié)果circRNAs在HepG2細(xì)胞株中表達(dá)量情況。

2 結(jié) 果

2.1miRNA-1下游靶基因預(yù)測(cè)通過(guò)Targetscan 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)microRNA-1進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)， microRNA-1靶基因總數(shù)有3749 個(gè)；通過(guò)miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)microRNA-1進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)， miRNA-1靶基因總數(shù)有913個(gè)；通過(guò)miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)microRNA-1進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)有1349個(gè)，將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總，選取交集部分，得到3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)交集靶基因230個(gè)。Context+值較小且預(yù)測(cè)可能性最大的20個(gè)與miRNA-1影響最密切相關(guān)的靶基因，包括UCHL5、FAM81A、SREK1、G6PD、RPS6KA5、PTAR1、SERP1、CETN3、PRPF40A、CLDN12、SRI、IL6、FBXO45、YTHDC1、CAND1、hnRNPD、OSTF1、CNOT6L、TMOD3、GNG5。

2.2microRNA-1的靶基因的GO功能富集分析通過(guò)GO分析的得到183個(gè)microRNA-1的富集信息，進(jìn)行整合排序。通過(guò)GO分析發(fā)現(xiàn)microRNA-1的靶基因在調(diào)控方面有很強(qiáng)的傾向性，其預(yù)測(cè)結(jié)果顯示microRNA-1的靶基因主要富集在生物學(xué)功能、參與的生物過(guò)程以及細(xì)胞定位這3個(gè)方面。microRNA-1的靶基因參與了蛋白質(zhì)的功能(定位、轉(zhuǎn)運(yùn)、結(jié)合)，生物合成過(guò)程的調(diào)控(RNA代謝過(guò)程的調(diào)控、氮化合物代謝過(guò)程、轉(zhuǎn)錄的調(diào)控)，輔助因子結(jié)合及酶調(diào)節(jié)等生物過(guò)程中。選取了前10的結(jié)果，見(jiàn)表1。

表1 miRNA-1靶基因的基因GO功能分析

Table 1 Analysis of GO Function of the Target Gene of MicroRNA-1

GO名稱(chēng)條目數(shù)量P值GO:0008104蛋白質(zhì)定位300.000GO:0015031蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)260.000GO:0045184蛋白質(zhì)定位建立260.000GO:0031328細(xì)胞生物合成過(guò)程的正向調(diào)控250.000GO:0009891生物合成過(guò)程的正向調(diào)控250.000GO:0051173氮化合物代謝過(guò)程的正向調(diào)控230.000GO:0034613細(xì)胞蛋白質(zhì)定位190.000GO:0070727細(xì)胞大分子定位190.000GO:0045893DNA依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控190.000GO:0051254RNA代謝過(guò)程的正向調(diào)控190.000

2.3miRNA-1靶基因的基因的Pathway信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析通過(guò)富集分析得到40個(gè)在KEGG通路中與microRNA-1相關(guān)靶基因的生物學(xué)通路信息。根據(jù)Pathway分析的結(jié)果，將所有數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，根據(jù)P值的高低進(jìn)行排序，選取15個(gè)結(jié)果。根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示 miRNA-1預(yù)測(cè)靶基因顯著富集于癌癥信號(hào)通路、乙型肝炎的發(fā)生、內(nèi)吞作用及拼接體等信號(hào)通路中，表明microRNA-1的靶基因與此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)系越密切。見(jiàn)圖1。

2.4篩選與microRNA-1下游靶基因相關(guān)的circRNAs通過(guò)circRNADb、 CircBank 、Circular RNAs 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的circRNAs的數(shù)量個(gè)數(shù)分別是41、168和169個(gè)。再取篩選結(jié)果的交集，最終相重合的有21個(gè)circRNAs，其中hsa_circ_0004651在肝細(xì)胞癌的細(xì)胞株HepG2中為低表達(dá)，其親本基因?yàn)閔nRNP D。見(jiàn)表2。

圖 1 miRNA-1靶基因的相關(guān)通路分析

Figure 1 Pathway analysis of the target gene of microRNA-1

表 2 與miRNA-1靶基因有相互調(diào)控關(guān)系的circRNAs

Table 2 CircRNAs interacting with the target gene of microRNA-1

circbase名稱(chēng)最佳轉(zhuǎn)錄本t基因符號(hào)定位拼接長(zhǎng)度hsa_circ_0001420NM_031370hnRNPDchr4:83276456-83280792808hsa_circ_0004651NM_031370hnRNPDchr4:83279811-83280792331hsa_circ_0005569NM_139168SREK1chr5:65449290-65455162374hsa_circ_0006168NM_144571CNOT6Lchr4:78694234-78697546395hsa_circ_0007943NM_014547TMOD3chr15:52179785-52181342898hsa_circ_0015733NM_015984UCHL5chr1:192997214-192998787699hsa_circ_0032939NM_004755RPS6KA5chr14:91409421-91413894781hsa_circ_0032940NM_004755RPS6KA5chr14:91409421-914675031030hsa_circ_0035292NM_014547TMOD3chr15:52161413-52194233898hsa_circ_0035296NM_014547TMOD3chr15:52186011-52194233528hsa_circ_0035298NM_014547TMOD3chr15:52161413-52194233297hsa_circ_0087159NM_001099666PTAR1chr9:72338241-72356774691hsa_circ_0087160NM_001099666PTAR1chr9:72347054-72347268556hsa_circ_0087162NM_001099666PTAR1chr9:72347054-72356774386hsa_circ_0087226NM_012383OSTF1chr9:77742484-77755848505hsa_circ_0102858ENST00000261991.3RPS6KA5chr14:91339975-91372643781hsa_circ_0102860ENST00000261991.3RPS6KA5chr14:91356830-913726431030hsa_circ_0102861ENST00000261991.3RPS6KA5chr14:91356830-913895401218hsa_circ_0102863ENST00000261991.3RPS6KA5chr14:91386549-91413894412hsa_circ_0102869ENST00000261991.3RPS6KA5chr14:91409421-91444868443hsa_circ_0111558ENST00000367451.4UCHL5chr1:192990226-192998787699

3 討 論

Micro RNA的編碼基因是一類(lèi)調(diào)節(jié)基因，在細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、發(fā)育、代謝以及凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[1-3]。目前已知miRNA發(fā)揮作用的方式之一是通過(guò) miRNA 的下游靶基因來(lái)起作用，其靶基因的發(fā)現(xiàn)主要是通過(guò)軟件預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證2個(gè)方法，本研究主要采取的是軟件預(yù)測(cè)的方法。

目前為止，已發(fā)現(xiàn)circRNAs的生物學(xué)功能主要有在細(xì)胞核內(nèi)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控；在轉(zhuǎn)錄時(shí)與mRNA前體發(fā)生剪切競(jìng)爭(zhēng)；在細(xì)胞質(zhì)中與miRNA競(jìng)爭(zhēng)mRNA的靶向結(jié)合位點(diǎn)以及翻譯功能[14-16]。目前很多的研究都集中在circRNAs作為“miRNA海綿”的功能上，對(duì)其他功能特別是在肝細(xì)胞癌中的其他功能研究較少。這就為本研究提供了方向：是否存在某些circRNAs通過(guò)調(diào)控其親本基因的表達(dá)，與miRNA-1共同調(diào)控靶基因的表達(dá)來(lái)影響肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。目前circRNAs通過(guò)調(diào)控親本基因的表達(dá)影響肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)報(bào)道研究較少。本研究篩選到的miRNA-1的其中1個(gè)靶基因?yàn)閔nRNP D，是一種RNA結(jié)合蛋白，可通過(guò)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。它在不同腫瘤中的表達(dá)情況具有顯著的差異性，hnRNPD作為標(biāo)志物在腫瘤中具有較大的研究?jī)r(jià)值。hnRNPD蛋白的功能豐富，其中與腫瘤的發(fā)生發(fā)展較為密切。有研究證明hnRNP蛋白在腫瘤中是高表達(dá)[17-18]，本研究也發(fā)現(xiàn)hnRNPD在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，研究顯示在非小細(xì)胞肺癌中檢測(cè)到hnRNP蛋白的表達(dá)異常且早期比晚期數(shù)量較多[19]。在肝細(xì)胞癌中hnRNPD的表達(dá)異常，是否可作為肝細(xì)胞癌診斷的標(biāo)志物，具有較大的研究?jī)r(jià)值。同時(shí)hsa_circ_0004651在肝癌細(xì)胞HepG2中顯著低表達(dá)，由此我們猜想hsa_circ_0004651通過(guò)調(diào)控其親本基因hnRNPD來(lái)參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，這很可能是circRNAs參與腫瘤代謝重編程重要方式之一。

本研究采用的生物信息學(xué)分析是一種高通量的檢測(cè)手段，即從成百上千個(gè)在某種特定條件下與疾病(腫瘤)有特異性表達(dá)相關(guān)的環(huán)狀分子進(jìn)行篩選以及進(jìn)行microRNA-1下游靶基因的預(yù)測(cè)和功能通路分析，這樣很大程度提升了預(yù)測(cè)及篩選的特異性和準(zhǔn)確性，然后通過(guò)GO的功能富集分析和KEGG的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析，得到了microRNA-1的靶基因集合在蛋白質(zhì)的功能、生物合成過(guò)程的調(diào)控、輔助因子結(jié)合及酶調(diào)節(jié)等生物過(guò)程中；富集于乙型肝炎、內(nèi)吞作用及拼接體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。通過(guò)對(duì)已有信息的整合分析，推測(cè)出一些microRNA-1的相關(guān)靶基因與肝細(xì)胞癌之間的相互關(guān)系，但是絕大部分與臨床相關(guān)的及研究所需要的 microRNA-1的靶基因需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定或驗(yàn)證，而在本研究中此部分未涉及和未進(jìn)行microRNA-1的可接近性分析。雖然本研究完成生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)，但如要進(jìn)行下一步的研究，也可分別進(jìn)行microRNA-1的相互作用的功能學(xué)驗(yàn)證和結(jié)構(gòu)學(xué)驗(yàn)證，在此未涉及。

本研究利用miRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)microRNA-1的靶基因，并對(duì)靶基因進(jìn)行功能富集分析和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析。再次利用生物信息學(xué)的方法，篩選與microRNA-1下游靶基因相關(guān)的circRNAs。我們從中找到了進(jìn)一步研究的方向，為下一步的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。若能在實(shí)驗(yàn)中證明circRNAs通過(guò)調(diào)控其親本基因hnRNPD的轉(zhuǎn)錄與microRNA-1共同調(diào)控其靶基因的表達(dá)從而參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，將有望幫助發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌診斷的新標(biāo)志物，這些對(duì)于肝細(xì)胞癌的早期診斷及靶向治療具有重要的實(shí)際意義，也可能在將來(lái)是成為靶向治療肝細(xì)胞癌的突破點(diǎn)。