通痹顆粒對膠原性關節(jié)炎大鼠Wnt信號通路DKK1、β-catenin表達的影響

柳玉佳 王莘智 吳伊瑩 廖亮英 范伏元

（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007）

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的自身免疫性疾病，其特征是侵蝕性關節(jié)炎的慢性、進行性發(fā)展，可發(fā)生于任何年齡[1]。目前RA的發(fā)病機制尚不清楚，基本病理表現(xiàn)為滑膜炎和異常增生的血管翳，關節(jié)軟骨和骨的進行性破壞，最終引起關節(jié)畸形和功能喪失[2-3]。因此，早期、規(guī)范診治是控制RA發(fā)生發(fā)展，改善預后的根本[4]。Wnt/β-catenin信號通路被稱為經典Wnt信號通路，與RA的炎癥和骨破壞密切相關[5]。通痹顆粒為我院的內部制劑，實驗研究證實其可以緩解佐劑性關節(jié)炎大鼠的關節(jié)炎癥[6]，但具體機制尚未完全明確。本研究擬通過觀察Wnt/β-catenin信號通路重要的負性調節(jié)因子Dickkopf 1（DKK1）和關鍵蛋白β-連環(huán)蛋白（β-catenin）的表達情況，探討通痹顆粒對RA模型——膠原性關節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠滑膜組織異常增生的調控機制，現(xiàn)報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康SD雌性大鼠，SPF級，體重200～250 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證編號：SCXK（湘）2009-0004，于湖南中醫(yī)藥大學實驗中心室完成動物飼養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑 通痹顆粒，藥物組成：當歸30 g、黃芪15 g、白芍10 g、川芎10 g、全蝎5 g、僵蠶10 g、乳香10 g、沒藥10 g、桂枝10 g、黃柏10 g、甘草3 g，顆粒劑，用量為中草藥的等效劑量，由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑科提供，并由煎藥室制備濃縮為含生藥2 g/mL。雷公藤多苷片，浙江得恩德藥業(yè)有限公司生產，國藥準字：Z33020422，規(guī)格：10 mg×50片。牛Ⅱ型膠原、不完全弗氏佐劑，購自美國Chondrex公司；DKK1 ELISA試劑盒、β-catenin ELISA試劑盒，購自武漢菁禾生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 YLS-TA型足趾容積測量儀（山東醫(yī)學科學院設備站）；石蠟包埋機、切片機（德國Leica公司）；光學顯微鏡、圖像分析儀（日本OLYMPUS公司）；酶標儀（美國Biotech公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 40只大鼠適應性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為空白組、模型組、陽性藥物組和通痹顆粒組，每組10只。除空白組外其余各組予牛Ⅱ型膠原誘導CIA大鼠模型，空白組注射等量生理鹽水。造模方法參考文獻[7]，將牛Ⅱ型膠原蛋白冰浴完全溶解在冰醋酸中，并用不完全弗氏佐劑乳化，制備牛Ⅱ型膠原，通過皮內注射0.2 mg于大鼠尾根部進行初始免疫，7 d后同前法以0.1 mg進行增強免疫。初次免疫后第21天進行造模評判，大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分≥6分，則為造模成功。本研究造模過程順利，二次免疫后評判均成功造模。

2.2 給藥方法 成功造模后按人鼠體表面積換算藥物劑量進行灌胃給藥。通痹顆粒組：予通痹顆粒濃縮液灌胃，每日20 g/kg。陽性藥物組：雷公藤多苷片溶于生理鹽水，每日灌胃劑量約為2.4 mg/kg?？瞻捉M和模型組予等量生理鹽水灌胃。各組均每日灌胃1次，連續(xù)14 d。

2.3 指標檢測 所有大鼠于治療前和治療第7、14天時觀察關節(jié)病變情況，進行關節(jié)炎指數(shù)評分，測量關節(jié)腫脹度。灌胃第15天通過腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉處死，于右后足踝關節(jié)剝離滑膜用于滑膜組織病理學檢查，腹主動脈采血用于血清學指標檢測。

2.3.1 關節(jié)炎指數(shù)評分 參照Wood氏的關節(jié)炎評估標準[6]，根據(jù)關節(jié)病變程度按照5級量表法進行評分：關節(jié)不紅不腫計為0分，只有小趾關節(jié)紅腫為1分，僅為趾關節(jié)和足跖出現(xiàn)紅腫計為2分，腳踝以下的所有足爪腫脹為3分，全部足爪均出現(xiàn)紅腫計為4分。對每個關節(jié)的積分累積即為關節(jié)炎指數(shù)，最大值16分。分別于治療前和治療第7、14天進行評估。

2.3.2 關節(jié)腫脹度測量 采用足跖腫脹度測量儀對大鼠左后足踝關節(jié)進行評估，通過足跖容積的變化程度來估測大鼠的關節(jié)腫脹度。分別于治療前和治療第7、14天進行測量。

2.3.3 蘇伊紅（HE）染色法觀察滑膜病理形態(tài) 滑膜組織在10%福爾馬林液中固定24 h，脫鈣，自流水沖洗，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，HE染色，中性樹脂封片，在200倍光學顯微鏡下觀察滑膜組織形態(tài)。

2.3.4 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定血清DKK1、β-catenin水平 全血靜置1 h，以離心半徑10 cm，3 000 r/min的速度離心20 min，取出上層血清ELISA法測定DKK1、β-catenin水平，具體操作按照試劑盒說明書進行。

2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件，計量資料采用（-x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗和單向ANOVA分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠治療前后關節(jié)炎指數(shù)評分比較 治療前和治療第7、14天，除空白組外其余各組大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分均明顯高于空白組（P＜0.01）；治療第7、14天，各治療組大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分均明顯低于本組治療前和模型組治療同時期（P＜0.05），治療第14天指標明顯低于治療第7天（P＜0.05），陽性藥物組與通痹顆粒組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠治療前后關節(jié)炎指數(shù)評分比較（±s） 單位：分

表1 各組大鼠治療前后關節(jié)炎指數(shù)評分比較（±s） 單位：分

注： 與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05 ；與本組治療前比較，#P＜0.05；與本組治療第7天比較，★P＜0.05。

組別 動物數(shù)/只 治療前 治療第7天 治療第14天空白組 10 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 10 8.60±1.07** 9.10±0.85** 9.80±0.21**陽性藥物組 10 8.70±1.13** 7.30±0.41**▲# 5.30±0.27**▲#★通痹顆粒組 10 8.60±0.98** 7.10±0.37**▲# 5.10±0.32**▲#★

3.2 各組大鼠造模前及治療前后關節(jié)腫脹度比較 治療前和治療第7、14天，除空白組外其余各組大鼠關節(jié)腫脹度均明顯高于空白組（P＜0.05）；治療第7、14天，各治療組大鼠關節(jié)腫脹度均明顯低于本組治療前和模型組治療同時期（P＜0.05），治療第14天指標明顯低于治療第7天（P＜0.05），陽性藥物組與通痹顆粒組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠治療前后關節(jié)腫脹度比較（±s） 單位：mL

表2 各組大鼠治療前后關節(jié)腫脹度比較（±s） 單位：mL

注： 與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與本組治療前比較，#P＜0.05；與本組治療第7天比較，★P＜0.05。

組別 動物數(shù)/只 治療前 治療第7天 治療第1 4天空白組 1 0 1.6 6±0.3 8 1.6 3±0.3 5 1.6 5±0.1 7模型組 1 0 2.1 3±0.5 6* 2.1 5±0.3 7* 2.0 9±0.2 3*陽性藥物組 1 0 2.1 4±0.4 7* 1.9 2±0.4 3*▲# 1.7 8±0.1 5*▲#★通痹顆粒組 1 0 2.1 4±0.5 1* 1.8 9±0.3 5*▲# 1.7 4±0.1 4*▲#★

3.3 各組大鼠關節(jié)滑膜病理學情況比較 空白組滑膜組織未增厚，滑膜細胞排列整齊，未觀察到血管增生及炎癥細胞浸潤；模型組滑膜組織明顯增厚，細胞排列紊亂，血管明顯增生，大量炎癥細胞浸潤；陽性藥物組滑膜組織略微增厚，細胞排列較整齊，血管輕度增生，小量炎癥細胞浸潤；通痹顆粒組滑膜組織略微增厚，滑膜細胞排列較有序，血管增生不明顯，可見少量炎性細胞浸潤。提示陽性藥物組和通痹顆粒組CIA大鼠病變關節(jié)的滑膜病理組織結構均有一定的好轉，通痹顆粒組稍優(yōu)于陽性藥物組。見圖1。

圖1 各組大鼠滑膜組織病理學情況（HE，×200）

3.4 各組大鼠血清DKK1、β-catenin表達比較 與空白組比較，其余各組大鼠血清DKK1、β-catenin均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組血清DKK1、β-catenin水平明顯降低（P＜0.05）；陽性藥物組和通痹顆粒組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠血清DKK1、β-catenin表達比較（±s）

表3 各組大鼠血清DKK1、β-catenin表達比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

組別 動物數(shù)/只 DKK1/（ng/mL） β-catenin/（pg/mL）空白組 10 3.53±1.27 23.41±4.28模型組 10 9.36±1.22* 29.23±5.15*陽性藥物組 10 6.15±1.18*▲ 26.04±4.42*▲通痹顆粒組 10 5.97±1.09*▲ 25.89±3.77*▲

4 討論

RA的主要病理變化是炎癥和滑膜的異常增殖，其特征在于血管新生、關節(jié)軟骨和骨損傷。Wnt/β-catenin信號通路是細胞增殖分化的關鍵調節(jié)途徑，與RA的發(fā)病機制密切相關。DKK1為通路上游的重要負性調節(jié)因子，β-catenin為通路的關鍵蛋白，與Wnt/β-catenin信號通路調控作用密切相關。肖光華等[8]發(fā)現(xiàn)Wnt通路參與了CIA大鼠的發(fā)病機制，可能通過上調DKK1、下調骨保護素誘導關節(jié)炎癥。XIAO等[9]實驗證實，RA患者滑膜細胞中β-catenin的表達增加，通過抑制Wnt/β-catenin信號通路進而抑制滑膜炎性可能是RA治療的關鍵。SANTOS等[10]發(fā)現(xiàn)，Wnt通路抑制劑DKK1的過度表達與RA骨質破壞有關，可以作為RA關節(jié)破壞的生物標志物。MATZELLE等[11]研究證實，RA骨侵蝕的修復發(fā)生在炎癥消退的環(huán)境中，與Wnt/β-catenin信號通路密切相關。因此，研究Wnt/β-catenin信號通路在RA炎癥及骨破壞的雙向調節(jié)作用是非常重要的[12]。

RA可歸屬于中醫(yī)學“歷節(jié)病”“鶴膝風”等范疇?！蹲C治匯補》曰：“久則須分氣血虛實，痰瘀多少治之?！北菊n題組根據(jù)前期研究[13]及臨床觀察，提出了RA的“虛”“痰”“瘀”論治，并研制出具有“益氣養(yǎng)血，化痰逐瘀”功效的通痹顆粒。方中重用當歸為君，養(yǎng)血活血、止痛利筋；黃芪補氣益衛(wèi)，以資氣血生化之源，白芍斂陰養(yǎng)血、緩急止痛，二者共為臣藥；川芎行氣活血，和血而不滯血；全蝎、僵蠶治風化痰、散結通經；乳香、沒藥通氣活血，不至耗傷氣血；桂枝溫通經脈、散寒止痛，使痰瘀易散；黃柏味苦性寒，能清熱燥濕、瀉火解毒、消腫祛腐，方中取反佐之意以清郁久所化之熱；甘草為使，調和諸藥。凡RA具有氣血虧虛、痰瘀互結者均可使用。實驗研究證實，通痹顆?？删徑庾魟┬躁P節(jié)炎大鼠的關節(jié)炎癥，并且對下丘腦-垂體-腎上腺軸及血清白介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）具有一定的調節(jié)作用，但具體機制尚未完全明確[6]。

本研究結果顯示，通痹顆粒治療后，CIA大鼠的關節(jié)炎癥指數(shù)和關節(jié)腫脹度明顯降低，提示通痹顆粒可以改善CIA大鼠的關節(jié)炎癥。滑膜病理檢查提示通痹顆粒治療后CIA大鼠關節(jié)滑膜組織及血管增生均明顯改善，血清DKK1、β-catenin水平均明顯降低，提示通痹顆粒對CIA大鼠的治療作用可能是通過對Wnt/β-catenin信號通路的調節(jié)作用實現(xiàn)的。通痹顆粒通過Wnt/β-catenin信號通路下調DKK1、β-catenin表達，從而防止異常血管增生和滑膜炎癥細胞浸潤，可能是通痹顆粒治療CIA的機制之一。但因Wnt/β-catenin信號通路相關因子的表達受多重因素影響，其具體的作用機制尚需進一步研究。此外，我們臨床發(fā)現(xiàn)通痹顆粒對RA并發(fā)的抑郁癥也有一定的緩解作用，下一步擬通過臨床及實驗研究觀察通痹顆粒對RA并發(fā)抑郁癥的干預作用，并探索其可能的機制。