電針對震顫麻痹大鼠黑質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

黃亮，趙宇輝，孫忠人，盛國濱，李曉寧，倪金霞，李雪巖，戴縉，王迪★

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱；2.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院，深圳；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京）

0 引言

震顫麻痹多見于老年人，隨著中國人口不斷地老齡化，震顫麻痹的發(fā)病率日益增長?；加姓痤澛楸缘睦夏耆酥饾u喪失行動力、生活自理能力，給家庭及社會帶來了負(fù)擔(dān)。震顫麻痹的病理改變主要表現(xiàn)在多巴胺神經(jīng)元的變性、缺失。研究發(fā)現(xiàn)，震顫麻痹大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元發(fā)生明顯凋亡現(xiàn)象[1]。本實(shí)驗研究在電鏡下觀察各組大鼠黑質(zhì)及紋狀體的病理形態(tài)學(xué)改變，觀察了電針舞蹈震顫區(qū)對震顫麻痹大鼠黑質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，旨在探究電針治療震顫麻痹的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用電針治療震顫麻痹提供基礎(chǔ)實(shí)驗佐證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗動物

100 只雄性成年SPF 級SD 大鼠，（250±20）g 體重。實(shí)驗動物由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗管理中心提供。所有實(shí)驗用鼠常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，自由飲食、飲水，實(shí)驗所有過程符合動物倫理實(shí)驗標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑與藥物

6- 羥基多巴胺（6-OHDA）（美國Sigma 公司）；阿樸嗎啡（APO）（美國Sigma 公司）；戊巴比妥鈉（德國Merck 公司）；4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司）；戊二醛（北京索萊寶科技有限公司）；TUNEL 檢測試劑盒（美國Sigma 公司）；蛋白酶K（美國Sigma 公司）；左旋多巴（上海福達(dá)制藥有限公司）。

1.1.3 主要儀器

腦立體定位儀（美國stoelting 公司）；德國LEICA 公司生產(chǎn)的EG1160 組織包埋機(jī)和RM2235 型切片機(jī)；日本奧林巴斯公司生產(chǎn)的CX41 奧林巴斯顯微鏡；日本JVC 公司的TK-C9201EC 型攝像頭；透射電子顯微鏡（日本）；KWD-808 Ⅱ型全能脈沖電療儀。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗分組

利用行為學(xué)篩選造模成功的大鼠36 只，隨機(jī)分為模型組、電針組、左旋多巴藥物組3 組，每組12 只，并設(shè)立正常組及假手術(shù)組2 組，每組12 只大鼠。正常組給予常規(guī)飼養(yǎng)；假手術(shù)組僅手術(shù)，不注射6-OHDA；模型組造模完成后不給予治療；電針組給予電針治療；左旋多巴藥物組給予口服左旋多巴治療。

1.2.2 動物模型建立

采用右側(cè)偏側(cè)帕金森模型，造模前用0.3%戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，待大鼠角膜反射消失后，將大鼠固定于立體定位儀上。在無菌環(huán)境中沿正中矢狀線切開大鼠顱頂部皮膚，剝離皮下組織及骨膜，暴露前囟、人字縫，按Pellegrino LJ[2]等編著的大鼠腦立體定位圖譜確定右側(cè)黑質(zhì)兩注射點(diǎn)位坐標(biāo)：第1 點(diǎn)為前囟后3.0mm，正中線右側(cè)2.5mm，硬腦膜腹側(cè)8.6mm；第2 點(diǎn)為前囟后2.4mm，正中線右側(cè)2.7mm，硬腦膜腹側(cè)8.6mm。以鼠顱骨鉆按上述坐標(biāo)鉆直徑為5mm 的孔。用10μL 微量進(jìn)樣器以1μL/min 速度向嘴側(cè)注射4μL 6-OHDA、向尾側(cè)注射3μL 6-OHDA，每次注射完成后留針10min，然后以1.0mm/min 的速度緩慢退針，再用明膠海綿填塞顱骨孔，對切開進(jìn)行縫合。造模完成后2 周腹腔注射APO 誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為（向健側(cè)旋轉(zhuǎn)），注射10min 后開始記錄，共記錄30min，旋轉(zhuǎn)速度達(dá)到6 轉(zhuǎn)/min 視為模型制備成功[3]。

1.2.3 治療方法

電針組大鼠給予電針治療。在右側(cè)舞蹈震顫區(qū)上點(diǎn)與下點(diǎn)采用0.25mm×25mm 毫針進(jìn)行針刺，連接KWD-808 Ⅱ型全能脈沖電療儀，電針波形選擇疏密波（頻率為1Hz），調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度至頭部皮膚輕微顫動，每次治療30min，每日治療1 次，共治療20 天。左旋多巴藥物組給予左旋多巴1.0mg 灌胃給藥，每日治療1 次，共治療20 天。

1.2.4 標(biāo)本制備

治療結(jié)束后用0.3%戊巴比妥鈉（10mL/kg）進(jìn)行腹腔麻醉，灌注固定后，每組選取6 只大鼠取腦內(nèi)黑質(zhì)置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋備用；余大鼠取腦內(nèi)黑質(zhì)及紋狀體置于戊二醛中固定備用。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 病理形態(tài)學(xué)

透射電鏡下觀察大鼠黑質(zhì)、紋狀體組織結(jié)構(gòu)變化。

1.3.2 TUNEL 檢測

利用TUNEL 檢測法觀察各組大鼠黑質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。具體操作：切片置于二甲苯溶液中5min×2 次；再水化處理；蛋白酶K 培育30min；PBS 沖洗5min×2 次；平衡緩沖液37℃保濕盒培育2h；PBS 沖洗5min×2 次；封閉；鏈霉親和素HRP 培育30min；PBS 沖洗5min×2 次；DAB 顯色，鏡檢。利用圖像分析軟件測定各組大鼠黑質(zhì)陽性細(xì)胞數(shù)目的平均光密度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析處理采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示所有數(shù)據(jù)，分析不同組采用單因素方差，采用t 檢驗組間比較，P＜0.05 有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)論

2.1 透射電鏡觀察結(jié)果

正常組、假手術(shù)組大鼠黑質(zhì)及紋狀體神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，胞體飽滿，核仁明顯，胞質(zhì)內(nèi)可見粗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器；模型組大鼠黑質(zhì)及紋狀體神經(jīng)細(xì)胞胞體皺縮，可見粗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，溶酶體增多，線粒體腫脹；電針組、左旋多巴藥物組大鼠黑質(zhì)及紋狀體神經(jīng)細(xì)胞胞體略縮小，粗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，偶見線粒體結(jié)構(gòu)被破壞。

2.2 各組大鼠黑質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

TUNEL 檢測中，凋亡細(xì)胞核染色呈棕黃色或棕褐色，正常細(xì)胞核為藍(lán)色。實(shí)驗結(jié)果顯示：與正常組、假手術(shù)組相比較，模型組、電針組、左旋多巴藥物組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯升高；與模型組相比較，電針組和左旋多巴藥物組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著下降，電針組和左旋多巴藥物組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異。見表1。

表1 各組大鼠黑質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的平均光密度（IOD/AREA）

3 討論

中國人口老齡化不斷加重，致使震顫麻痹的發(fā)病率也在逐年上升。震顫麻痹不僅給患病者帶來了巨大的痛苦，也給患病者的家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此尋求一種簡便、有效的治療方法刻不容緩。祖國醫(yī)學(xué)歷史悠久，針灸在治療疾病方面有其獨(dú)有的優(yōu)勢。針灸不僅臨床療效顯著，而且還具有操作簡便、毒副作用小等特點(diǎn)。電針治療更是在毫針針刺的基礎(chǔ)之上，通過施以微量的電流起到治療疾病的效果。研究表明，電針波形中的疏密波能夠促進(jìn)血液循環(huán)，促進(jìn)組織代謝，改善機(jī)體營養(yǎng)，抑制細(xì)胞凋亡。因此，本研究采用電針治療震顫麻痹，觀察電針對震顫麻痹大鼠腦組織的影響，探究電針治療震顫麻痹的作用機(jī)制。

目前，震顫麻痹的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。大量實(shí)驗研究表明，震顫麻痹與多巴胺能神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)[4]。細(xì)胞凋亡屬于機(jī)體的一種程序性死亡，這種死亡模式不僅受基因的支配，同時也因外界不良刺激而啟動。細(xì)胞凋亡可由自由基、炎性因子、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等外界刺激誘發(fā)進(jìn)行，而震顫麻痹在發(fā)病過程中均會引起上述病理改變。本實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)，與正常組、假手術(shù)組相比較，模型組、電針組、左旋多巴藥物組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比較，電針組和左旋多巴藥物組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著下降（P＜0.05），說明電針能夠通過抑制細(xì)胞凋亡對震顫麻痹大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元起保護(hù)作用，這可能是電針治療震顫麻痹的作用機(jī)制之一。且電針組與左旋多巴藥物組相比較，對上述二者的影響不具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明電針治療與藥物治療的療效接近。且相比應(yīng)用藥物治療，電針治療不存在耐藥性及毒性等問題。電針治療震顫麻痹不僅具有較好的臨床療效，更有動物實(shí)驗研究作為其臨床應(yīng)用的佐證，具有良好的應(yīng)用前景。