TGF-β1 基因多態(tài)性與寧夏回、漢人群慢性牙周炎相關關系的研究

田雯，蘇文，龔娟，眭佳麗，李睿敏，董文亮）

（寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院，寧夏 銀川）

0 引言

牙周炎是常見的多發(fā)于牙周的慢性炎癥性疾病，其病灶在牙周支持組織上的牙齦病和牙周炎兩大類疾病。我們把造成牙周病的始動因子歸結為牙菌斑，但在臨床研究中發(fā)現(xiàn)因個體不同因此牙菌斑又具有一定的差異性，[1]根據(jù)目前遺傳學現(xiàn)狀Michalowicz等利用經(jīng)典雙生子法巧妙地揭示了遺傳因素影響牙周炎病程的重要程度[2]。轉化生長因子-β1(TGF-β1)可由機體內多種細胞產(chǎn)生，存在于所有組織中，但在不同組織中含量大有不同，尤其在骨組織中含量居高，在炎癥反應、組織修復、免疫應答等方面發(fā)揮著極其重要的作用[3]，它的多種作用與牙周炎的發(fā)生發(fā)展有關。在臨床研究中不難發(fā)現(xiàn)漢族比回族人群CP 的患病率及病變程度要明顯要高出很多[4]。本研究旨在探對TGF-β1-509 和TGF-β1+869位點的基因多態(tài)性與寧夏地區(qū)回、漢族人群CP 有無相關性，和差異性。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

病例組：選取我院接受治療的288 例經(jīng)牙周炎患者作為研究對象，根據(jù)診斷標準[5]全部診斷確診為CP 患者，所有患者均來自于寧夏地區(qū)，其中回族143 例（女60 例，男83 例）；漢族145 例（女61 例，男84 例）；健康對照組298 例為本地健康志愿者，回族150例（女71 例，男89 例）；漢族148 例（男79 例，女69 例）；兩組年齡均在30-75 歲之間，且均知情同意并簽署知情同意書。

納入標準：①家庭三代內未與其他民族通婚的寧夏本地回族或漢族；②全口牙數(shù)目＞14 顆；對照組則符合健康牙周的標準、病例組確診為CP 患者的；③無局部刺激因素和明顯的錯牙和畸形；④半年內未接受任何牙周治療；⑤無吸煙史或戒煙超過5 年以上。

排除標準：①牙頜或其他類型牙周損害；②身體其他部位嚴重感染；③心腦血管病、血液病及糖尿病等全身系統(tǒng)性疾?。虎軔盒阅[瘤。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑和儀器

Tag DNA 聚合酶、蛋白酶K（北京天根生物）、血液基因組DNA 提取試劑盒； Trans DNA Marker I（北京全式金生物技術）； Gel Doc XR 全自動凝膠圖像分析儀（BIO-RAD，美國）；Ecol81 Ⅰ內切酶、MspA1 Ⅰ內切酶；T100PCR 儀、 Powerb 基礎型電泳儀、引物由北京三博遠志生物工程技術有限公司合成（表1）；Allegra21R 低溫高速離心機（Eppendorf，德國）、H·SWX-600BS電熱恒溫水浴箱（上海電子儀器）。

1.2.2 基因組DNA 提取

抽取參加試驗的全部受試者外周靜脈血5mL，進行EDTA 抗凝，之后置于恒溫-20°C 的溫度下保存?zhèn)溆?。待血液處理完成之后進行血液基因組DNA 提取。

1.2.3 引物的設計與合成

運用primer 5.0 軟件設計兩個位點的引物。即在Genewindow網(wǎng)站里將TGF-β1 基因多態(tài)位點rs1800469 和rs1982073 的DNA序列調出。

1.2.4 PCR 擴增

TGF-β1 基因-509 和+869 位點目的基因的PCR 反應體系：25mM MgCl21.5μl，dNTP2.5μl (2mmol/L)，10×buffer2.5μl，上下游引物各1μl (10pmol/μl)，Taq DNA 聚合酶0.25μl，模板DNA1μl，加無菌去離子水至25μl，混勻后進入PCR 循環(huán)。擴增反應條件：95℃預變性5 分鐘；以下循環(huán)35 次(具體條件見表1)：退火、延伸、變性；72℃總延伸5 分鐘，4℃保存。

1.2.5 基因型分析

運用RFLP（限制性內切酶片段長度多態(tài)性）方法對受試者TGF-β1-509 和+869 位點基因多態(tài)性的基因型[6-7]進行檢測。限制性酶切反應體系：RE 10×buffer 1.0μl，限制性內切酶1.0μl，PCR 產(chǎn)物5.0μl，無菌去離子水加至10μl，混勻后采取37℃水浴酶切過夜；用儀器精準取10μl 酶切產(chǎn)物，待取出后在經(jīng)2% 瓊脂糖凝膠電泳/溴化乙錠（EB）染色后，確保提取物無任何污染后置于紫外線凝膠分析系統(tǒng)下，記錄結果并分析其基因型（表1）。

1.2.6 PCR 和酶切質量控制措施

①在全部受測樣品中隨機抽取10%的樣本，將取出的樣本運用盲法對其基因型進行重復檢測，以保證試驗中檢測PCR 產(chǎn)物及酶切結果的可靠性。②每次做酶切和PCR 時，在取樣檢測之前設置3-5 個陽性結果作為對照。③評價引物的特異性：在UCSC 數(shù)據(jù)庫中，將引物進行電子PCR 擴增，且與Genebank 中的數(shù)據(jù)進行對比。④隨機選擇10% 的標本進行PCR 擴增后直接測序，以驗證酶切所得的基因型數(shù)據(jù)結果的準確性。⑤測定所有DNA 標本其基因型時均運用盲法完成；操作者對樣本的分組情況和樣本的臨床資料一無所知。

1.3 統(tǒng)計分析

所選對照人群的基因分型數(shù)據(jù)符合Hardy-Weinberg 平衡，才能進行多態(tài)性位點的相關性分析。反之將不能進行分析研究。本研究用H-W 平衡檢測法來進行各基因多態(tài)性位點的基因頻率分布檢測，經(jīng)χ2檢驗確定差異無統(tǒng)計學意義。結論表明所選對照人群數(shù)據(jù)符合H-W 平衡檢測。在對照組和病例組進行對比時，對比研究對象的一般性資料（性別和年齡）時采用χ2檢驗方法，在進行處理數(shù)據(jù)時采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件，以及兩組中基因型與等位基因頻率的分布，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 研究對象的基本情況

對回族和漢族的對照組和病例組的年齡及性別分別進行χ2檢驗，結果無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(見表2)。

2.2 基因型分型結果

樣本基因組DNA 提取、設計引物進行擴增，其PCR 產(chǎn)物分別為418bp 和219bp 的片段，酶切也獲得成功，PCR-RFLP 與測序結果基因分型結果一致，測試結果分別用4 張圖解釋說明，基因型測定的電泳結果分別見圖1、圖2；測序結果見圖3、圖4。

2.3 基因多態(tài)性分析結果

2.3.1 TGF-β1-509（rs1800469）位點

漢族和回族的健康對照組和病例組基因型和等位基因頻率的分布情況分別見表3，表4。漢族中兩組樣本檢測數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學分析，對比結果均有顯著性差異(χ2=17.896，P＜0.01；χ2=15.716，P＜0.01)。回族兩組經(jīng)統(tǒng)計學分析結果：兩組等位基因頻率的分布差異無顯著性(χ2=0.661，P=0.416)；但基因型的分布差異有顯著性(χ2=7.078，P=0.029)。漢族與回族兩組病例組的基因型和等位基因頻率的分布情況見表5，對比結果有顯著性差異(χ2=6.894，P=0.032；χ2=4.313，P=0.038)。

2.3.2 TGF-β1+869（rs1982073）位點

漢族TGF-β1+869 基因型及等位基因頻率的分布見表6，回族TGF-β1+869 基因型及等位基因頻率的分布詳見表7。圖表6中的數(shù)據(jù)為：χ2=0.585，P=0.746；χ2=0.075，P=0.784，經(jīng)統(tǒng)計學分析結果為漢族兩組差異均無統(tǒng)計學意義；回族兩組差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.659，P=0.719；χ2=0.538，P=0.463)?；刈迮c漢族病例組TGF-β1+869 基因型及等位基因頻率的分布見8，兩組亦無顯著性差異(χ23.234，P=0.199；χ2=2.752，P=0.097)。

表2 各組研究對象年齡和性別的比較

圖1 TGF-β1–509（rs1800469）基因分型結果 圖2 TGF-β1+869（rs1982073）位點基因分型結果

圖3 TGF-β1–509（rs1800469）位點測序結果

圖4 TGF-β1+869（rs1982073）位點測序結果

表3 漢族TGF-β1-509 基因型及等位基因的分布

表4 回族TGF-β1-509 位點基因型及等位基因的分布

表5 TGF-β1-509 基因型及等位基因在漢族和回族病例組中的分布

表6 漢族TGF-β1+869 基因型及等位基因頻率的分布

表7 回族TGF-β1+869 基因型及等位基因頻率的分布

表8 回族與漢族病例組TGF-β1+869 基因型及等位基因頻率的分布

3 討論

目前世界公認的主要的兩大類口腔疾病之一的牙周病，患病率較高，在我國更是居于齲病之上，嚴重影響人體健康[8]。在對此病病因的研究中，研究者認識到牙周病是由自身免疫、遺傳易感性及環(huán)境、微生物等因素相互作用的復雜病因。有研究表明，細胞因子具有多種作用，一系列的研究數(shù)據(jù)表明其不僅可以調節(jié)細胞的生長和分化，還可以始發(fā)和維持免疫炎癥反應。轉化生長因子β，在淋巴細胞、巨噬細胞、肥大細胞、中性多核白細和炎性牙周組織中均可產(chǎn)生，是由白細胞產(chǎn)生的重要抗炎信號轉化而來的。

TGF-β1 與牙周炎整個病理過程關系密切：首先，可以促進牙周膜細胞的增殖和分化[9]，調節(jié)牙周膜組織再生的前體細胞；其次，抑制破骨細胞的形成和活化，促進成骨細胞的增殖及細胞外基質的合成，誘導牙槽骨再生；然后，在牙周炎的免疫應答中起雙向調節(jié)作用[10]。

對87 例來自東南亞地區(qū)的高加索人的TGF-β1-509 位點基因多態(tài)性研究，國外學者De Souza AP 等人的調查研究結果顯示中、重度CP 患者和健康人三者之間等位基因和基因型分布存在明顯差異，提示T 等位基因可能是CP 的易感基因[11]。但Holla LI等學者對198 例捷克高加索人的TGF-β1 基因-988C/A、-800G/A、-509C/T、+869T/C、+915G/C 位點的多態(tài)性進行研究，其中CP患者90 例和健康對照者108 例，結果發(fā)現(xiàn)在兩組中的對比結果差別不大，不具備統(tǒng)計學意義，研究還提示TGF-β1-509 位點基因多態(tài)性與CP 無相關性[12]。相比于國外學者對國外人員的研究結論，我國學者管澤民在對河南漢族人群做了同種研究之后得出結論TGF-β1-509 位點基因多態(tài)性與CP 具有相關關系[13]。

本研究顯示，等位基因C 在回族人群病例組和對照組分布頻率前者略高于后者，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.416）；但兩組在基因型分布上有統(tǒng)計學差異（P=0.029）。漢族人群病例組和對照組在基因型分布上的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），等位基因C在CP 組中的分布頻率高于對照組，因此提示差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。對兩民族CP 組進行比較，兩組等位基因頻率和基因型的分布差異有統(tǒng)計學意義（P 值分別為0.032 和0.038）。說明寧夏地區(qū)回族、漢族人群牙周炎的易感性與TGF-β1 基因-509 位點多態(tài)性可能有相關關系，并且該位點多態(tài)性在寧夏地區(qū)回、漢兩族CP 患者之間的差異有統(tǒng)計學意義。這與Holla LI 等學者對捷克高加索人的該位點基因多態(tài)性研究，得出的該位點基因型和等位基因頻率分布與CP 患者無相關性的結果有差異，而與管澤民等對河南漢族人群研究，該位點基因多態(tài)性與CP 具有相關性的結果一致。目前我們針對這一研究結果不一致的原因歸納為幾點：首先，不同的種族，種族間的生活習慣差異和生活壞境可能會導致結果不同，且可能差異顯著。其次，在取樣過程中，樣本量不足，樣本量大小差異都可以直接導致研究結果發(fā)生偏倚。因此為了確保研究結果數(shù)據(jù)的準且性，就要求所取樣本屬同地區(qū)生活，同種族，同大小且足夠的樣本量。

目前，臨床上比較缺乏對牙周炎受TGF-β1 外顯子區(qū)+869 位點的基因多態(tài)性影響的研究，國外學者Kobayashi T 等對117 例日本牙周炎患者進行細胞因子基因多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)TGF-β1+869位點與牙周炎無相關性[14]。Atilla G 等對土耳其的134 例CP 患者的TGF-β1 外顯子區(qū)的+915 位點基因多態(tài)性進行研究，發(fā)現(xiàn)此位點基因多態(tài)性與CP 具有相關性[15]。李新華等根據(jù)人群種族分類對亞洲人和高加索人群的分層分析，得出結論在亞洲人群中TGF-β1+869 位點是導致類風濕性關節(jié)炎的危險因素，在高加索等歐美人群并未發(fā)現(xiàn)此結果，導致以上兩種結論的原因可能與種族人群的飲食習慣、生活方式及遺傳因素有關[16]。

上述與TGF-β1+869 位點相關的疾病都屬于自身免疫性疾病，如：類風濕性關節(jié)炎、其他慢性炎癥性疾病，尚未見其與CP 的相關報道，針對CP 這種慢性炎癥性疾病，本研究對中國寧夏地區(qū)的CP 患者和該位點多態(tài)性做了相關性研究。研究發(fā)現(xiàn)該位點存在3 種基因型CC、CT 和TT，兩種等位基因（C 和T），兩族人群的基因型和等位基因在CP 組和對照組間分布差異均無統(tǒng)計學意義（前者P 值分別為0.719 和P=0.746）；（后者P 值分別為0.463 和P=0.784）。該位點基因型和等位基因在回漢兩族的CP 組中的分布差異均無統(tǒng)計學意義（P 值分別為0.199 和0.097）。因此得出結論：寧夏回、漢兩族地區(qū)人群的CP 易感性與TGF-β1+869 位點基因多態(tài)性可能不相關。

綜上所述，不同地域、不同種族的不同人群中各種基因的等位基因頻率和基因型有差異性，并且牙周炎是不同種族或民族人群所接觸的環(huán)境誘導因素以及所攜帶的易感基因等多因素、多基因相關性疾病，不僅對探討研究該疾病的發(fā)生、發(fā)展機制有著極其重要的意義，而且還能從基因水平尋找有效的診斷方法和合理的治療措施。我們需要在不同地區(qū)、不同的種族之間采取大量樣本量，以便進一步探尋轉化生長因子β1 基因多態(tài)性與之間的相關關系，并且進行一系列綜合性的研究，以此來揭示TGF-βl 基因多態(tài)性對牙周炎易感性產(chǎn)生的影響。