甲狀腺癌中miR-222關(guān)鍵靶基因預(yù)測(cè)及其信號(hào)通路分析

黃琪峰 鄭琳琳 張菁

摘要：目的? 利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)人類miR-222的靶基因，并分析其可能參與甲狀腺癌的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路。方法? 通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)研究miR-222的表達(dá)與甲狀腺癌的關(guān)系，然后TCGA中表達(dá)下調(diào)的基因和網(wǎng)站預(yù)測(cè)的miR-222靶基因進(jìn)行取交集得到重疊基因，再進(jìn)行生物信息學(xué)分析確定與甲狀腺癌相關(guān)的關(guān)鍵miR-222靶基因和通路，最后通過(guò)GEPIA對(duì)靶基因進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證以及miR-222和靶基因的相關(guān)性分析。結(jié)果? miR-222在甲狀腺癌中表達(dá)上調(diào)，富集分析表明miR-222很有可能參與血管緊張素受體-配體結(jié)合的調(diào)節(jié)，其中一個(gè)可能的靶基因是AGTR1，其在甲狀腺癌中表達(dá)下調(diào)，與miR-222的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論? 上調(diào)的miR-222可能以AGTR1為靶標(biāo)，從而調(diào)節(jié)甲狀腺癌中血管緊張素受體-配體結(jié)合發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：甲狀腺癌;miR-222;AGTR1;生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)：R736.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.01.026

文章編號(hào)：1006-1959（2020）01-0085-04

Prediction of Key Target Genes of miR-222 in Thyroid Cancer and Analysis of Its Signal Pathway

HUANG Qi-feng1，ZHENG Lin-lin2，ZHANG Jing1

（Department of Pharmacy1，Department of Ultrasound2，Run Run Shaw Hospital，Zhejiang University School of Medicine，

Hangzhou 310016，Zhejiang，China）

Abstract：Objective? To predict the target genes of human miR-222 using bioinformatics technology， and analyze the biological processes and signal pathways that miR-222 may participate in. Methods? TCGA database was used to study the relationship between miR-222 expression and thyroid cancer， then the genes with down-regulated expression in TCGA and miR-222 target genes predicted by the website were intersected to obtain overlapping genes， and bioinformatics analysis was performed to determine the correlation with thyroid cancer the key miR-222 target genes and pathways， and finally the target genes were verified by GEPIA and the correlation analysis between miR-222 and target genes. Results? miR-222 expression was significantly up-regulated in thyroid cancer. Enrichment analysis showed that miR-222 is likely to be involved in the regulation of angiotensin receptor-ligand binding. One of the possible target genes is AGTR1， which is expressed in thyroid cancer.Down-regulation was significantly negatively correlated with miR-222 expression.Conclusion? The up-regulated miR-222 is likely to target AGTR1， which may play a role in regulating angiotensin receptor-ligand binding in thyroid cancer.

Key words：Thyroid cancer;miR-222;AGTR1;Bioinformatics

甲狀腺癌（thyroid cancer）是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌性惡性腫瘤，發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康[1]。甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展受多種調(diào)控因子共同作用，其具體機(jī)制目前尚不明確，因此確定其具體的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)敏感的生物標(biāo)志物和創(chuàng)新治療方法來(lái)提高甲狀腺癌的臨床診斷和治療水平是緊迫且具有挑戰(zhàn)性的課題。微小RNA（miRNA）是一類含量豐富的非編碼RNA分子，大小為15～21個(gè)核苷酸，它通過(guò)與目標(biāo)基因的3'非翻譯區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合從而使目標(biāo)基因沉默。miRNA已經(jīng)被證實(shí)對(duì)廣泛的生物過(guò)程具有調(diào)節(jié)作用，如細(xì)胞增殖、凋亡、分化和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)[2，3]。miRNA使癌癥在臨床診斷和治療中取得了較大進(jìn)展[4，5]。研究表明[6]，miR-222在甲狀腺癌中表達(dá)明顯高于正常組織，提示其可能在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，因此探索其在甲狀腺癌發(fā)病中的分子機(jī)制具有重要的意義。本研究利用生物信息學(xué)的方法來(lái)預(yù)測(cè)miR-222在甲狀腺癌中的目標(biāo)基因及其參與的信號(hào)通路，旨在闡明甲狀腺癌的潛在生物標(biāo)志物，為進(jìn)一步深入研究其生物功能及臨床治療甲狀腺癌提供線索。

1資料與方法

1.1資料來(lái)源? 從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cancergenome.nih.gov/）下載510例甲狀腺癌和58例癌旁組織的mRNA-seq數(shù)據(jù)和miRNA-seq數(shù)據(jù)，并取Log2將其表達(dá)值標(biāo)準(zhǔn)化。從miRWalk（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）數(shù)據(jù)庫(kù)[7]下載人類miR-222可能的靶基因數(shù)據(jù)。

1.2方法

1.2.1 miR-222表達(dá)? 選取miR-222在甲狀腺癌及其癌旁組織的表達(dá)數(shù)據(jù)，利用GraphPad Prism7繪制其在癌組織和正常組織的表達(dá)圖。

1.2.2 miRNA的差異表達(dá)? 利用計(jì)算機(jī)R軟件中edgeR包篩選出510例癌癥組織與58例癌旁組織相比表達(dá)下調(diào)的基因，篩選條件為：Log2|差異倍數(shù)（FC）|<-0.5489，F(xiàn)DR<0.05。為了更好更準(zhǔn)確的識(shí)別miR-222的目標(biāo)基因，對(duì)miRWalk網(wǎng)站預(yù)測(cè)的基因與表達(dá)下調(diào)的基因取交集，然后根據(jù)這些重疊基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析來(lái)探索miR-222在甲狀腺癌中潛在分子機(jī)制。

1.2.3基因富集分析? 利用DAVID[8]（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）對(duì)重疊基因進(jìn)行功能注釋，包括分子功能、細(xì)胞組成與生物過(guò)程的GO功能富集分析及KEGG通路富集分析。

1.2.4重疊基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)? 通過(guò)在線分析網(wǎng)站STRING[9]（https：//string-db.org/）得到差異表達(dá)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，將所得源文件導(dǎo)入Cytoscape[10]進(jìn)行可視化分析，然后使用MCODE插件查找蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中連接最密集的區(qū)域。

1.2.5 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析目標(biāo)基因表達(dá)? 通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)[11]（http：//gepia.cancer-pku.cn/）驗(yàn)證目標(biāo)基因在癌癥組織與癌旁組織的基因表達(dá)差異，并利用GraphPad Prism7繪制目標(biāo)基因的表達(dá)量與miR-222的相關(guān)性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析? 標(biāo)準(zhǔn)化后的mRNA和miRNA表達(dá)呈正態(tài)分布，采用非配對(duì)t檢驗(yàn)其在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異，采用Pearson相關(guān)性分析目標(biāo)基因與miR-222的表達(dá)相關(guān)性。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在篩選差異表達(dá)基因和對(duì)重疊基因富集分析時(shí)用Benjamini-Hochberg方法校正P值（FDR）。

2結(jié)果

2.1甲狀腺癌組織和癌旁組織中miR-222表達(dá)比較? 從TCGA下載得到的miR-222在甲狀腺癌中和癌旁組織的表達(dá)，miR-222在甲狀腺癌中表達(dá)高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 miR-222的目標(biāo)基因? 通過(guò)TCGA中基因的差異表達(dá)分析和miRWalk靶基因預(yù)測(cè)平臺(tái)可以篩選出miR-136-5p可能的靶基因。其中TCGA中甲狀腺癌共有801個(gè)差異表達(dá)基因，miRNA-222在甲狀腺癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，選擇342個(gè)下調(diào)基因，miRWalk網(wǎng)站預(yù)測(cè)的目標(biāo)基因有16912個(gè)，兩者重疊得到279個(gè)miR-222可能的目標(biāo)基因。

2.3重疊基因的生物信息學(xué)分析

2.3.1 GO和KEGG 富集分析? GO分析表明重疊目標(biāo)基因的生物學(xué)過(guò)程主要富集在離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、消化、化學(xué)性突觸傳遞、質(zhì)膜的組成成分、細(xì)胞連接、突觸、細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜等生物學(xué)過(guò)程和功能中，KEGG富集分析顯示重疊目標(biāo)基因的信號(hào)通路主要為神經(jīng)活性配體-受體相互作用，見(jiàn)表1。

2.3.2 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和目標(biāo)基因分析? 根據(jù)重疊基因構(gòu)建得到一個(gè)包含279個(gè)節(jié)點(diǎn)、527條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，利用MCODE插件在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中查找連接最密集的區(qū)域得到12個(gè)可能的目標(biāo)基因，分別為SST、AGTR2、CHRM2、PENK、NPY2R、NPY5R、AGTR1、HTR1E、CCKBR、CCKAR、MLN、GCG，見(jiàn)圖2。

2.4目標(biāo)基因的驗(yàn)證

2.4.1目標(biāo)基因在甲狀腺癌中的表達(dá)? 共查找到12個(gè)目標(biāo)基因在甲狀腺癌中的表達(dá)，由于miR-222在甲狀腺癌中表達(dá)量比癌旁組織高，其目標(biāo)基因應(yīng)在甲狀腺癌中表達(dá)下調(diào)，最終篩選出AGTR1，見(jiàn)圖3。

2.4.2目標(biāo)基因AGTR1與miR-222的Pearson相關(guān)分析? Pearson相關(guān)分析表明，目標(biāo)基因AGTR1的表達(dá)與miR-222的表達(dá)在甲狀腺癌患者中呈負(fù)相關(guān)（r=-0.435，P=1.1293E-27），見(jiàn)圖4。

3討論

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，約30%以上的人類蛋白編碼基因受miRNA的調(diào)控[12]。越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA可以通過(guò)調(diào)控下游靶基因的表達(dá)來(lái)參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡等細(xì)胞活動(dòng)，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移[2，3]以及治療等方面發(fā)揮重要作用。但目前已明確的miRNA的靶基因數(shù)量有限，且生物學(xué)功能尚未完全明確[13]。因此，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miRNA 的靶基因，對(duì)其靶基因進(jìn)行生物功能富集分析和信號(hào)通路富集分析，有助于確定miRNA的研究方向，具有重要指導(dǎo)意義。

研究報(bào)道，miR-222在甲狀腺惡性腫瘤診斷上具有較高的敏感性[14]，且miR-222的過(guò)度表達(dá)與甲狀腺癌復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等一些高風(fēng)險(xiǎn)特征相關(guān)，miR-222可以作為甲狀腺癌潛在的靶點(diǎn)[15-17]。

本研究中，通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中miRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)miR-222在甲狀腺癌中的表達(dá)高于癌旁組織。GO富集分析顯示，miR-222的目標(biāo)基因的生物學(xué)過(guò)程主要富集在離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、消化、化學(xué)性突觸傳遞、質(zhì)膜的組成成分、細(xì)胞連接、突觸、細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜等生物學(xué)過(guò)程和功能中。KEGG 信號(hào)通路分析結(jié)果顯示，miR-222靶基因主要富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用等信號(hào)通路上?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，miR-222很有可能參與受體-配體結(jié)合的調(diào)節(jié)。同時(shí)，通過(guò)目標(biāo)基因在甲狀腺癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異篩選得到目標(biāo)基因AGTR1，發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌中與miR-222的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.435，P=1.1293E-27）。AGTR1是血管緊張素Ⅱ的Ⅰ型受體，是調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)的受體。研究表明，AGTR1與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)，AGTR1參與多種類型的惡性腫瘤，比如乳腺癌[18]、皮膚癌[19]、前列腺癌[20]、婦科腫瘤[21]等。因此，miR-222可能是以AGTR1為靶點(diǎn)，通過(guò)調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)，從而參與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。但這只是預(yù)測(cè)，未來(lái)需要更多的研究去證實(shí)。

綜上所述，本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-222在甲狀腺癌中表達(dá)上升，預(yù)測(cè)其靶基因可能是AGTR1，并可能通過(guò)血管緊張素配體-受體結(jié)合信號(hào)通路中調(diào)節(jié)甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1]Konturek A，Barczyński M，Stopa M，et al.Trends in Prevalence of Thyroid Cancer Over Three Decades： A Retrospective Cohort Study of 17，526 Surgical Patients[J].World J Surg，2016，40（3）：538-544.

[2]Shukla KK，Misra S，Pareek P，et al.Recent scenario of microRNA as diagnostic and prognostic biomarkers of prostate cancer[J].Urol Oncol，2017，35（3）：92-101.

[3]Dluzen DF，Sun D，Salzberg AC，et al.Regulation of UDP-glucuronosyltransferase 1A1 expression and activity by microRNA 491-3p[J].J Pharmacol Exp Ther，2014，348（3）：465-477.

[4]Ganju A，Khan S，Hafeez BB，et al.miRNA nanotherapeutics for cancer[J].Drug Discov Today，2017，22（2）：424-432.

[5] Xue J，Yang J，Luo M，et al.MicroRNA-targeted therapeutics for lung cancer treatment[J].Expert Opin Drug Discov，2017，12（2）：141-157.

[6]陳英.miR-221與miR-222在甲狀腺癌中的表達(dá)及臨床意義[D].河北醫(yī)科大學(xué)，2017.

[7]Sticht C，De La Torre C，Parveen A，et al.miRWalk： An online resource for prediction of microRNA binding sites[J].PLoS One，2018，13（10）：13（10）：e0206239.

[8]Huang da W，Sherman BT，Lempicki RA.Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources[J].Nat Protoc，2009，4（1）：44-57.

[9]Szklarczyk D，Gable AL，Lyon D，et al.STRING v11： protein-protein association networks with increased coverage， supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets[J].Nucleic Acids Res，2019，47（D1）：D607-D613.

[10]Shannon P，Markiel A，Ozier O，et al.Cytoscape： a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks[J].Genome Res，2003，13（11）：2498-2504.

[11]Tang Z，Li C，Kang B，et al.GEPIA： a web server for cancer and normal gene expression profiling and interactive analyses[J].Nucleic Acids Res，2017，45（W1）：W98-W102.

[12]劉曙光，韓京軍，馬紅梅，等.人類miR-22靶基因生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及功能分析[J].廣西醫(yī)學(xué)，2015，37（7）：891-894.

[13]Bartel DP.MicroRNAs： genomics， biogenesis， mechanism， and function[J].Cell，2004，116（2）：281-297.

[14]He H，Jazdzewski K，Li W，et al.The role of microRNA genes in papillary thyroid carcinoma[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（52）：19075-19080.

[15]Keutgen XM，F(xiàn)ilicori F，Crowley MJ，et al.A panel of four miRNAs accurately differentiates malignant from benign indeterminate thyroid lesions on fine needle aspiration[J].Clin Cancer Res，2012，18（7）：2032-2038.

[16]Lee JC，Zhao JT，Clifton-Bligh RJ，et al.MicroRNA-222 and microRNA-146b are tissue and circulating biomarkers of recurrent papillary thyroid cancer[J].Cancer，2013，119（24）：4358-4365.

[17]Xiang D，Tian B，Yang T，et al.miR-222 expression is correlated with the ATA risk stratifications in papillary thyroid carcinomas[J].Medicine （Baltimore），2019，98（25）：e16050.

[18]Ekambaram P，Lee JL，Hubel NE，et al.The CARMA3-Bcl10-MALT1 Signalosome Drives NFkappaB Activation and Promotes Aggressiveness in AngiotensinⅡReceptor-Positive Breast Cancer[J].Cancer Res，2018，78（5）：1225-1240.

[19]Papaggelopoulos J，Angelopoulou A，Avgoustidis D，et al.Association of Polymorphisms in the Genes of Angiotensinogen and Angiotensin Receptors With Risk for Basal Cell Carcinoma[J].Anticancer Res，2019，39（10）：5525-5530.

[20]Uemura H，Ishiguro H，Nakaigawa N，et al.Angiotensin Ⅱ receptor blocker shows antiproliferative activity in prostate cancer cells： a possibility of tyrosine kinase inhibitor of growth factor[J].Mol Cancer Ther，2003，2（11）：1139-1147.

[21]Zhang Q，Yu S，Lam MMT，et al.Angiotensin Ⅱ promotes ovarian cancer spheroid formation and metastasis by upregulation of lipid desaturation and suppression of endoplasmic reticulum stress[J].J Exp Clin Cancer Res，2019，38（1）：116.

收稿日期：2019-10-01;修回日期：2019-10-21

編輯/成森