Nrf2-ARE信號通路在間歇性低氧胰腺組織中的作用及銀杏葉提取物的干預(yù)機(jī)理

肖麗君 周燕 湯宇飛

摘要：目的? 觀察Nrf2-ARE信號通路對慢性間歇性低氧胰腺組織的影響及銀杏葉提取物對其的干預(yù)機(jī)理。方法? 選取C57BL/6雄性小鼠、Nrf2基因敲除型雄性小鼠各54只，隨機(jī)分為常氧對照組1、2，間歇性低氧組1、2，Nrf2激活劑組，抗體阻斷組，銀杏葉提取物（EGB）低、中、高濃度組，每組6只。除常氧對照組外，其余各組小鼠循環(huán)給予氮?dú)夂脱鯕饨㈤g歇性低氧模型。Nrf2激活劑組腹腔注射萊菔硫烷，抗體阻斷組腹腔注射抗Nrf2抗體，EGB低、中、高濃度組分別予EGB50、100、200 mg/（kg·d）灌胃，常氧對照組予等量生理鹽水干預(yù)。干預(yù)10周后用Western-Blot和RT-PCR分別檢測胰腺組織中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS蛋白和mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果? 野生型小鼠中，與間歇性低氧組比較，Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS在Nrf2激活組、EGB高濃度組中蛋白和mRNA表達(dá)均升高，在抗體阻斷組中蛋白和mRNA表達(dá)均降低（P<0.05）;基因敲除型小鼠中，與間歇性低氧組比較，HO-1在Nrf2激活組、EGB高濃度組中蛋白和mRNA表達(dá)均升高（P<0.05）;NQO1在EGB中濃度組中蛋白和mRNA表達(dá)均升高（P<0.05）;γ-GCS在EGB中、高濃度組中蛋白和mRNA表達(dá)均升高（P<0.05）。結(jié)論? 間歇性低氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激參與了OSAS的發(fā)生發(fā)展過程，可能是OSAS胰腺組織損傷的主要病理生理機(jī)制。EGB通過促進(jìn)Nrf2-ARE信號通路介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)，保護(hù)胰腺組織免受間歇性低氧誘導(dǎo)的損傷。

關(guān)鍵詞：銀杏葉提取物;間歇性低氧;Nrf2/ARE信號通路;氧化應(yīng)激;胰腺組織

中圖分類號：R567? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.01.019

文章編號：1006-1959（2020）01-0057-04

Role of Nrf2-ARE Signaling Pathway in Intermittent Hypoxic Pancreatic Tissue and

Intervention Mechanism of Ginkgo Biloba Extract

XIAO Li-jun，ZHOU Yan，TANG Yu-fei

（Department of Respiratory and Critical Care Medicine，the Affiliated Hospital of Guilin Medical College，

Guilin 541001，Guangxi，China）

Abstract：Objective? To observe the effect of Nrf2-ARE signaling pathway on chronic intermittent hypoxic pancreatic tissue and the intervention mechanism of Ginkgo biloba extract. Methods? In that C57BL/6 male mice，54 of the Nrf2 gene knock-out male mice were selected，randomly divided into normoxic control group 1， 2， intermittent hypoxia group 1， 2， Nrf2 activator group， antibody blocking group， Ginkgo biloba extract （EGB） low， medium and high concentration groups， 6 in each group. Except the normoxic control group， the other groups of mice were cyclically given nitrogen and oxygen to establish an intermittent hypoxia model. The Nrf2 activator group was injected intraperitoneally with lymesulfane， and the antibody blocking group was intraperitoneally injected with anti-Nrf2 antibody. The EGB low， medium， and high concentration groups were given intragastrically with EGB50， 100， and 200 mg/（kg·d）. Equal volume of saline intervention. After 10 weeks of intervention， Western-Blot and RT-PCR were used to detect the expression levels of Nrf2， HO-1， NQO1， γ-GCS protein and mRNA in pancreatic tissue， respectively.Results? In wild-type mice， compared with the intermittent hypoxia group， Nrf2， HO-1， NQO1， and γ-GCS were found in the Nrf2 activated group，the protein and mRNA expressions were increased in the EGB high concentration group， and the protein and mRNA expressions were decreased in the antibody blocking group （P<0.05）.In the knockout mice， compared with the intermittent hypoxia group， HO-1 protein and mRNA expression were increased in the Nrf2 activated group and EGB high-concentration group （P<0.05）;The protein and mRNA expressions of NQO1 in the EGB medium concentration group were increased （P<0.05）; the γ-GCS protein and mRNA expression were increased in the EGB medium and high concentration groups （P<0.05）. Conclusion? Oxidative stress caused by intermittent hypoxia is involved in the development of OSAS and may be the main pathophysiological mechanism of OSAS pancreatic tissue injury. EGB protects pancreatic tissue from intermittent hypoxia-induced damage by promoting the antioxidant response mediated by the Nrf2-ARE signaling pathway.

Key words：Ginkgo biloba extract;Intermittent hypoxia;Nrf2/ARE signaling pathway;Oxidative stress;Pancreatic tissue

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）已被證明與胰島素分泌紊亂、胰島素抵抗和2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）有關(guān)。盡管有研究顯示，間歇性低氧（intermittent hypoxia，IH）在OSAS中可能通過氧化應(yīng)激加重胰腺組織的損傷，進(jìn)一步促進(jìn)T2DM的發(fā)生發(fā)展，但其作用機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)[1，2]，Nrf2-ARE信號通路是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，調(diào)控體內(nèi)氧化還原水平，是機(jī)體抵御各種氧化應(yīng)激的重要保護(hù)通路。銀杏葉提取物（extract ginkgo biloba，EGB）是從銀杏葉中分離純化的活性物質(zhì)，含有24%的黃酮苷和6%的萜內(nèi)酯，具有降血壓、改善血液循環(huán)、解除血管痙攣、抗氧化等生物學(xué)活性，是一種有效的抗氧化劑可抑制炎癥和氧化應(yīng)激。本研究旨在探討間歇性缺氧所致胰腺組織損傷的潛在機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上探討EGB 對間歇性低氧所致胰腺損傷中的作用。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物? Nrf2基因敲除型小鼠（Nrf2-/-）（Johns Hopkins University）54只，鼠齡 6～8 周齡，體質(zhì)量（20±2）g。同遺傳背景清潔級C57BL/6雄性野生型（WT）小鼠54只。動物飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動物中心，相對濕度為50%～60%，室溫（24±3）℃，晝夜節(jié)律光照。在實(shí)驗(yàn)過程中喂食標(biāo)準(zhǔn)的鼠糧和飲用水。所有動物實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會批準(zhǔn)，并根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動物的護(hù)理和使用指南》進(jìn)行研究。

1.2主要試劑及儀器? Nrf2（核因子E2相關(guān)因子2）、HO-1（血紅素加氧酶-1）、γ-GCS（γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶）、NQO1（苯醌氧化還原酶1）單克隆抗體（美國abcam公司）;小鼠β-actin抗體、辣根酶標(biāo)記抗鼠IgG二抗、辣根酶標(biāo)記抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）;EGB761（ 金納多，德國 Schwabe 制藥集團(tuán)）;超敏ECL發(fā)光試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：（天根生化科技<北京>有限公司）;全自動低氧動物艙（型號：JXOC-12 型）;低溫高速離心機(jī)5804R型（Eppendorf公司）;紫外分光光度計(jì)（日本 Shimadzu 公司）;CFX96實(shí)時熒光定量PCR儀（美國伯樂公司）。

1.3動物分組、制備慢性間歇性低氧模型及給藥? 健康C57BL/6雄性野生型小鼠、Nrf2基因敲除型雄性小鼠各54 只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為常氧對照組 1、2，間歇性低氧組 1、2，Nrf2 激活劑組，抗 Nrf2 抗體組，EGB低、中、高濃度組，每組6只。所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始制備慢性間歇性低氧模型，除常氧對照組在常氧條件下飼養(yǎng)外，其余各組小鼠置于低氧艙內(nèi)，向艙內(nèi)循環(huán)通入氮?dú)夂脱鯕猓?0 s充入氮?dú)猓棺畹脱鯘舛冗_(dá) 4%～6% ，保持 20 s，隨后20 s充入氧氣，使氧濃度恢復(fù)至21%，保持40 s，8 h/d，其余時間置飼養(yǎng)籠，在空氣、室溫條件下正常飲食，對照組給予空氣常氧對照。造模10周后開始干預(yù)，常氧對照組1及間歇性低氧組1腹腔注射生理鹽水? ?1 ml/d，Nrf2 激活劑組腹腔注射Nrf2激活劑萊菔硫烷5 mg/（kg·d），抗 Nrf2 抗體組腹腔注射抗 Nrf2 抗體。常氧對照組2及間歇性低氧組2以10 mg/（kg·d）生理鹽水灌胃，EGB 低、中、高濃度組分別按50、100、200 mg/（kg·d）的EGB劑量灌胃。

1.4提取小鼠的胰腺組織? 藥物干預(yù)10周末，提取小鼠的胰腺組織。小鼠禁食12 h后稱重，用7%的水合氯醛以0.1 ml/10g的劑量腹腔注射麻醉小鼠，酒精消毒皮膚后打開腹腔，迅速取下整個胰腺組織，并將其分成幾片，用冰生理鹽水漂洗，將這些小的胰腺組織碎片分裝放入1.5 ml的去酶EP管中，一管裝有1 ml RNAhold溶液，4℃過夜，-20℃貯存?zhèn)溆?，另一管迅速放入液氮中速凍?80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.5蛋白質(zhì)印跡分析胰腺組織中Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS的蛋白表達(dá)? 將冷凍的胰腺組織倒入含有液氮的研缽中充分研磨，然后浸入含有1%PMSF的RIPA裂解緩沖液中裂解，并在冰上靜置30 min，在4°C下以12000 r/min離心15 min，收集上層液，并用BCA蛋白測定方法進(jìn)行總蛋白定量，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳90 min，然后將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗膜3次，10 min/次，滴加一抗（1∶1000），4℃緩慢搖動孵育過夜。TBST洗膜3次，10 min/次，然后滴加二抗（1∶5000），室溫下孵育 2 h，TBST洗膜3次，10 min/次。將ECL化學(xué)發(fā)光液與膜孵育3 min，用吸水紙吸凈液體后，用保鮮膜將膜包裹，放入夾板中。在暗室中將X光片，覆蓋在膜的上面，夾好夾子，曝光1 min。顯影、水洗、定影。Image J軟件用于數(shù)據(jù)分析。

1.6實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)? 檢測胰腺組織中Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS的mRNA水平，應(yīng)用TRIzol法提取胰腺組織總mRNA。按照TIANGEN逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，所得cDNA用于后續(xù)實(shí)時熒光定量反應(yīng)。使用Power SYBR Green PCR Master Mix和CFX96實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。將GAPDH用作Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)部對照。引物合成序列如下：GAPDH正向引物：5′-TATGTCGTGGAGTCTACTGGT-3′，反向引物：5′-GAGTTGTCATATTTCTCGTGG-3′;Nrf2正向引物：5′-ACAGTGCTCCTATGCGTGAA-3′，反向引物：5′-TCTGGGCGGCGACTTTAT-3′;HO-1 正向引物：5′-CCCAAAACTGGCCTGTAAAA-3′，反向引物：5′-CGTGGTCAGTCAACATGGAT-3′;NQO1 正向引物：5′-AGGATGGGAGGTACTCGAATC-3′，反向引物：5′-AGGCGTCCTTCCTTATATGCTA-3′;γ-GCS：正向引物：5′-CAGGACAGCCTAGTCTGGGGAA-3′，反向引物：5′-CAGGACAGCCTAGTCTGGGGAA-3′。相對基因表達(dá)采用2-△△Ct的方法顯示，每個PCR反應(yīng)都進(jìn)行3個復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析? 使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以（x±s）表示，行Student t檢驗(yàn)，多組間比較時使用單因素方差分析（ANOVA），非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。使用GraphPad Prism 5.0繪制圖形。

2結(jié)果

2.1各組野生型雄鼠胰腺組織中Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS蛋白表達(dá)情況? 與常氧對照組比較，間歇性低氧組 Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS 表達(dá)降低（P<0.05）;與間歇性低氧組1比較，Nrf2 激活劑組 Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS 表達(dá)升高，抗 Nrf2 抗體組則相反（P<0.05）;與間歇性低氧組2比較，EGB低濃度組γ-GCS 表達(dá)升高（P<0.05），EGB中、高濃度組 Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS 表達(dá)均升高（P<0.05），且EGB高濃度組 Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS 表達(dá)均高于EGB中濃度組（P<0.05），見圖1。

2.2各組Nrf2基因敲除型雄鼠胰腺組織中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS蛋白表達(dá)比較? 間歇性低氧組Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS 表達(dá)與常氧對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與間歇性低氧組1比較，Nrf2 激活劑組 HO-1表達(dá)升高（P<0.05）; EGB低濃度組 Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS表達(dá)與間歇性低氧組2比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;EGB中濃度組NQO1、γ-GCS 表達(dá)升高（P<0.05），EGB高濃度組HO-1、NQO1、γ-GCS 表達(dá)升高（P<0.05），見圖2。

2.3各組野生型雄鼠胰腺組織 Nrf2-ARE 信號通路相關(guān)基因表達(dá)情況? 與常氧對照組比較，間歇性低氧組Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCSmRNA表達(dá)降低（P<0.05）;與間歇性低氧組1比較，Nrf2激活劑組 Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCSmRNA表達(dá)均升高，抗Nrf2抗體組則相反（P<0.05）;與間歇性低氧組2比較，EGB低、中濃度組Nrf2和HO-1mRNA表達(dá)降低，NQO1和γ-GCSmRNA表達(dá)升高（P<0.05）;EGB高濃度組Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCSmRNA表達(dá)升高（P<0.05），見圖3。

2.4各組敲除型雄鼠胰腺組織 Nrf2-ARE 信號通路相關(guān)基因表達(dá)情況? 與常氧對照組比較，間歇性低氧組HO-1mRNA表達(dá)降低（P<0.05）;與間歇性低氧組1比較，Nrf2激活劑組HO-1mRNA表達(dá)升高，抗Nrf2抗體組HO-1mRNA表達(dá)降低（P<0.05）;與間歇性低氧組2比較，EGB低濃度組HO-1和γ-GCS mRNA表達(dá)升高（P<0.05）;EGB中濃度組 NQO1、HO-1和γ-GCS mRNA表達(dá)升高（P<0.05）;EGB高濃度組HO-1和γ-GCS mRNA表達(dá)升高（P<0.05），見圖4。

3討論

OSAS是一種廣泛存在的臨床疾病，在2型糖尿病患者和相關(guān)代謝條件中非常普遍[3]?；诶鄯e的臨床流行病學(xué)證據(jù)，OSAS可影響葡萄糖代謝，誘導(dǎo)胰島素抵抗，促進(jìn)2型糖尿病的發(fā)展[4-6]。有研究顯示[7]，在慢性間歇性低氧模型中，慢性間歇性低氧可導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平升高，出現(xiàn)高胰島素血癥，血糖升高及胰島功能受損，造成胰腺組織損傷，導(dǎo)致糖代謝紊亂，產(chǎn)生胰島素抵抗。此外，研究還發(fā)現(xiàn)OSAS患者的抗氧化能力降低[8]。因此，Nrf2-ARE信號通路是否參與了保護(hù)間歇性低氧所致的胰腺損傷仍尚待闡明。本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究了這種損傷效應(yīng)，并探討了其潛在機(jī)制，結(jié)果表明，間歇性低氧可導(dǎo)致下游蛋白（HO-1，NQO1和γ-GCS）表達(dá)降低，且與Nrf2基因敲除型小鼠比較，間歇性低氧可進(jìn)一步加劇基因敲除型小鼠胰腺組織的損傷，盡可能地減輕這種協(xié)同損傷，具有重要的臨床意義。

銀杏葉提取物可作為一種有效的自由基清除劑，通過增強(qiáng)抗氧化酶活性，減輕活性氧和脂質(zhì)過氧化的過度積累，具有抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用[9]。本研究假設(shè)胰腺組織損傷后EGB的保護(hù)作用是由Nrf2-ARE信號通路介導(dǎo)，為證實(shí)該假設(shè)，本研究在間歇性低氧模型中用不同劑量的EGB測試了Nrf2-ARE信號通路的變化。Western blot和RT-PCR分析表明EGB增強(qiáng)了間歇性低氧后胰腺組織中Nrf2的表達(dá)，并激活了下游蛋白（HO-1，NQO1和γ-GCS），Nrf2-ARE信號通路被激活以在間歇性低氧模型中發(fā)揮保護(hù)作用，并且這些作用是通過抑制氧化應(yīng)激引起的損傷來介導(dǎo)的。因此，得出銀杏葉提取物在間歇性低氧胰腺組織中的保護(hù)作用是通過激活Nrf2-ARE信號通路來介導(dǎo)的結(jié)論。

綜上所述，間歇性低氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是OSAS的主要病理生理機(jī)制，Nrf2-ARE 信號通路能調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激及炎癥因子水平，改善胰島功能，減輕胰腺組織損傷和抑制氧化應(yīng)激來改善間歇性低氧后的繼發(fā)性胰腺損傷。銀杏葉提取物通過促進(jìn)Nrf2-ARE信號通路介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)，保護(hù)胰腺組織免受間歇性低氧誘導(dǎo)的損傷。EGB可通過抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激減輕IH誘導(dǎo)的胰腺損傷，促進(jìn)Nrf2-ARE信號通路參與了EGB的保護(hù)機(jī)制。這項(xiàng)研究可能為EGB作為治療OSAS患者的潛在藥物提供證據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Sun T，Wang X，Xu H.Ginkgo Biloba extract for angina pectoris：a systematic review[J].Chin J Integr Med，2015，21（7）：542-550.

[2]Li S，Zhang X，F(xiàn)ang Q，et al.Ginkgo biloba extract improved cognitive and neurological functions of acute ischaemic stroke：a randomised controlled trial[J].Stroke Vasc Neurol，2017，2（4）：189-197.

[3]Moon K，Punjabi NM，Aurora RN.Obstructive sleep apnea and type 2 diabetes in older adults[J]. Clin Geriatr Med，2015，31（1）：139-147，ix.

[4]Priou P，Le Vaillant M，Meslier N，et al.Independent association between obstructive sleep apnea severity and glycated hemoglobin in adults without diabetes[J].Diabetes Care，2012，35（9）：1902-1906.

[5]Kent BD，Grote L，Bonsignore MR，et al.Sleep apnoea severity independently predicts glycaemic health in nondiabetic subjects：the ESADA study[J].Eur Respir J，2014，44（1）：130-139.

[6]Wang X，Bi Y，Zhang Q，et al.Obstructive sleep apnoea and the risk of type 2 diabetes：a meta-analysis of prospective cohort studies[J].Respirology，2013，18（1）：140-146.

[7]周燕，陳靜，高一萍，等.吡格列酮對慢性間歇性低氧大鼠氧化應(yīng)激水平及胰島功能的干預(yù)作用[J].中國藥學(xué)雜志，2015，50（5）：408-412.

[8]Christou K，Moulas AN，Pastaka C，et al.Antioxidant capacity in obstructive sleep apnea patients [J].Sleep Med，2003，4（3）：225-228.

[9]Chen XJ，Ren SM，Dong JZ，et al.Ginkgo biloba extract-761 protects myocardium by regulating Akt/Nrf2 signal pathway[J].Drug Des Devel Ther，2019（13）：647-655.

收稿日期：2019-10-15;修回日期：2019-10-25

編輯/肖婷婷