鄧曉敏 彭佳媛 吳藹林 韓彬 余小平
細胞自噬(autophagy)是一種對細胞生存、分化、發(fā)育和胞內(nèi)代謝平衡都至關重要的溶酶體降解途徑。其通過自噬小體和溶酶體以“自我吞噬”的方式回收蛋白質(zhì)和能量,清除受損細胞器并降解入侵細菌[1]。細胞自噬被分為3種類型:巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬[2]。其中巨自噬被認為是自噬的主要亞型,也是目前研究最廣泛的自噬形式,本文中提到的自噬是指巨自噬。生理水平的自噬可抵御外部刺激的壓力,維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。但特殊情況下,自噬或自噬相關蛋白可能促進細胞凋亡或壞死,自噬已被證明可因過度降解細胞質(zhì)而導致自噬性細胞死亡[3]。Zhou等[4]研究發(fā)現(xiàn),自噬對維持視錐細胞的功能和長期生存,支持其代謝需求和抗應激能力,在視網(wǎng)膜退行性疾病中具有保護作用?;A自噬通過維持正常細胞的基因組穩(wěn)定性而發(fā)揮抑癌作用??梢坏┠[瘤形成,不平衡的自噬將有助于腫瘤微環(huán)境下癌細胞存活,并促進腫瘤生長發(fā)育[5]。在乳腺癌化學治療中,自噬與凋亡相互作用既可產(chǎn)生治療抵抗,也可促進癌細胞死亡[6]。這些現(xiàn)象充分體現(xiàn)了自噬在不同疾病和機制中的兩面性。本文僅討論了自噬在視網(wǎng)膜光損傷中的兩面性。
1.1 自噬的特點自噬是有別于凋亡的另一種細胞程序性死亡,是真核細胞特有的生命現(xiàn)象,在細胞生長、發(fā)育與疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用。自噬在遺傳上具有高度保守的特點,是細胞內(nèi)產(chǎn)生雙膜自噬泡將胞質(zhì)內(nèi)容物傳遞給溶酶體降解的動態(tài)過程[7]。
自噬基本過程大致分為3個階段:(1)自噬前體形成階段:這一階段的自噬誘導主要是通過由ULK1(unc-51 like autophagy activating kinase 1,酵母Atg1同系物)、FIP200(focal adhesion kinase family interacting protein of 200 kD,酵母Atg17同系物)、Atg13 3種蛋白形成的ULK1復合物與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)之間相互作用實現(xiàn)的[8]。mTORC1活化抑制細胞自噬,而mTORC1活性被抑制時,自噬體逐漸成核并延伸[1]。(2)自噬小體形成階段:自噬小體形成是自噬的中心環(huán)節(jié)。自噬前體在p62(sequesto-some-1)、LC3(microtubule-associated protein 1 light chain 3)等蛋白作用下逐漸延長,識別并包裹胞漿中所需降解的底物,最終收口成為密閉、球狀自噬小體。在此過程中p62主導底物識別,LC3主導雙膜延伸。LC3的脂質(zhì)形式LC3-Ⅱ常被視為自噬活性標志,LC3-Ⅱ表達升高,說明自噬體形成或自噬增加[9]。(3)自噬體成熟階段:主要是指自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體,并在溶酶體酸性蛋白酶作用下降解其內(nèi)容物的過程。自噬涉及多個基因和細胞信號通路。其細胞信號通路并非孤立,而是處于非常復雜的信號網(wǎng)絡中。自噬通路與凋亡、氧化應激等通路均有交叉,且在一定情況下相互調(diào)節(jié)。
1.2 mTOR通路mTOR(mammalian target of rapamycin)即哺乳動物雷帕霉素靶蛋白,是一種進化上相對保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,它可以調(diào)控細胞周期、生長與增殖,也是細胞自噬調(diào)控的關鍵蛋白[10]。mTOR存在2種復合形式,根據(jù)其對雷帕霉素的敏感性差異分為mTORC1和mTORC2。其中對雷帕霉素敏感的mTORC1是調(diào)控自噬的主要因素,也是多條信號通路的匯聚點。
影響或調(diào)控mTOR信號通路的因素尚未被完全闡明。目前研究較多的有PI3K/AKT/mTOR通路和AMPK/mTOR通路。生長因子主要通過PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)mTOR活性。正常情況下,細胞外的生長因子和細胞因子可通過受體酪氨酸激酶激活PI3K,活化的PI3K催化PIP2轉化為PIP3,并在PDK1的協(xié)同下激活Akt?;罨腁kt磷酸化TSC2,使其從TSC1/TSC2復合物中解聚,以增強Rheb活性,從而正向調(diào)控mTOR。同源性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)可使PIP3去磷酸化,從而逆轉PI3K所催化的反應,是PI3K/AKT途徑的負向調(diào)節(jié)因子[11]。營養(yǎng)物質(zhì)和能量則主要通過單磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated kinase,AMPK)通路調(diào)節(jié)mTOR的活性。一磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)/三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)值升高可活化AMPK,被活化的AMPK作用于TSC1/TSC2,進而抑制mTOR活性。
1.3 Beclin 1通路Beclin 1是酵母菌ATG6/VSP30在哺乳動物的同源基因,亦是最早被發(fā)現(xiàn)的自噬調(diào)節(jié)關鍵因子。Beclin 1具有3個重要結構域:BH3、卷曲螺旋結構域(coiled coil domain,CCD)和進化保守結構域(evolutionarily conserved domain,ECD)。Beclin 1可通過這些結構域與多種蛋白結合形成復合體,抑制或促進自噬發(fā)生[12]。例如,Beclin 1可通過其CCD和ECD結構域與Vps34結合,形成Vps34-Beclin1復合體,促進自噬體膜的形成與轉運??棺贤饩€相關基因產(chǎn)物蛋白(ultraviolet radiation resistance-associated gene,UVRAG)可直接與Beclin 1的CCD結構域結合,促進自噬體成熟,而其亞單位Rubicon與Beclin 1結合,則抑制自噬體成熟[13-14]。研究顯示,細胞凋亡相關因子Bcl-2也是重要的自噬調(diào)節(jié)蛋白,因其含有與Beclin 1相同的結構域BH3,故Bcl-2可競爭性抑制Beclin 1與Vps34的結合從而抑制自噬[15]。由此可見,Beclin 1在自噬體形成的過程中起著重要作用,并與凋亡通路相互影響。
1.4 絲裂原活化蛋白激酶途徑絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protain kinase,MAPK)信號通路高度保守,廣泛存在于真核細胞生物中,并對其細胞周期、基因表達發(fā)揮重要作用。MAPK包括3個平行激酶:JNK、p38和ERK1/2,其都被認為與自噬導致的細胞死亡有關。研究證明,ERK可通過抑制mTORC1觸發(fā)自噬,而 ERK特異性磷酸酶對光致氧化應激產(chǎn)生的活性氧ROS敏感[16]。除上述通路外,泛素樣蛋白系統(tǒng),miRNA、p53等也對自噬信號通路有一定調(diào)節(jié)作用[17]。
2.1 視網(wǎng)膜光損傷中自噬的保護作用自噬及其相關蛋白參與了一系列感光活動,且在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層,內(nèi)、外核層,及視網(wǎng)膜色素上皮細胞均有高表達[18]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),以凋亡為靶點,黑米花青素可改善大鼠視網(wǎng)膜光化學損傷[19]。以自噬為靶點,飛燕草素可通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路誘導自噬從而促進乳腺癌細胞自噬性死亡[20]。自噬亦或可成為視網(wǎng)膜光損傷防治的新研究方向。
光感受器細胞變性和死亡是光致視網(wǎng)膜損傷的主要病理改變,也是一系列相關疾病,如年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)和視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)導致失明的原因[21]。
2.1.1 AMD中自噬的作用藍光易折射,是引起眩光導致視疲勞的一大原因。其中短波藍光易導致視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial cells,RPE)早期損傷,是干性AMD 的重要危險因素[22]。Xia等[23]利用老年C57小鼠視網(wǎng)膜和人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(human retinal pigment epithelial cells,hRPE)為模型,以藍光誘導損傷。損傷后第1天電鏡下觀察到:hRPE線粒體受損,視網(wǎng)膜外節(jié)段結構紊亂。蛋白質(zhì)印跡實驗(Western blotting,WB)結果顯示,自噬相關蛋白PERK、LC3、Beclin-1上調(diào),提示自噬啟動。損傷后第5天,電鏡觀察到視網(wǎng)膜和光感受器損傷恢復。WB結果顯示PERK、LC3、Beclin-1下調(diào)。由自噬相關蛋白的表達變化可推測:自噬參與了視網(wǎng)膜光損傷的早期修復。
大劑量光照可導致RPE中玻璃疣(Drusen,位于RPE和Bruch膜之間的一種異常沉積物)和脂褐素的積累。二者均是AMD發(fā)展的危險因素[24]。Zhang等[25]發(fā)現(xiàn),脂褐素的主要成分A2E誘導細胞炎癥因子表達,促進血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的分泌,并降低RPE生存率。增強自噬可減少炎癥因子和VEGFA的分泌,對RPE細胞抵抗A2E毒性具有保護作用。
視錐細胞是視網(wǎng)膜光感受器中對色彩視覺和視覺感知至關重要的細胞,相對于視桿細胞,視錐細胞在較強光線下仍能正常工作,且有抗強光損傷能力。AMD后期,因視錐細胞大量丟失,患者視力受到嚴重損傷甚至失明。Zhou等[4]敲除自噬基因Atg5阻斷自噬后發(fā)現(xiàn),視錐細胞的抗強光傷害的能力降低。說明自噬有助于視錐細胞抗強光損傷,且在AMD后期起到了保護視力的作用。
Cai等[26]發(fā)現(xiàn)MicroRNA-29可通過抑制mTORC1活性,促進自噬,增加RPE中Drusen的清除率。由此可見,MicroRNA-29有可能成為治療眼部疾患中RPE變性的新治療策略。
2.1.2 RP中自噬的作用RP是視網(wǎng)膜變性最常見的臨床亞型之一,是一種神經(jīng)退行性疾病。因RP影響光感受器的存活能力,故最終可導致失明[27]。Yao等[28]發(fā)現(xiàn),光損傷促進具有細胞毒性的視覺轉導蛋白生成,其細胞毒性可導致視網(wǎng)膜變性。他們敲除自噬基因Agt5中斷自噬,發(fā)現(xiàn)視覺轉導蛋白累積,加速了視神經(jīng)元退化和視網(wǎng)膜變性。而同時敲掉Agt5和視覺轉導蛋白的基因Gnat-1,則發(fā)現(xiàn)視桿細胞變性率降低,光感受器保存良好。自噬有助于及時清除視覺轉導蛋白,從而達到保護光感受器的作用。
2.2 視網(wǎng)膜光損傷中自噬的損傷作用自噬在許多疾病進程中體現(xiàn)著雙刃劍效應。近年研究顯示,視網(wǎng)膜光損傷中自噬不僅有以上保護作用,在一定條件下也有加重損傷增加細胞死亡率的效果。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn),以可見光照射小鼠光感受器細胞(661W細胞)可激活MAPK通路,導致顯著自噬,細胞死亡率上升。而分別使用通路抑制劑阻斷MAPK的3個平行激酶途徑:JNK、p38和ERK1/2后發(fā)現(xiàn):ERK1/2是光誘導661W細胞死亡的關鍵,通過抑制ERK通路抑制了自噬,可明顯降低661W細胞的光致死率。此研究不僅證明了自噬在視網(wǎng)膜光損傷中可起到加重損傷的作用,還為阻斷自噬性損傷找到了可能的干預靶點。目前關于自噬對視網(wǎng)膜細胞負面作用的研究較少,有待未來進一步探索。
雖然目前為止,視網(wǎng)膜光損傷的具體機制尚不明確,但如果能以自噬為切入點加以研究,或可為視網(wǎng)膜光損傷相關疾病的防治提供新思路。