干細胞移植治療小兒腦癱的現(xiàn)狀和進展

易沙沙，羅凱旋綜述，陳茉弦，敖麗娟審校

0 引 言

腦癱是一種運動和姿勢發(fā)育持續(xù)性障礙的綜合征，這種綜合征是由發(fā)育中胎兒或嬰幼兒腦部的非進行性損傷引起的，腦癱同時常伴有感知覺、認知、交流、行為障礙、癲癇以及繼發(fā)性骨骼肌肉等問題[1]，需要廣泛和多學科的管理。根據(jù)腦癱的流行病學報道，每個國家的發(fā)病率都不一樣，腦癱全球平均的發(fā)病率大致為2‰[2]，而我國的發(fā)病率為2.48‰[3]，略高于全球平均發(fā)病率。新生兒重癥監(jiān)護和圍產期護理技術的進步提高了新生兒的存活率，尤其是低出生體重和極低出生體重的新生兒的存活率[4]，同時隨著二胎政策在中國的實施，許多家庭開始計劃生育二胎，但是部分該女性的年齡超過35歲，而早產，孕母高齡是導致腦癱的重要因素[5]，相關研究表明早產兒腦癱的患病率呈指數(shù)增長，例如，與足月兒相比，孕33周之前出生的嬰兒發(fā)生腦癱的風險要高30倍[6]。這不僅增加了患者及其家庭的負擔，對醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)來說也是一個巨大的挑戰(zhàn)。目前治療腦癱的方法有很多，如物理治療、作業(yè)治療、假肢矯形、藥物干預、高壓氧治療、外科手術等，但是上述治療方法幾乎都是以改善患者活動和功能參與為目的，都不能完全治愈腦癱。此外，盡管低溫療法可以明顯降低圍產期缺氧嬰兒的病死率和減輕殘疾，但是在接受低溫治療中，仍然有40%～50%的患兒死亡或者形成嚴重的神經(jīng)功能障礙[6]。近年來，干細胞療法作為多種新生兒疾病的治療手段正在迅速發(fā)展，多項動物實驗和臨床研究表明干細胞移植治療腦癱是安全有效，這為腦癱患兒及其家庭帶來了新的曙光。

1 腦癱的發(fā)病機制

任何影響胎兒或者新生兒腦部發(fā)育的因素都有可能導致腦癱，這些因素大致分為以下3類[7]：①宮內因素：胎兒生長受限，胎盤血管疾病，宮內感染或者炎癥，先天畸形；②圍產期因素：早產，胎盤早剝，絨毛膜羊膜炎，新生兒窒息；③產后因素：腦室內出血，室周白質軟化癥、敗血癥和新生兒卒中。上述因素均可能導致健康腦組織不可逆轉的損傷，影響兒童的腦部發(fā)育。其中，缺血或缺氧是引起新生兒腦損傷的常見原因，這一過程包括細胞能量耗竭、興奮性中毒(即神經(jīng)遞質，特別是谷氨酸，過度興奮引起的神經(jīng)細胞損傷或者死亡)和氧化應激，氧化應激又會導致線粒體衰竭，進一步加劇能量的消耗，最終導致神經(jīng)元和膠質細胞凋亡或壞死[8]。影像學研究顯示，腦癱的病變范圍比較廣泛，包括大腦皮層、半球白質、基底神經(jīng)節(jié)和小腦。發(fā)生于不同腦部成熟階段的損傷決定了病變的部位和類型，以及對損傷的反應。胎兒和早產兒大腦的血管擴張能力有限，增加了大腦缺血和彌漫性損傷的可能性，此外，早產兒的大腦室周白質深部是最脆弱的，與成熟相關的代謝和分子因素進一步加強了室周白質的易感性，因此，側腦室附近白質壞死是早產引起的腦癱的特征性病變[9]。相比之下，足月兒發(fā)生的損傷主要影響大腦皮層、皮層下深部和室周白質。

2 干細胞移植治療腦癱

神經(jīng)細胞的損傷和細胞信號傳導的中斷會導致正在發(fā)育中的復雜的神經(jīng)網(wǎng)絡受損，而干細胞具有自我更新和分化成多種組織細胞的能力，可以在關鍵的神經(jīng)發(fā)育窗口同時修復多個受損的神經(jīng)成分，這種干預措施可能會給腦癱患兒帶來更好的療效。

2.1干細胞的分類

2.1.1 間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)MSCs是由多種類型細胞混合而成的骨髓基質細胞，具有造血和分化成多種功能細胞的能力，如脂肪細胞、成骨細胞、神經(jīng)元細胞等，同時還能分泌細胞因子。骨髓被認為是MSCs的主要來源[10]，同時MSCs也存在于人類臍帶血、Wharton膠(臍帶血結締組織)、脂肪組織和胎盤組織中，在其他組織中比較少[11]。已有研究證明骨髓來源的MSCs對局灶性腦缺血大鼠模型有神經(jīng)保護作用[12]。有研究者認為Wharton膠來源的MSCs比骨髓來源的MSCs具有更低的分化程度和免疫原性，更高的增殖能力，更強的旁分泌能力[13]，因此更有可能分化為神經(jīng)細胞修復大腦受損區(qū)域。但是有其他研究者對MSCs在神經(jīng)發(fā)生的分化潛能尚有爭議[14]，因此還需要進一步探索其作用機制。

2.1.2胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)ESCs可以從早期胚胎或原始腺中分離，并且能夠被誘導分化為機體內幾乎所有的細胞，通過特定的培養(yǎng)方法，ESCs也可以轉化為神經(jīng)元[15]。在動物實驗中發(fā)現(xiàn)將體外分化為神經(jīng)元的ESCs移植到腦癱大鼠體內可以改善實驗動物的空間記憶[16]。但是，ESCs是目前最有爭議的干細胞。一方面，ESCs的增殖能力及其分化成多種細胞類型的潛力有可能會引發(fā)腫瘤[6]，另一方面， ESCs的獲取通常需要破壞胚胎，其應用仍然存在長期的倫理道德問題。

2.1.3神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)NSCs存在于成年哺乳動物的嗅球、海馬和腹側紋狀體等區(qū)域[17]，也可以從胚胎或者胎兒腦組織中提取。NSCs不僅可以通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、生長因子和細胞因子等來改善患兒大腦損傷區(qū)域的微環(huán)境，促進損傷的修復，此外，在一定條件下，NSCs還可以分化成星型膠質細胞、少突膠質細胞和神經(jīng)元,發(fā)揮神經(jīng)保護和細胞替換的作用[18]。

2.1.4臍帶血干細胞(umbilical cord blood stem cells，UCBCs)臍帶血中含有大量的原始多能干細胞、祖細胞，內皮前體細胞，和具有治療潛力的非造血細胞，有修復受損組織的潛力，是干細胞的主要來源之一，非常適合用于細胞治療[19]，已經(jīng)在各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中顯示出巨大的潛力。盡管相對于其他干細胞來說，UCBCs具有較少的倫理問題，更容易收集，并且能夠耐受更多的人類白細胞抗原而減少排斥反應，用于治療時更有效安全，但是每個嬰兒獲得的UCBCs的數(shù)量和每個批次內的干細胞數(shù)量都是不同的和不均勻的，而且UCBCs的收集量與胎齡成正比[20]，因此，早產兒可能不是自體干細胞移植的最佳候選者。

2.1.5誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，IPSCs)IPSCs在表型、端粒酶活性和分化能力等方面與ESCs非常相似，被認為是胚胎干細胞的最佳替代品。而且IPSCs可以利用患者自身的細胞制備，不會產生免疫排斥的問題[21]。但是未分化的IPSCs的增殖和分化不受控制[22]，以及其基因組的不穩(wěn)定性[23]，可能會導致腫瘤的產生。其致瘤性、有效性和安全性都還需要進一步的實驗研究。

2.1.6少突膠質前體細胞(oligodendrocyte progenitor cells，OPCs)OPCs來源于胎兒腦組織，或者通過ESCs或IPSCs分化而來。有研究發(fā)現(xiàn)，ESCs來源的OPCs可以改善脊髓損傷大鼠的功能障礙[24]。國外研究者發(fā)現(xiàn)，OPCs可以通過阻止腦室周圍白質的神經(jīng)元脫髓鞘，恢復室周白質軟化動物的神經(jīng)行為障礙和認知缺陷[25]。

2.1.7多能成體祖細胞(multipotent adult progenitor cells，MAPCs)MAPCs是未成熟的細胞群，在體外可以分化為間充質細胞和具有內臟中胚層、神經(jīng)外胚層與內胚層特征的細胞。MAPCs存在于人體的所有組織中，負責維持體內穩(wěn)態(tài)和組織的修復[26]。有研究表明，在新生缺血缺氧的大鼠模型中使用MAPCs能夠保護神經(jīng)元和改善大鼠的行為學結果，治療作用至少持續(xù)了6個月，其可能是通過營養(yǎng)機制而不是細胞替代發(fā)揮作用[11]。

2.2作用機制干細胞具有多能性，并且能夠對微環(huán)境信號作出反應，從而指導細胞分化和活動[27]。雖然干細胞移植治療腦癱的作用機制還不完全清楚，但是移植的干細胞已經(jīng)被證明能夠取代神經(jīng)元，膠質細胞和血管細胞，并且釋放營養(yǎng)因子[28]。最初認為干細胞移植治療腦癱的關鍵機制是細胞分化后的替代作用，但是最近有研究表明移植的干細胞介導腦癱患者功能恢復的主要作用來自于旁分泌效應對中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的影響，而不是直接的細胞替換[29-30]。旁分泌的一些細胞因子如粒細胞集落刺激因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、表皮生長因子、膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、腫瘤壞死因子α，IL-10，前列腺素E2等在免疫調節(jié)，髓鞘的形成以及神經(jīng)前體細胞的存活、增殖與分化等方面發(fā)揮了重要的作用[31]，同時還能促進NSCs的遷移和增殖[32]。值得注意的是，干細胞移植治療腦癱的作用會因為干細胞的來源和給藥時間的不同而有所差異。在干細胞移植早期，大腦微環(huán)境的恢復可能是驅動損傷修復的原因，同時移植的干細胞對免疫調節(jié)，細胞黏附分子(如整合素，鈣粘蛋白)和細胞代謝也有明顯的影響[33]。移植數(shù)周后，旁分泌作用可能最為明顯，干細胞分泌的生長因子和神經(jīng)調節(jié)因子會直接影響小膠質細胞的表型，另外干細胞長期的效應可能會影響神經(jīng)細胞的存活，從而影響細胞內的相互作用、神經(jīng)環(huán)路的建立以及軸突的髓鞘化[34]。此外，干細胞還分泌含有miRNA，蛋白質，受體等多種可以促進損傷大腦發(fā)育的細胞外囊泡，如外泌體[35]。外泌體很容易穿過血腦屏障[36]，并且可以通過炎癥驅動機制積聚于損傷區(qū)域，調節(jié)免疫信號的傳導，促進血管生成[38-39]，同時還能影響轉錄和翻譯后修飾。有研究已經(jīng)證明MSCs分泌的外泌體能夠改善大鼠出生后炎癥性腦損傷的認知和運動功能[39]。細胞外囊泡的機制可能為“無細胞治療”開辟了新的方向，體內和體外的實驗都表明通過獲取干細胞分泌的細胞外囊泡來干預疾病的“無細胞治療”方法與干細胞治療可以達到同樣的效果，同時還能避免倫理道德和一些安全性問題[40]。但是外泌體的具體作用機制還需要進一步研究，“無細胞治療”的開展也還需要大量的實驗來證明其安全性和有效性。

2.3干細胞的最佳移植途徑、劑量和時機確定最佳移植途徑對臨床上干細胞移植治療腦癱至關重要。因為移植途徑會直接影響干細胞到達損傷部位的有效劑量。目前，可以通過腦室，鞘內，鼻腔，肌肉和血管移植干細胞。通過血管的移植途徑可以調節(jié)炎癥反應，但是由于干細胞無法穿過血腦屏障，可能會停留在非損傷區(qū)域，甚至有肺栓塞的風險，所以該移植途徑可能不是治療腦癱的最佳選擇[41]。同樣的，肌肉內注射干細胞到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞劑量也會比較少。因此，直接將干細胞輸送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷區(qū)域才能最大限度發(fā)揮其作用。借助腰穿的鞘內移植盡管創(chuàng)傷較小，腦脊液可以將干細胞運送至損傷部位，但是反復的穿刺和注射會增加患者感染的機會和痛苦。盡管經(jīng)腦室的局部注射能夠提高藥效，但是也不適用于相對比較脆弱新生兒。相比之下，鼻內注射可能更適用于新生兒[42]。所以，不同的腦癱患者移植干細胞的途徑也有所不同。有研究者對干細胞移植劑量和時機進行了探索，Drobyshevsky等[43]將人UCBCs移植入腦癱兔模型中發(fā)現(xiàn)大劑量的UCBCs比一半大劑量的UCBCs更能顯著改善動物的運動姿勢，肌力和肌張力障礙，此外他們通過MRI生物標記物或者PCR還發(fā)現(xiàn)在新生兒期注入的UCBCs幾乎沒有穿過大腦，這也證明了干細胞是通過旁分泌作用而不是直接的細胞整合或增殖效應發(fā)揮治療作用。但是，其不同劑量的實驗并不是同時進行的，沒有直接的對比，而且大劑量的概念也沒有統(tǒng)一標準，所以干細胞劑量是否與療效成正比還需要進一步的研究。McDonald等[44]認為出生后4h可能是臨床上干細胞移植的一個關鍵的時間點，盡管越早干預療效會越好，但是移植的確切時間還取決于診斷腦癱的時間，獲得家屬同意所需的時間以及臨床試驗的結果。

2.4臨床研究干細胞移植治療腦癱的方法已經(jīng)在多種腦癱動物模型中進行了實驗，其令人鼓舞的臨床前研究結果為干細胞治療腦癱的臨床轉化帶來了希望。研究者已經(jīng)開始進行干細胞移植治療腦癱患者的臨床試驗。在Nguyen等[45]進行的一個非對照的臨床研究中，40名腦癱患者接受了自體骨髓單核細胞的移植后，他們的運動功能和肌張力都比治療前有了明顯的改善，在接受治療后沒有用明顯的副作用和不適反應，該研究表明細胞療法對于缺氧引起的腦癱是安全有效的。但是該臨床試驗隨訪時間較短，腦癱患者接受治療后的長期效果不明，同時也應該進一步進行雙盲的臨床對照試驗對療效進行評估和監(jiān)測。在Jessica等[46]的二期臨床試驗中，他們證明了腦癱患兒自體臍帶血的輸注可以改善患者的運動功能，通過MRI發(fā)現(xiàn)患兒大腦的感覺運動網(wǎng)絡連通性增加，且這種連通性與輸注劑量有關。但是考慮到多數(shù)患兒家庭可能沒有保留臍帶血，所以需要進一步研究異基因臍帶血治療腦癱患者的安全性和有效性。鑒于臍帶血比較容易收集，且含有大量的原始多能干細胞和MSCs，所以國內的臨床研究多集中于臍帶血來源的干細胞治療腦癱。Huang等[47]證明了輸注人臍帶血來源的MSCs聯(lián)合基礎康復治療對改善腦癱患兒的總體運動能力和綜合功能是安全有效的，而且在治療后的第3、6、12、24個月隨訪中通過腦電圖的結果證明了腦功能有所改善，但是常規(guī)MRI并未發(fā)現(xiàn)患兒大腦結構的改變等，研究者認為可能與MRI的靈敏度有關。這也提示我們，細胞療法和其他康復技術結合可能會達到更好的治療效果。除了聯(lián)合其他治療方法，還存在許多因素影響干細胞的療效。Wang等[48]通過腰穿的方式移植臍帶血來源的MSCs治療8對同卵雙生的痙攣型腦癱患兒，發(fā)現(xiàn)具有相同遺傳學背景的同卵雙胞胎腦癱患兒對干細胞移植治療的反應具有高度的一致性，而不同遺傳學背景的腦癱患兒對干細胞治療的反應則存在顯著性差異，這表明不同的治療效果與遺傳背景有關，遺傳因素可能會影響干細胞的作用機制。另外有研究者比較了骨髓MSCs、骨髓單核細胞和常規(guī)的康復治療對痙攣型腦癱患兒的療效，他們發(fā)現(xiàn)與常規(guī)的康復治療相比，骨髓MSCs和骨髓單核細胞都能夠明顯改善腦癱患兒的粗大運動和精細運動功能，但是骨髓MSCs有益作用更加顯著，持續(xù)時間更長，同時整個治療過程無明顯的不良反應[49]。國內其他研究者采用自體骨髓MSCs轉化NSCs移植治療52名腦癱患兒，在接受治療后的第1個月、第6個月、第18個月后通過粗大運動功能評定(GMFM-66和GMFM-88)評估總體運動功能，發(fā)現(xiàn)移植干細胞后，患兒的GMFM評分明顯改善，并且研究者比較了不同移植方式(顱內移植和腰椎穿刺)、患兒年齡和性別對療效的影響，均未發(fā)現(xiàn)有顯著性差異。但是在比較移植方式時，并沒有很好的限定患兒年齡，所以移植方式對療效的影響還需更加完善的實驗加以證明[50]。綜上，目前仍然缺少大規(guī)模的臨床試驗為干細胞治療腦癱提供強有力的證據(jù)以促進其臨床轉化。其他干細胞，如NSCs、ESCs，可能由于倫理問題和致瘤性等安全性問題，臨床試驗開展得較少，主要還是集中在動物實驗中。

2.5輔助干細胞移植治療腦癱的方法移植的干細胞能夠集中于損傷部位將在很大程度上提高療效。除了改進移植途徑以外，還可以通過其他輔助方法來實現(xiàn)這一目的。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子、集落刺激因子、趨化因子和營養(yǎng)生長因子等細胞因子不僅可以促進移植的干細胞向損傷區(qū)域遷移[51]，而且可以增強干細胞的旁分泌效應[52]。因此，干細胞移植聯(lián)合這些細胞因子治療腦癱可以進一步提升療效[53]。隨之產生的轉運載體也引起了大眾的關注。最近，Lin等[54]構建了一個多元的聚氰基炳烯酸丁酯納米粒子，該納米粒子表面吸附或封裝的BDNF不僅可以誘導IPSCs的分化，促進損傷區(qū)域神經(jīng)元軸突和樹突的生長，從而更好的發(fā)揮干細胞的治療作用，而且還能作為IPSCs的一個追蹤劑，可以對移植的干細胞進行監(jiān)測。另外，隨著組織工程技術的迅速發(fā)展，生物可降解材料逐漸用于疾病的治療，為干細胞的移植帶來了新的前景。生物可降解材料聯(lián)合干細胞已經(jīng)被證明可以用于脊髓損傷的治療[55]。在缺血缺氧性腦損傷的腦癱患者中，腦部可能會由于組織大量壞死而形成壞死腔,由于缺少血供和足夠的細胞外基質，該區(qū)域的微環(huán)境受損，不利于移植的干細胞發(fā)揮作用。Shin等[56]通過將人神經(jīng)前體細胞與生物材料聚合物支架結合的復合物移植入腦癱小鼠模型的腦部壞死腔中，發(fā)現(xiàn)該復合物不僅能夠誘導移植干細胞的存活和分化，而且還能減少壞死面積，改變雙側大腦半球神經(jīng)元與其靶細胞之間的連接。移植干細胞與轉運載體相結合的優(yōu)化多學科的方法將為腦癱的治療提供一種新的思路。

此外，有研究者發(fā)現(xiàn)氧氣濃度會在一定程度上會影響干細胞的治療作用。Zhao等[57]發(fā)現(xiàn)1%的低氧濃度比正常氧氣條件下能更好地維持干細胞的性狀，在1%的氧氣濃度中，干細胞具有更大的增殖潛能[58]，這可能與干細胞在低氧環(huán)境中分泌更多的血管內皮生長因子和更少的IL-6，同時激活相關干細胞信號通路有關[56]。因此氧氣濃度可能是干細胞移植治療腦癱的一種重要的輔助途徑。

3 結語與展望

隨著對腦癱的深入研究，各種治療方法不斷涌現(xiàn)，但是多數(shù)方法只能延緩疾病的進展，至今還沒有能夠治愈腦癱的方法?？紤]到腦癱患者隨著年齡的增長，功能需求會有所變化，同時鑒于腦癱患者受損的中樞神經(jīng)具有一定的可塑性，所以應該著重關注治療方法的安全性和有效性。隨著臨床前研究到臨床試驗的結果表明，干細胞移植治療腦癱有著巨大的潛力，但是在細胞治療方面，仍然有許多挑戰(zhàn)，如干細胞的來源，制備，移植途徑，移植劑量和移植時機都對療效有著深遠的影響，以上相關參數(shù)還需要進一步探索以制定嚴謹?shù)闹委煼桨浮６冶M管干細胞移植后較少產生嚴重的不良反應，但是出現(xiàn)的一些并發(fā)癥，如畏寒，發(fā)燒，過敏性休克，排斥反應等，也不容忽視。此外，還需要繼續(xù)研究腦癱的發(fā)病機制和干細胞移植驅動損傷恢復的作用機制，為細胞療法提供更多的證據(jù)和科學的支持，從而促進干細胞治療腦癱的臨床轉化。