銀杏葉提取物對神經(jīng)退行性疾病的作用機制及研究進展

張徽，王淑靜，袁天宇，楊驕，代民言，張琦，金成斌

(哈爾濱商業(yè)大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150076)

銀杏葉提取物(Ginkgobilobaextract)是從銀杏干葉中提取的含有黃酮類、萜類內脂、甾體等100多種化合物的混合物[1]。研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物具有清除氧自由基、改善血液流變學、拮抗血小板活化因子、保護神經(jīng)系統(tǒng)、抗癌等多種藥理作用[2]。近年來，隨著阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)、帕金森病(Parkinson′s disease，PD)、亨廷頓舞蹈病(Huntington disease，HD)等神經(jīng)退行性疾病發(fā)病率的增長，銀杏葉提取物對神經(jīng)保護作用的研究也日益增多。目前銀杏葉提取物主要用于注意力不集中﹑記憶力衰退﹑癡呆等神經(jīng)損傷性疾病，其具體作用機制較為復雜，本文將根據(jù)神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制闡述銀杏葉提取物對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用。

1 銀杏葉提取物的藥理作用

銀杏(GinkgobilobaLinn.)為銀杏科銀杏屬落葉喬木，別名白果樹、公孫樹，是現(xiàn)存種子植物中最古老的孑遺植物，有“活化石”之稱[3]。其葉子和果實等部分均有較高的藥用價值。傳統(tǒng)醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉味甘、苦、澀、平，歸心、肺二經(jīng)，其功能主要有活血化瘀，通絡止痛，斂肺平喘，化濁降脂等，多用于胸痹中風，肺虛咳喘，高脂血癥[4]。目前國際標準的銀杏葉提取物是按照德國Schwabe專利工藝生產的EGB761，其成分主要包括：黃酮類24%，羧酸類13%，原花青素類7%，萜內酯類6%，兒茶素類2%，非黃酮苷類20%，白果酸<0.0005%，高分子化合物4%，無機物5%，水分3%，其他3%。銀杏葉提取物中含有多種有效成分，并發(fā)揮著不同的藥理作用。

目前銀杏葉提取物被廣泛認可的藥理作用主要有：①抗氧化作用：銀杏葉提取物具有清除氧自由基和羥自由基、減弱自由基氧化損傷的能力[5]。Ran等[6]通過建立兔心肌缺血再灌注損傷模型發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物可調節(jié)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)酶活性和心肌肌鈣蛋白Ⅰ來清除氧自由基，改善缺血心肌細胞的抗氧化能力；②抗腫瘤作用：銀杏葉提取物通過調控血管內皮生長因子(VEGF)、Bcl-2以及Bax的表達水平，誘導癌細胞凋亡[7]。還可以通過抗生物致癌因子、提高機體免疫力、誘導腫瘤細胞凋亡和抑制PI3K/Akt/VEGF信號轉導等途徑發(fā)揮抗腫瘤的作用[8]；③抗菌作用：銀杏葉提取物可抑制植物病原真菌和動物病原細菌，其中對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌的抑制作用尤為明顯[9]；④改善血液流變學：銀杏葉提取物可促進血管內皮細胞中NO的釋放，使血管舒張、心血管流量增加，從而改善心肌缺血缺氧[10]；⑤抗血小板聚集：銀杏葉提取物作用于細胞膜上的血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)受體，拮抗PAF誘導的血小板聚集以及血栓形成，能有效降低血漿和全血黏度降低。唐志苗等[11]發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物可通過影響血小板活化，減少血小板第3因子(PF3aT)和凝血時所需磷脂有效表面積，使家兔機體處于易出血狀態(tài)；⑥降血脂作用：銀杏葉提取物通過參與血脂的調節(jié)和脂蛋白-膽固醇的代謝，減少膽固醇在外周組織的聚集和對血管內皮細胞的損害，從而防止動脈粥樣硬化形成[12]；⑦保護神經(jīng)：銀杏葉提取物可有效抑制小膠質細胞的激活及其產生的炎性反應，阻止神經(jīng)細胞凋亡或變性[13]。并可以通過保護星形膠質細胞以及抑制興奮性氨基酸誘導的神經(jīng)元損傷來保護神經(jīng)，臨床上多用于治療腦卒中、注意力不集中、記憶力衰退、癡呆等。

2 銀杏葉提取物對神經(jīng)退行性疾病的作用機制

神經(jīng)退行性疾病(Neurodegenerative diseases)是由于大腦和脊髓的神經(jīng)元細胞喪失而引起的一類不可逆轉的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特征表現(xiàn)為發(fā)作遲緩和選擇性神經(jīng)元的功能障礙。目前研究表明銀杏葉提取物可影響PI3K/Akt信號通路、CREB信號通路以及RSK1/GSK-3β信號通路來發(fā)揮神經(jīng)保護作用[14]，除此外銀杏葉提取物還可通過多種機制預防和治療神經(jīng)退行性疾病。

2.1 銀杏葉提取物改善β淀粉樣蛋白沉積 β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)是由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶的蛋白水解作用而產生的含有39～43個氨基酸的多肽。Aβ常以單體、可溶性或不溶性寡聚體及不溶性淀粉樣纖維等形式存在，其聚集體具有明顯的神經(jīng)毒性，可誘發(fā)神經(jīng)元變性和凋亡[15]。Aβ的產生和清除失衡，可使Aβ發(fā)生聚集反應，生成可溶性寡聚體，最終在神經(jīng)細胞間形成老年斑，誘發(fā)神經(jīng)元凋亡和突觸丟失，產生神經(jīng)毒性[16]。Aβ可以使細胞膜上原有的鈣離子通道發(fā)生磷酸化，鈣離子內流增加，導致鈣超載。細胞內鈣離子紊亂會導致神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)元代謝異常和酶系統(tǒng)激活信號途徑的異常[17]。研究表明對APP轉基因Tg2576小鼠注射16個月的銀杏葉提取物，結果可顯著降低小鼠APP的蛋白水平[18]，APP的減少可顯著減少小鼠Aβ沉積，從而保護神經(jīng)元。銀杏葉提取物可以抵消Aβ1-40引起的鈣超載，抑制Ca2+內流，減輕神經(jīng)元損傷，提高海馬神經(jīng)元活力與神經(jīng)元特異核蛋白(Neu N)數(shù)目，改善由Aβ沉積引起的神經(jīng)退行性疾病[19]。

2.2 銀杏葉提取物改善神經(jīng)炎癥 神經(jīng)炎癥(Neuroinflammation)是由激活的小膠質細胞、外周入侵的T細胞釋放炎性因子和神經(jīng)毒性因子所引起。正常情況下細胞釋放的炎性因子會保護神經(jīng)細胞，過度激活炎癥細胞可釋放致炎細胞因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、一氧化氮(NO)等，引起神經(jīng)元形態(tài)改變以致神經(jīng)細胞凋亡。某些病理因素可刺激小膠質細胞釋放多種炎性因子如：白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、TNF-α、腫瘤壞死因子β(TGF-β)、NO、過氧化氫(H2O2)、蛋白水解酶、谷氨酸鹽等[20]。銀杏葉提取物可抑制炎癥因子和神經(jīng)毒性因子TLR-4、NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6的產生與釋放[21]。如Zhou等[22]發(fā)現(xiàn)銀杏內酯和銀杏內酯酸可以通過調節(jié)TLRs/MyD88/NF-κB信號通路抑制BV2膠質細胞產生炎癥因子。銀杏葉提取物還可抑制IL-1誘導產生的一氧化氮合酶(iNOS)/一氧化氮(NO)趨化因子，引導c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，c-JNK)的降解[23]。c-JNK在細胞凋亡中起著重要作用，其信號傳遞途徑的目標是使線粒體釋放凋亡因子細胞色素C(Cyt c)，促進細胞的凋亡[24]。銀杏葉提取物會抑制c-JNK降解，減少Cyt c的釋放，抑制細胞凋亡從而保護神經(jīng)元。

2.3 銀杏葉提取物的抗氧化作用 目前許多學者通過研究表明神經(jīng)退行性疾病與氧化應激有關。正常機體中,活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和活性氮(Reactive nitrogen species，RNS)產生與抗氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡，某些病理因素可以導致ROS和RNS的生成增加或使抗氧化酶活性降低造成氧化應激。ROS的毒性作用主要包括膜蛋白的損傷和大量自由脂酸的釋放[25]。膜蛋白的損傷會造成Ca2+大量內流，導致鈣超載引起的線粒體腫脹，最終造成神經(jīng)元的不可逆性損傷。大量的自由脂酸會使Tau蛋白異常聚合，產生神經(jīng)纖維纏結(Neurofibrillary tangle，NFT)，最終導致神經(jīng)細胞功能喪失。銀杏葉提取物清除自由基抗氧化的作用機制與抑制ROS的生成密切相關。肖茜等[26]用H2O2建立氧化損傷模型，結果顯示EGB761可使損傷后的白癜風黑素細胞中的丙二醛(MDA)和ROS水平顯著降低，而超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性明顯增加(SOD和GSH-Px是機體內抗氧化酶)。說明銀杏葉提取物的抗氧化作用機制是降低氧化產物的生成和提高抗氧化物酶活性。

2.4 銀杏葉提取物抗凋亡作用 細胞凋亡(apoptosis)是指為維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制細胞自主有序的死亡。凋亡調控的紊亂會引起神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷、自身免疫性疾病和腫瘤等一系列疾病。經(jīng)典的細胞凋亡途徑主要為死亡受體途徑和線粒體途徑[27]，前者是死亡配體與細胞表面的死亡受體相結合，死亡受體胞內段的死亡域會吸引銜接蛋白并募集caspase-8前體，形成死亡誘導信號復合物，激活caspase-3，caspase-7等，進而誘導細胞凋亡。后者是刺激因子誘導線粒體釋放Cyt c、使其進入細胞質與dATP、Aapf-1和procaspase-9組成凋亡體，凋亡體可激活其下游的procaspase-3，誘發(fā)最終效應蛋白caspase-3的表達，剪切細胞內骨架蛋白，介導細胞核片段化，引起細胞皺縮、DNA裂解、染色體濃縮和凋亡小體的形成等，最終誘發(fā)caspase級聯(lián)放大反應引起細胞凋亡[28-29]。大量實驗證明，銀杏葉提取物可抑制caspase-3的啟動及其級聯(lián)反應，抑制神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生，并改善學習記憶功能[30]。

迄今為止，人類已發(fā)現(xiàn)包括P53，細胞因子反應調解蛋白(CrmA)，凋亡抑制蛋白家族(IAPs)，F(xiàn)LICE抑制蛋白(FLIPs)以及Bcl-2蛋白家族在內的多種凋亡抑制分子，Bcl-2蛋白家族是由凋亡抑制因子(Bcl-2、Bcl-xl)和凋亡促進因子(如Bax、Bak、Bid、Bad)等組成，目前認為Bcl-2和Bcl-xl通過三種方式調控凋亡[24]，分別是：①同Bax形成異源二聚體；②與線粒體功能蛋白質電壓依賴式陰離子通道VDAC結合；③干擾Bax、Bak等促凋亡因子定向易位到具體的細胞器。李鵬盈等[31]通過建立心肌細胞缺氧損傷模型發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物可顯著升高缺氧心肌細胞Bcl-2的mRNA和蛋白表達水平，降低Bax、caspase-3的mRNA和蛋白表達水平。

2.5 銀杏葉提取物對線粒體功能的保護 線粒體作為細胞的能量工廠，除了對人體能量供應有著重要作用外，同時還參與調節(jié)多種復雜的功能以維持人體正?；顒印＞€粒體發(fā)生損傷會引發(fā)神經(jīng)退行性疾病[32]，其機制可能包括：①線粒體動態(tài)變化(線粒體分裂、融合、運輸)的異常能導致線粒體延長或縮短，最終降低線粒體的代謝活力[33]。例如，抑制線粒體分裂蛋白1(Drp1)表達可促使線粒體延長，氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OX-PHOS)復合物Ⅳ活力下降，導致線粒體功能障礙；②線粒體會通過電子傳遞鏈(ETC)產生ATP和低水平的ROS，維持正常細胞所需的能量和氧。神經(jīng)元活動需要消耗大量能量，當線粒體呼吸鏈被破壞時，會使線粒體膜電位低于閾值，ATP的生成受到抑制，導致能量供應不足而損傷神經(jīng)細胞[32]；③鈣超載可降低線粒體膜電位，引起線粒體腫脹及Cyt c等凋亡因子的釋放，激活凋亡級聯(lián)反應而促進細胞的凋亡。此外鈣超載還會刺激星形膠質細胞釋放IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子，使神經(jīng)炎癥加重；④體內過多的ROS會發(fā)生脂質過氧化反應生成MDA，MDA會影響線粒體ETC和磷酸化過程。上述改變會引起腦內神經(jīng)元細胞發(fā)生不可逆性傷害。銀杏葉提取物可以抑制線粒體內鈣離子超載[34]，抑制細胞凋亡，保護神經(jīng)元。王登科等[35]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物可使大鼠周圍神經(jīng)元線粒體的體密度與數(shù)密度均增大，線粒體的腫脹、內室擴張等形態(tài)明顯好轉。由此可得出，銀杏葉提取物可維持神經(jīng)元細胞線粒體的數(shù)目和形態(tài)，改善線粒體水腫，改善線粒體損傷所引起的神經(jīng)退行性疾病。杲海霞等[36]通過檢測線粒體中脂質過氧化產物MDA、SOD和ATP的相關指標發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物可增加SOD的活性，減少MDA含量和ROS的過度損傷而提高線粒體的抗氧化作用，并通過提高Na+，K+-ATP和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性，ATP含量增加，腦內供能增加。

2.6 銀杏葉提取物對能量代謝影響 能量即生命的源泉，一切生命活動都需要能量。大腦占人體重的2%，但耗能卻占總能量的20%，由此可見能量對大腦的重要性。若大腦中能量代謝紊亂會引發(fā)神經(jīng)退行性疾病[37]。大腦主要利用葡萄糖供能，只有在長期饑餓狀態(tài)以脂肪代謝產物酮體來供能。研究表明AD患者中α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)活性明顯降低[38]，PD患者ATP水平降低。Goncalves等[39]通過體外暴露于6-羥基多巴胺(6-OHDA)模擬PD效應，發(fā)現(xiàn)皮質腦片出現(xiàn)了與氧化磷酸化和能量途徑相關的乳酸脫氫酶(LDH)的活性增加。周春霞等[40]通過建立心肌缺血/再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物中活性成分GB能提高ATP酶活性，降低缺血/再灌注模型組的LDH活力，提高Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力，進而調節(jié)細胞內外離子平衡尤其是Ca2+穩(wěn)態(tài)，改善心肌組織的能量代謝障礙。

3 小結

神經(jīng)退行性疾病會降低病人的生活質量，給患者家庭帶來嚴重的經(jīng)濟負擔，給社會醫(yī)療帶來了巨大的壓力。目前銀杏葉提取物可以通過改減少Aβ沉積，減輕神經(jīng)炎癥，抗氧化，抗凋亡，改善線粒體功能、能量代謝等途徑保護神經(jīng)，通過此機制將會為神經(jīng)退行性疾病靶向藥物的開發(fā)提供新思路。銀杏葉提取物對神經(jīng)元的保護作用與抗氧化、改善線粒體、改善能量代謝等機制存在著內在的聯(lián)系，因此進一步探究銀杏葉提取物對神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療具有重要意義。