腺相關(guān)病毒在視覺(jué)系統(tǒng)神經(jīng)示蹤及眼科治療中的應(yīng)用進(jìn)展

蔡丹瑞，沈吟,2

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院眼科中心，武漢430060； 2.武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院，武漢430071)

由于腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的神經(jīng)元種類數(shù)目繁雜且突觸連接復(fù)雜，人們對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究較為困難。視網(wǎng)膜和中樞神經(jīng)系統(tǒng)在胚胎發(fā)育過(guò)程中均是由神經(jīng)管發(fā)育而來(lái)，視網(wǎng)膜可視為活體個(gè)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，因此視網(wǎng)膜不僅可作為視覺(jué)系統(tǒng)的首站處理系統(tǒng)，其結(jié)構(gòu)功能的變化在一定程度上也可作為評(píng)估中樞神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)變化的窗口[1]。為了進(jìn)一步探究神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、成熟以及疾病的病理改變，視覺(jué)及其他神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)的清晰構(gòu)建必不可少。為實(shí)現(xiàn)神經(jīng)環(huán)路的示蹤，科學(xué)家們嘗試了多種示蹤方法，包括電鏡、Golgi鍍銀法以及熒光染料法(如熒光金、固藍(lán)、核黃)等[2]，但這些方法局限性較強(qiáng)，有方向不特異、不能跨突觸或跨突觸后信號(hào)衰減顯著等缺點(diǎn)，不能滿足人們對(duì)示蹤工具的需求。近年來(lái)，以病毒為載體的環(huán)路示蹤、基因編輯、基因治療等技術(shù)由于靶向性高、組織親嗜性好等原因逐漸走進(jìn)人們的視野[3]。腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)因其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)在逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、狂犬病毒等病毒載體中脫穎而出，得到廣泛研究和應(yīng)用?，F(xiàn)就AAV在視覺(jué)系統(tǒng)神經(jīng)示蹤、遺傳性疾病的損傷修復(fù)以及眼科相關(guān)基因治療中的應(yīng)用進(jìn)展予以綜述。

1 AAV概述

1.1AAV的血清型 AAV是無(wú)包膜的單鏈線狀DNA復(fù)制缺陷型病毒，需要在輔助病毒(如腺病毒、單純皰疹病毒)存在的條件下才能復(fù)制增殖。目前發(fā)現(xiàn)來(lái)自人的AAV血清型有12種，來(lái)自非人靈長(zhǎng)類的AAV有100多種，不同血清型的AAV由于衣殼蛋白不同，對(duì)不同組織的感染效率不同[4]。在眼科中常用的AAV血清型至少有9種，不同血清型AAV由于衣殼蛋白不同，對(duì)視網(wǎng)膜不同細(xì)胞的趨向性也有所不同，其中AAV1、AAV2、AAV5型易感染視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；AAV2、AAV5、AAV2/7、AAV2/8型易感染光感受器細(xì)胞；AAV2/9型易感染Müller細(xì)胞；AAV2、重組AAV(recombinant AAV,rAAV)2/2、rAAV2/6型易感染視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[5-6]。AAV2型是目前發(fā)現(xiàn)最早、使用最多、研究最清楚的AAV，但仍存在對(duì)許多組織、細(xì)胞的感染效率不高等缺點(diǎn)，促使人們?cè)谝曈X(jué)系統(tǒng)神經(jīng)環(huán)路示蹤中嘗試運(yùn)用不同血清型感染。有研究者在視網(wǎng)膜下注射AAV2和AAV5導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和光感受器細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而注射AAV4和AAV1只會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染[7-8]。玻璃體腔注射AAV2可導(dǎo)致高效的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，注射AAV8和AAV9可以侵染各層細(xì)胞，而注射AAV1、AAV4和AAV5無(wú)法檢測(cè)到表達(dá)[9]。

1.2AAV的應(yīng)用優(yōu)勢(shì) 與傳統(tǒng)示蹤劑相比，AAV具有顯著優(yōu)勢(shì)。首先，作為病毒載體AAV具有能轉(zhuǎn)染細(xì)胞組織并復(fù)制擴(kuò)散病毒的天然屬性；其次，與其他嗜神經(jīng)病毒相比，AAV具有宿主范圍廣、無(wú)致病性、低免疫性、轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率高且時(shí)間長(zhǎng)以及分裂期或非分裂期的細(xì)胞均能被感染等優(yōu)良特性，在實(shí)際應(yīng)用中科研工作者們可根據(jù)不同的需求對(duì)AAV進(jìn)行包括安全性、載體容量、轉(zhuǎn)染效率以及免疫反應(yīng)等方面的改造[10-11]，以更好地滿足實(shí)驗(yàn)或臨床需求。AAV作為一種安全性高、使用范圍廣的病毒載體廣泛應(yīng)用于神經(jīng)環(huán)路示蹤和基因治療等方面，不僅可通過(guò)攜帶熒光蛋白等特殊元件標(biāo)識(shí)出視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)和視覺(jué)系統(tǒng)神經(jīng)環(huán)路，還在治療某些遺傳性眼科疾病及外傷性視神經(jīng)損傷中取得了顯著成效[12-13]。

2 AAV對(duì)視覺(jué)系統(tǒng)神經(jīng)環(huán)路的標(biāo)記

視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞是視覺(jué)傳導(dǎo)通路的起點(diǎn)，在接受光刺激后將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，經(jīng)中間神經(jīng)元雙極細(xì)胞整合編碼后傳遞至神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，然后以動(dòng)作電位的形式將視覺(jué)信息依次經(jīng)軸突-視神經(jīng)(顱神經(jīng)Ⅱ)-視交叉-視神經(jīng)束-外側(cè)膝狀體，再經(jīng)視放射投射到大腦距狀溝周圍的枕葉皮質(zhì)(視覺(jué)中樞)[14]，這是視覺(jué)信息經(jīng)整合編碼、神經(jīng)傳導(dǎo)、中樞投射，最終形成視覺(jué)圖像的整個(gè)通路，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)的病變均可導(dǎo)致視覺(jué)功能障礙。因此，深入研究視覺(jué)傳導(dǎo)通路中各個(gè)環(huán)節(jié)的突觸連接狀態(tài)至關(guān)重要，而完整清晰地標(biāo)記這一通路是整個(gè)研究的基礎(chǔ)。

Stieger等[15]分別給大鼠和狗的視網(wǎng)膜下注射AAV2/8-綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，結(jié)果在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層、光感受器細(xì)胞、內(nèi)核層細(xì)胞以及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層均可見(jiàn)GFP表達(dá)，表明AAV8對(duì)視網(wǎng)膜各層細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均較好；進(jìn)一步觀察神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的中樞投射情況發(fā)現(xiàn)，注射病毒2個(gè)月后的大鼠，在視神經(jīng)、視交叉、視交叉上核、視束、腹外側(cè)膝狀核、背外側(cè)膝狀核、上丘等視覺(jué)通路中均可見(jiàn)強(qiáng)的GFP信號(hào)，但在視覺(jué)通路外未檢測(cè)到GFP信號(hào)。Delwig等[16]通過(guò)在Opn4-Cre小鼠的玻璃體腔中注射AAV-flex-plap病毒，特異性標(biāo)記小鼠眼中的內(nèi)在光敏感性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞并確定其投射的網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其投射的大腦核團(tuán)包括基底前腦、下丘腦、杏仁核以及丘腦和中腦的多個(gè)核團(tuán)，光敏感性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞能夠表達(dá)黑視蛋白并與調(diào)節(jié)生理節(jié)律的視交叉上核存在密切的神經(jīng)投射關(guān)系，主要對(duì)機(jī)體的晝夜節(jié)律、周期節(jié)律、情緒以及行為進(jìn)行調(diào)控。AAV的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)、低免疫性以及可攜帶多種標(biāo)簽等優(yōu)點(diǎn)，加上某些血清型的高感染效率，使得AAV在不跨突觸的示蹤病毒中具有顯著優(yōu)勢(shì)，可結(jié)合cre-loxp系統(tǒng)對(duì)視覺(jué)系統(tǒng)中某些特殊類型的細(xì)胞及其投射和功能進(jìn)行探究。

3 AAV與常間回文重復(fù)序列叢集/常間回文重復(fù)序列叢集關(guān)聯(lián)蛋白系統(tǒng)相結(jié)合對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞進(jìn)行基因組修飾

3.1常間回文重復(fù)序列叢集/常間回文重復(fù)序列叢集關(guān)聯(lián)蛋白(clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPR-associated proteins，CRISPR/Cas)系統(tǒng)的工作原理 不同血清型的AAV在視覺(jué)系統(tǒng)環(huán)路示蹤中的應(yīng)用具有顯著優(yōu)勢(shì)，可以清楚地觀察到細(xì)胞在環(huán)路中的功能。近年來(lái)，將AAV與CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)相結(jié)合成為眼科基因治療研究的新靶點(diǎn)。CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種原核生物的免疫系統(tǒng)，用來(lái)抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵，可以識(shí)別出外源DNA，并切割沉默外源基因的表達(dá)，與真核生物中RNA干擾的原理相似，正是由于這種精確的靶向功能，CRISPR/Cas系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)成一種高效的基因編輯工具[17]。在自然界中，CRISPR/Cas系統(tǒng)擁有多種類別，其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)是研究最深入、應(yīng)用最成熟的一種。目前已報(bào)道的3種將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)視網(wǎng)膜的方法中，AAV載體是將CRISPR組分遞送至視網(wǎng)膜最理想有效的基因轉(zhuǎn)移工具[18]。

3.2AAV載體在CRISPR/Cas系統(tǒng)中的應(yīng)用 目前將CRISPR/Cas系統(tǒng)有效遞送到體內(nèi)的方式主要有3種，即流體動(dòng)力注射法、脂質(zhì)體納米顆粒法和病毒載體轉(zhuǎn)染法，在病毒遞送系統(tǒng)中rAAV由于血清特異性高和免疫反應(yīng)低成為使用最廣泛的系統(tǒng)[19-20]。Hung等[18]為了評(píng)估AAV2裝載CRISPR/Cas用于體內(nèi)視網(wǎng)膜細(xì)胞基因修飾的可行性，構(gòu)建了裝載化膿性鏈球菌Cas9的AAV2載體以及另一種在紅色熒光蛋白存在下遞送針對(duì)黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)或LacZ基因(對(duì)照)的向?qū)NA，向Thy1-YFP品系小鼠眼內(nèi)注射AAV2- Cas9后發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜中的YFP表達(dá)顯著減少。Yu等[21]在動(dòng)物視網(wǎng)膜下腔注射攜帶pV-Cas9或pV-sgRNA-tdTomato的AAV，通過(guò)視網(wǎng)膜熒光染色鋪片、流式細(xì)胞學(xué)、目標(biāo)DNA的高通量測(cè)序、視網(wǎng)膜電流圖(electroretinogram，ERG)、視動(dòng)反應(yīng)等多種技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，證明AAV載體法是最有效的體內(nèi)視網(wǎng)膜基因編輯途徑。利用AAV-CRISPR/Cas9進(jìn)行體細(xì)胞基因編輯已成功應(yīng)用于非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的視網(wǎng)膜基因改造，McCullough等[22]通過(guò)AAV遞送的CRISPR/Cas9特異性地敲除視網(wǎng)膜鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶-1基因在獼猴視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞中的表達(dá)，顯著改變了視網(wǎng)膜的功能和結(jié)構(gòu)，成功顯示了使用AAV-CRISPR/Cas9在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中進(jìn)行體細(xì)胞基因編輯的能力。

遺傳性視網(wǎng)膜疾病(inherited retinal diseases，IRDs)是一組致病基因超過(guò)250個(gè)的臨床和遺傳異質(zhì)性疾病，其中最常見(jiàn)的為視網(wǎng)膜色素變性，目前第一個(gè)基因補(bǔ)充療法已被批準(zhǔn)用于常染色體隱性突變的IRDs[23]，但對(duì)于常染色體顯性突變的IRDs，基因補(bǔ)充治療并不適用。在這種情況下，由AAV作為病毒載體介導(dǎo)的CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)成為了治療新方法，治療策略主要包括通過(guò)非同源末端鏈接沉默或刪除致病基因，CRISPR激活增強(qiáng)功能缺失的基因的表達(dá)，利用同源重組修正或引入正確基因替代突變的致病基因[24-25]。目前，CRISPR技術(shù)在眼科中的應(yīng)用包括先天性白內(nèi)障、先天性青光眼、先天性角膜營(yíng)養(yǎng)不良等遺傳性眼病，未來(lái)其將為眼科遺傳性疾病的治療提供更多可能性。

4 AAV在視網(wǎng)膜相關(guān)遺傳性疾病基因治療中的應(yīng)用

4.1基因治療在遺傳性眼病中的應(yīng)用 遺傳性眼科疾病是目前主要威脅兒童和青少年的致盲性眼病，約占所有致盲因素的50%，在遺傳性眼科疾病中危害最大的為IRDs，目前全球IRDs致盲人數(shù)約1 700 萬(wàn)[26]，其中常見(jiàn)的疾病包括視網(wǎng)膜色素變性(40%)、錐-桿細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良(10%)、Usher綜合征(10%)以及Leber先天性黑矇(Leber′s congenital amaurosis，LCA)(5%)等[27]。IRDs的危害主要包括疾病種類繁多、失明風(fēng)險(xiǎn)極大、有可能遺傳給下一代以及目前絕大多數(shù)通過(guò)傳統(tǒng)方法很難治愈。

隨著人類基因組的解鎖以及基因測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對(duì)無(wú)法用藥物和手術(shù)等傳統(tǒng)治療手段治愈的由基因突變引起的遺傳性疾病開(kāi)始嘗試用基因治療?；蛑委熗ㄟ^(guò)病毒載體將調(diào)控基因?qū)塍w內(nèi)，以補(bǔ)償或矯正缺陷基因的功能，達(dá)到治療遺傳性疾病的目的[28]。在眼科遺傳性疾病研究中，向眼部注入健康基因修復(fù)突變已成為先天性和退行性失明最具潛力的治療途徑[29]。與傳統(tǒng)療法相比，基因治療的優(yōu)勢(shì)不僅是緩解病癥而是從根本上治愈疾病。AAV因低免疫原性、高安全性等優(yōu)勢(shì)成為臨床最適用、最受關(guān)注的基因治療相關(guān)的病毒載體。

AAV載體轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜主要通過(guò)玻璃體腔注射和視網(wǎng)膜下腔注射兩種方式，其中玻璃體腔注射主要轉(zhuǎn)染神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和Müller細(xì)胞，視網(wǎng)膜下腔注射主要轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和光感受器細(xì)胞[30]。目前在基因治療的應(yīng)用中，AAV2和AAV5載體最為常用，AAV2具有親神經(jīng)性、優(yōu)先轉(zhuǎn)染神經(jīng)元、能有效轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、表達(dá)持久等優(yōu)點(diǎn)，而AAV5主要轉(zhuǎn)染光感受器和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞[31]。

4.2AAV載體在視網(wǎng)膜色素變性中的應(yīng)用 視網(wǎng)膜色素變性是IRDs中最常見(jiàn)的一類疾病，這是一組以進(jìn)行性視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞功能喪失為主要特征的遺傳性視網(wǎng)膜退行性病變，其病理過(guò)程為視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的先后凋亡以及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞變性導(dǎo)致的夜盲、進(jìn)行性視野缺損、眼底骨細(xì)胞樣色素沉著以及ERG波形振幅減弱[32]，遺傳方式主要有常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳和X連鎖隱性遺傳三種[33]。目前臨床上常用的包括營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)在內(nèi)的藥物的療效均十分有限，基因治療的日益成熟為視網(wǎng)膜色素變性的治愈提供了極大可能。目前基因治療視網(wǎng)膜色素變性主要采用AAV介導(dǎo)的基因替代療法，即將正?；?qū)胍暰W(wǎng)膜靶細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生正常的視網(wǎng)膜基因表現(xiàn)型[34]。Wang等[35]在視網(wǎng)膜色素變性小鼠的免疫反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，在視錐細(xì)胞變性過(guò)程中存在小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，于是通過(guò)視網(wǎng)膜下腔注射腺相關(guān)載體AAV8和編碼小膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)信號(hào)的可溶性CX3C趨化因子配體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射AAV8-可溶性CX3C趨化因子配體后可顯著升高小鼠的視錐細(xì)胞存活率且不影響小膠質(zhì)細(xì)胞的定位或炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平。由桿狀磷酸二酯酶6A(phosphodiesterase 6A，PDE6A)基因突變引起的43型視網(wǎng)膜色素變性始于視桿細(xì)胞的功能障礙，隨后是整個(gè)視網(wǎng)膜外核層的進(jìn)行性退化；針對(duì)PDE6A基因補(bǔ)充治療方法，Sch?n等[36]開(kāi)發(fā)了一種新的AAV用于人視紫紅質(zhì)啟動(dòng)子控制下表達(dá)人PDE6A基因的載體rAAV8-PDE6A，并分別在注射后1個(gè)月和6個(gè)月進(jìn)行短程效果和長(zhǎng)程效果的檢測(cè)；在體內(nèi)，通過(guò)ERG評(píng)估生物功能以及光學(xué)相干斷層掃描觀察視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，生物功能和視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)均有顯著改善；在體外，小鼠桿狀光感受器中PDE6A蛋白的表達(dá)總體穩(wěn)定且高效，同時(shí)核外核層厚度和桿狀外段結(jié)構(gòu)均得到較好的形態(tài)學(xué)保護(hù)。

4.3AAV載體在LCA中的應(yīng)用 LCA呈常染色體隱性遺傳，是發(fā)病時(shí)間最早也是最嚴(yán)重的遺傳性視網(wǎng)膜病變，常于出生后1年內(nèi)發(fā)病，因眼球震顫、固視困難、畏光、患兒自主按壓眼球等癥狀引起家人的注意而就診。眼底檢查早期多無(wú)異常，隨著病程的發(fā)展眼底可見(jiàn)椒鹽樣色素沉著、血管狹窄、骨細(xì)胞樣色素沉著、廣泛色素上皮細(xì)胞凋亡和脈絡(luò)膜收縮等，ERG表現(xiàn)為波幅低平甚至消失[37]。LCA是首個(gè)基因治療的遺傳性眼病，美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)Luxturna用于治療LCA，其針對(duì)的是由RPE65這個(gè)基因位點(diǎn)突變導(dǎo)致的LCAⅡ型，約占LCA的6%[38]。在大量臨床前研究的基礎(chǔ)上，2007年美國(guó)和英國(guó)的研究人員啟動(dòng)了LCA患者基因治療的臨床試驗(yàn)，并于2008年報(bào)道了基因治療能挽救患者部分視覺(jué)功能的初步成果[39-41]。隨后出現(xiàn)了更多的臨床試驗(yàn)，其中包括2012年Jacobson等[42]開(kāi)展的對(duì)15例LCA青少年和成人進(jìn)行的基因治療后3年的跟蹤隨訪。Luxturna 通過(guò)rAAV將正確的RPE65基因?qū)胙鄄?，產(chǎn)生有功能的蛋白，恢復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞的功能，從而恢復(fù)喪失的視力；Luxturna曾獲得美國(guó)食品藥品管理局頒發(fā)的孤兒藥資格與突破性療法認(rèn)定[43]。

5 小 結(jié)

作為有希望長(zhǎng)期在體應(yīng)用的病毒載體，AAV在基因治療中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，已從試驗(yàn)階段走向臨床應(yīng)用，但同時(shí)也存在一些潛在的問(wèn)題，如基因沉默導(dǎo)致的治療失敗、患癌風(fēng)險(xiǎn)增加等。rAAV作為人類基因治療最有希望的載體，已用于許多臨床試驗(yàn)，最能體現(xiàn)其力量和潛力的是基于野生型AAV血清型的3種基因治療產(chǎn)品，即Glybera(AAV1)、Luxturna(AAV2)和最近的Zolgensma(AAV9)。Luxturna的大多數(shù)報(bào)告顯示，Luxturna可能不能恢復(fù)正常視力，只有約一半的治療患者符合美國(guó)食品藥品管理局的最低限度改善閾值，且改善可能不會(huì)長(zhǎng)期持續(xù)[43]。目前AAV載體的產(chǎn)生需要改進(jìn)轉(zhuǎn)導(dǎo)效力、抗體逃避和細(xì)胞/組織特異性，以允許使用更低和更安全的載體劑量。