膿毒癥時(shí)肝細(xì)胞自噬的相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展

劉奇，趙洪強(qiáng)，李為民

(解放軍總醫(yī)院肝膽胰外科醫(yī)學(xué)部，北京 100853)

膿毒癥是宿主對(duì)感染的免疫反應(yīng)失控而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙，全球每年新發(fā)病例超過1 800萬，發(fā)病率從1.5%上升至8%[1]，且發(fā)達(dá)國家的病死率仍較高。抗炎和促炎反應(yīng)失衡導(dǎo)致的細(xì)胞因子風(fēng)暴是膿毒癥的主要致病機(jī)制。膿毒癥期間，入侵的細(xì)菌及其產(chǎn)物首先被肝細(xì)胞捕獲并清除，同時(shí)肝免疫細(xì)胞釋放促炎介質(zhì)，可能導(dǎo)致急性肝損傷[2]。肝損傷或功能障礙被認(rèn)為是膿毒癥的早期事件，可能嚴(yán)重影響疾病的發(fā)展[3]。在膿毒癥所涉及的器官衰竭(肺、心、腎等)中，肝功能障礙是一個(gè)強(qiáng)有力的獨(dú)立死亡預(yù)測(cè)因子[4]。有證據(jù)表明，急性肝功能不全和肝衰竭可能直接導(dǎo)致膿毒癥患者的疾病惡化和死亡，而改善肝損傷或恢復(fù)肝功能可能降低膿毒癥的發(fā)病率和病死率[5]。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者和膿毒癥小鼠模型中肝臟自噬體增加，且在膿毒癥小鼠模型中，抑制或阻斷肝臟自噬后，小鼠的死亡率增加，死亡時(shí)間縮短，表明自噬在膿毒癥中發(fā)揮了保護(hù)作用[6]。因此，研究膿毒癥時(shí)肝細(xì)胞自噬的機(jī)制對(duì)膿毒癥的治療有一定指導(dǎo)意義?，F(xiàn)就膿毒癥時(shí)肝細(xì)胞自噬的相關(guān)機(jī)制予以綜述，以為膿毒癥肝損傷的臨床診治提供新思路。

1 自噬的發(fā)生機(jī)制

自噬是一種進(jìn)化保守的降解系統(tǒng)，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器和脂質(zhì)以溶酶體依賴的方式被降解，在不同刺激下，該過程作為基本的自我保護(hù)機(jī)制被激活。根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體的途徑不同，自噬分為巨自噬、微自噬以及分子伴侶介導(dǎo)自噬三種類型，巨自噬指由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的膜包繞待降解物形成自噬體，然后與溶酶體融合并降解其內(nèi)容物；微自噬指溶酶體的膜直接包裹長壽命蛋白等，并在溶酶體內(nèi)降解；分子伴侶介導(dǎo)自噬指胞質(zhì)內(nèi)蛋白結(jié)合到分子伴侶后被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體腔中，然后被溶酶體酶消化。分子伴侶介導(dǎo)自噬的底物是可溶的蛋白質(zhì)分子，可選擇性地清除蛋白質(zhì)，而巨自噬和微自噬無明顯選擇性。通常所說的“自噬”指“巨自噬”。

自噬可以分解許多細(xì)胞質(zhì)底物，包括蛋白質(zhì)聚集物、受損的細(xì)胞器、碳水化合物、脂類、核酸和病原體，這些物質(zhì)反過來能再生代謝前體，如氨基酸、脂肪酸和核苷酸，以便在生物合成途徑中被重新利用，并在細(xì)胞存活中起重要作用。自噬基本步驟包括起始和成核、延伸、自噬體形成、自噬體-溶酶體融合和降解。分離膜最初在膜內(nèi)系統(tǒng)(如高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng))由Beclin-1/Vps34復(fù)合物啟動(dòng)，該復(fù)合物受Unc-51自噬激活激酶復(fù)合物調(diào)控，成核后，自噬相關(guān)蛋白(autophagy related protein，Atg)12-Atg5復(fù)合物和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)Ⅱ可能在自噬體形成中起重要作用，Atg12-Atg5復(fù)合物始終與吞噬細(xì)胞外膜結(jié)合，并在成熟的自噬體形成后分離，最終由LC3Ⅱ完成[7-10]。在這一過程中，成熟自噬體與溶酶體的融合是自噬性底物降解的關(guān)鍵；融合過程需要用到溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白1和溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白2[11-12]。自噬對(duì)于細(xì)胞的命運(yùn)和功能至關(guān)重要，自噬機(jī)制的啟動(dòng)對(duì)于細(xì)胞存活和功能具有重要意義，不僅可以清除受損的細(xì)胞器和異常的蛋白沉積，還可以提供額外的能量。

2 膿毒癥時(shí)肝細(xì)胞發(fā)生自噬的相關(guān)機(jī)制

2.1線粒體含F(xiàn)UN14域1(FUN14 domain containing 1，F(xiàn)UNDC1)/LC3Ⅱ自噬通路 線粒體作為腺苷三磷酸的主要來源，對(duì)于多種細(xì)胞內(nèi)過程至關(guān)重要，并在引發(fā)程序性細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用[13]，然而，線粒體受損會(huì)明顯破壞細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)，因此，保持線粒體的穩(wěn)態(tài)數(shù)量和質(zhì)量控制是治療各種疾病的前提，線粒體自噬是線粒體損傷后線粒體質(zhì)量控制的重要軸[14]。FUNDC1是位于線粒體外膜上的一種蛋白質(zhì)，作為線粒體吞噬受體，可清除在應(yīng)激和缺氧時(shí)功能失調(diào)的線粒體[15]。在正常情況下，F(xiàn)UNDC1被位于LC3相互作用區(qū)基序中的酪氨酸18位的Src激酶和酪蛋白激酶2磷酸化，抑制細(xì)胞中的線粒體自噬過程。在缺氧或其他危險(xiǎn)情況下，Src被滅活，F(xiàn)UNDC1被磷酸甘油酸變位酶5去磷酸化，導(dǎo)致FUNDC1和LC3Ⅱ之間的共定位及相互作用增加，最終形成包裹受損線粒體的隔離膜[16]。閆夢(mèng)瑩[17]的研究顯示，膿毒癥誘發(fā)小鼠肝損傷可能與抑制FUNDC1/LC3Ⅱ信號(hào)通路激活有關(guān)。Yan等[18]研究表明，2%氫氣吸入3 h可通過調(diào)節(jié)FUNDC1依賴的線粒體自噬減輕肝損傷，可能是敗血癥誘導(dǎo)肝損傷的有效治療策略。

2.2真核翻譯啟動(dòng)因子2α激酶4-真核翻譯啟動(dòng)因子2A/真核翻譯啟動(dòng)因子2α-激活轉(zhuǎn)錄因子4(EIF2AK4-EIF2A/eIF2α-ATF4)信號(hào)通路 黏附侵襲性大腸埃希菌參考菌株LF82感染人腸上皮T84細(xì)胞，可使磷酸-EIF2AK4、磷酸-EIF2A和ATF4水平升高；ATF4與LC3B、Beclin1、SQSTM1、Atg3和Atg7等自噬基因的啟動(dòng)子結(jié)合，可誘導(dǎo)腸細(xì)胞自噬基因轉(zhuǎn)錄和自噬反應(yīng)的發(fā)生，證明了ATF4可直接靶向自噬基因誘導(dǎo)細(xì)胞功能性自噬[19]；B′chir等[20]報(bào)道，Atg5和Atg16L1基因的轉(zhuǎn)錄也被EIF2A-ATF4信號(hào)通路激活誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，以應(yīng)對(duì)細(xì)胞應(yīng)激。Xiong等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖處理小鼠48 h后肝臟ATF4表達(dá)受到抑制，經(jīng)奧貝膽酸刺激處理后，ATF4的表達(dá)逆轉(zhuǎn)，推測(cè)奧貝膽酸可能激活A(yù)TF4依賴性細(xì)胞自噬。膿毒癥時(shí)，肝臟是否通過激活EIF2AK4-EIF2A/eIF2α-ATF4途徑誘導(dǎo)細(xì)胞功能性自噬仍需進(jìn)一步研究證明。

2.3溶酶體雷帕霉素機(jī)制性靶標(biāo)蛋白復(fù)合體2(mechanistic target of rapamycin complex 2，mTORC2)/1型蛋白磷酸酶Pleckstrin同源序列富亮氨酸重復(fù)片段蛋白磷酸酶[pleckstrin homology(PH)domain leucine-rich repeat protein phosphatase 1，PHLPP1]/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)自噬軸 基礎(chǔ)狀態(tài)下，抑制分子伴侶介導(dǎo)自噬活性的內(nèi)源性機(jī)制為mTORC2通過磷酸化溶酶體相關(guān)Akt負(fù)向調(diào)控溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白2A組裝進(jìn)入分子伴侶介導(dǎo)自噬易位復(fù)合物，進(jìn)而抑制分子伴侶介導(dǎo)自噬，部分負(fù)向調(diào)控通過神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白的磷酸化完成；應(yīng)激條件下，分子伴侶介導(dǎo)自噬的活化則通過募集PHLPP1(對(duì)Akt去磷酸化)與GTPaseRac1(在膜上穩(wěn)定PHLPP1)降低Akt去磷酸化的活性，從而增加溶酶體膜上分子伴侶介導(dǎo)自噬易位復(fù)合物的穩(wěn)定性，增強(qiáng)分子伴侶介導(dǎo)自噬，提示分子伴侶介導(dǎo)自噬的激活受溶酶體Akt磷酸化狀態(tài)的調(diào)控[22]。根據(jù)Wells等[23]對(duì)感染埃立克體所致膿毒癥和肝炎性損傷小鼠模型的研究顯示，Ⅰ型干擾素通過誘導(dǎo)自噬損害抗細(xì)菌免疫，埃立克體可利用自噬蛋白質(zhì)維持自身的生存和復(fù)制，證實(shí)了Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的Akt/mTORC2自噬軸是小鼠肝細(xì)胞先天性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，為治療膿毒癥期間炎癥和肝損傷提供了理論依據(jù)。

2.4Parkin和Bcl-2/腺病毒E1B 19 kDa結(jié)合蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa-interacting protein 3，BNIP3)介導(dǎo)的線粒體自噬通路 大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，PINK1和Parkin在介導(dǎo)經(jīng)典線粒體自噬途徑中起主要作用，PINK1作為線粒體損傷的傳感器，能夠在受損線粒體外膜上積累誘導(dǎo)Parkin從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到受損線粒體[24]。BNIP3是一種Bcl-2相關(guān)蛋白，可誘導(dǎo)線粒體功能障礙和隨后的細(xì)胞死亡。研究表明，BNIP3能與PINK1相互作用抑制其裂解，導(dǎo)致Parkin招募增加和線粒體清除增強(qiáng)[25]。Park等[26]的研究顯示，盲腸結(jié)扎穿孔誘導(dǎo)膿毒癥小鼠的肝臟PINK1蛋白表達(dá)水平升高，而Parkin和BNIP3蛋白表達(dá)水平降低，血紅素加氧酶-1可減弱上述變化，表明血紅素加氧酶-1增強(qiáng)了Parkin和BNIP3介導(dǎo)的線粒體自噬，可能是膿毒癥肝損傷治療的新方向。

2.5叉頭框蛋白(forkhead box protein，F(xiàn)ox)O1介導(dǎo)的自噬 應(yīng)激條件下，F(xiàn)oxO1被乙?；せ睿瑓⑴c自噬誘導(dǎo)，F(xiàn)oxO1通過與sirtuin-2(一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸+依賴的組蛋白去乙?；?解離而乙?；⑴cAtg7結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[27]。Lee等[28]的研究表明，CAPP-112(新合成的組蛋白去乙?；敢种苿?可通過激活FoxO1介導(dǎo)的自噬改善盲腸結(jié)扎穿孔誘導(dǎo)的膿毒性損傷。

2.6鈣蛋白酶系統(tǒng) 鈣蛋白酶是Ca2+依賴性半胱氨酸蛋白酶，參與各種青藤堿鹽酸鹽生物學(xué)事件，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、細(xì)胞凋亡和自噬。鈣蛋白酶1和鈣蛋白酶2(鈣蛋白酶的兩種主要類型)的活性分別受Ca2+水平的調(diào)節(jié)，因此，Ca2+穩(wěn)態(tài)的失調(diào)會(huì)影響鈣蛋白酶活性，導(dǎo)致器官損傷[29]。在整個(gè)自噬過程中，鈣蛋白酶系統(tǒng)通過直接切割A(yù)tg蛋白來抑制自噬進(jìn)展[30-31]。Jiang等[32]的研究顯示，同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶2過表達(dá)通過抑制鈣蛋白酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加自噬通量，并恢復(fù)盲腸結(jié)扎穿孔誘導(dǎo)的小鼠肝臟中的自噬體和自體溶酶體形成，通過恢復(fù)自噬改善敗血癥誘導(dǎo)的肝損傷，可能是膿毒癥臨床治療的有效靶標(biāo)。

卡馬西平作為一種抗癲癇藥物，膿毒癥時(shí)可能通過完全激活自噬保護(hù)肝臟[33]，還可通過激活自噬途徑減輕表達(dá)折疊突變體1-抗胰蛋白酶Z小鼠的肝損傷程度[34]。Kim等[35]的研究表明，卡馬西平可通過防止鈣超載與鈣蛋白酶的激活，抑制缺血再灌注損傷小鼠肝細(xì)胞中Atg7和Beclin-1消耗所致的自噬缺陷。在膿毒癥時(shí)，卡馬西平激活自噬的作用及機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

2.7AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)-S期激酶關(guān)聯(lián)蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2，SKP2/p45)-輔激活蛋白關(guān)聯(lián)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(coactivatorassociated arginine methyltransferase 1，CARM1)自噬軸 CARM1是哺乳動(dòng)物自噬的重要組成部分，在營養(yǎng)缺乏的條件下，細(xì)胞核中FoxO3a的AMPK依賴性磷酸化抑制SKP2，導(dǎo)致精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1蛋白水平以及H3 Arg17二甲基化的增加。全基因組分析顯示，精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1通過轉(zhuǎn)錄因子EB在自噬相關(guān)和溶酶體基因上發(fā)揮轉(zhuǎn)錄共激活因子功能，在營養(yǎng)缺乏條件下，AMPK-SKP2-CARM1軸被確定為調(diào)控自噬誘導(dǎo)過程中新的信號(hào)軸[36]。Inata等[37]研究表明，AMPK對(duì)膿毒癥期間肝臟代謝的恢復(fù)非常重要，其功能可能隨年齡的增長而減弱，因此藥物激活A(yù)MPK可能具有治療作用。膿毒癥時(shí)，AMPK能否通過激活A(yù)MPK-SKP2-CARM1自噬軸對(duì)肝臟起保護(hù)作用仍需進(jìn)一步探討。

2.8高遷移率族蛋白B1介導(dǎo)的自噬 高遷移率族蛋白B1作為自噬調(diào)節(jié)因子，通過結(jié)合Beclin-1促進(jìn)自噬[38-39]。細(xì)胞核和細(xì)胞外的高遷移率族蛋白B1分別通過調(diào)節(jié)熱激蛋白β1和結(jié)合晚期糖基化終末產(chǎn)物受體的表達(dá)維持自噬[40-41]。孫健等[42]的研究表明，膿毒癥時(shí)，高遷移率族蛋白B1可介導(dǎo)自噬，從而調(diào)控白細(xì)胞介素-1β，減輕肝細(xì)胞損傷，促進(jìn)肝臟功能的恢復(fù)。

2.9Beclin-1自噬效應(yīng)因子 Beclin-1是最早發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物自噬效應(yīng)因子之一[43-44]。純合缺失Beclin-1基因可導(dǎo)致早期胚胎發(fā)育不良[45]。Beclin-1通過與PtdIns(3)-kinase (Vps34)相互作用，在自噬啟動(dòng)過程中起作用，參與啟動(dòng)自噬的成核步驟，開始自噬通量，并參與自噬體與溶酶體融合的后續(xù)步驟[46-49]。Lee等[50]的研究表明，在盲腸結(jié)扎穿孔誘導(dǎo)的多菌性膿毒癥小鼠模型中，一氧化碳依賴自噬蛋白Beclin-1誘導(dǎo)自噬提高了小鼠的存活率，故認(rèn)為一氧化碳可能是一種新的敗血癥治療手段。

2.10其他機(jī)制 甲潑尼龍[51]、霉酚酸酯[52]、京尼平[53]、青藤堿鹽酸鹽[54]、雌激素[55]均可誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬，改善膿毒癥時(shí)肝損傷，但具體機(jī)制尚不明確。自噬通過對(duì)特定細(xì)胞器的質(zhì)量控制，在抵御各種疾病方面顯示出巨大優(yōu)勢(shì)，從而維持細(xì)胞的生存和功能。此外，多個(gè)細(xì)胞器之間的相互作用也與膿毒癥發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[56]。

3 小 結(jié)

自噬是肝細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的策略之一，也是抵御應(yīng)激狀態(tài)下肝損傷的手段[57]。膿毒癥為宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)，伴有多器官功能障礙和高死亡率，是重癥監(jiān)護(hù)病房患者預(yù)后差的主要原因。膿毒癥引發(fā)復(fù)雜的免疫反應(yīng)，伴隨著促炎和抗炎反應(yīng)同時(shí)發(fā)生，大多數(shù)膿毒癥患者在最初的炎癥反應(yīng)后很快進(jìn)入持久的免疫抑制期，這可能是造成不良后果的主要原因。因此，恢復(fù)宿主炎癥反應(yīng)的平衡和維持細(xì)胞命運(yùn)在膿毒癥的治療中具有重要意義。自噬因清除細(xì)胞內(nèi)異常蛋白的能力及其在多細(xì)胞器質(zhì)量控制中的作用而被認(rèn)為是膿毒癥潛在的治療靶點(diǎn)，在清除病原體與維持病原體或其相關(guān)產(chǎn)物(如病毒DNA或脂多糖)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的平衡中起重要作用，缺乏自噬會(huì)導(dǎo)致感染失控和過度炎癥，兩者均是膿毒癥發(fā)生的主要原因。