轉(zhuǎn)錄因子Sox2對(duì)視網(wǎng)膜發(fā)育和功能的影響及作用

沈雨濛，沈吟

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院眼科中心，武漢 430060)

轉(zhuǎn)錄因子Sox2(sex determining region Y-box 2)由定位于第3號(hào)常染色體長(zhǎng)臂26區(qū)3帶至27區(qū)(q26.3～q27)的Sox2基因編碼表達(dá)[1]，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在，功能涉及眼發(fā)育、性別決定、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等方面[2]。Sox2在胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化的多個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，對(duì)未分化的胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等的再生能力及干細(xì)胞的多能性至關(guān)重要，可在胚胎發(fā)育最早期開(kāi)始起作用[3-4]。除具有維持細(xì)胞發(fā)育及細(xì)胞干性功能外，Sox2還兼具影響新陳代謝、增殖、凋亡與化學(xué)抵抗、侵蝕、腫瘤的成瘤和細(xì)胞的遷移等作用。

有研究表明，Sox2缺乏會(huì)引起成年小鼠神經(jīng)退行性病變和神經(jīng)損傷[5]。人眼中由Sox2基因缺陷引起的眼部病變具有非常典型的特征，統(tǒng)稱為Sox2無(wú)眼球綜合征，其臨床表現(xiàn)除先天性小眼和無(wú)眼畸形外，還伴有先天性食管閉鎖、生殖系統(tǒng)異常、腦部發(fā)育異常、垂體發(fā)育不全等[6-7]。先天性小眼癥和無(wú)眼癥是一種少見(jiàn)的眼球發(fā)育缺陷，有資料顯示，先天性小眼癥的患病率約為3/10萬(wàn)，先天性無(wú)眼癥為14/10萬(wàn)[8]。Sox2是目前唯一明確的引起先天性小眼癥和無(wú)眼癥的單基因突變致病基因[8]。目前，對(duì)Sox2 無(wú)眼球綜合征的研究尚處于臨床病例收集和匯總階段，對(duì)其致病機(jī)制的研究非常有限[9-10]。全面認(rèn)識(shí)Sox2對(duì)視網(wǎng)膜發(fā)育和功能的影響，有助于眼科醫(yī)師研究與其相關(guān)眼病的病理機(jī)制，為相關(guān)疾病的防治提供新思路。

1 Sox2基因敲除小鼠的視網(wǎng)膜表現(xiàn)

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均由一組放射狀的神經(jīng)前體細(xì)胞(neural progenitor cells，NPCs)發(fā)育形成。Sox2是高遷移率族蛋白轉(zhuǎn)錄激活因子(屬于SoxB1亞家族)的一員，在發(fā)育中和成熟后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的前體祖細(xì)胞干性的維持中發(fā)揮重要作用[11]。若Sox2功能在胚胎和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中受到損傷和破壞，將導(dǎo)致NPCs和成熟神經(jīng)元數(shù)量的減少[12]。目前，關(guān)于Sox2維持NPCs干性的機(jī)制尚未闡明。

在脊椎動(dòng)物中，視網(wǎng)膜中的六種神經(jīng)元細(xì)胞和一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均由視網(wǎng)膜前體細(xì)胞(retinal progenitor cells，RPCs)按照特定的時(shí)間順序發(fā)育形成[13]。為了確保視網(wǎng)膜中各種細(xì)胞發(fā)育成熟且細(xì)胞間比例正確，在整個(gè)視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程中均需保證RPCs干性的維持與分化之間的平衡，這種平衡通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)育的各種轉(zhuǎn)錄因子的共同協(xié)調(diào)實(shí)現(xiàn)，如具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)和同源盒家族的轉(zhuǎn)錄因子[14]。

轉(zhuǎn)錄因子Sox2在視網(wǎng)膜發(fā)育的各階段均有表達(dá)。在新生小鼠視網(wǎng)膜中，Sox2在RPCs中大量表達(dá)，隨著視網(wǎng)膜發(fā)育成熟，在出生4～10 d小鼠視網(wǎng)膜中可見(jiàn)，隨著視網(wǎng)膜明顯分層的逐漸出現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Sox2的表達(dá)也逐漸定位于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(ganglion cell layer，GCL)和內(nèi)核層(inner nuclear layer，INL)。在成年小鼠視網(wǎng)膜中，轉(zhuǎn)錄因子Sox2在GCL和INL穩(wěn)定表達(dá)，包括Müller細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞以及Glial膠質(zhì)細(xì)胞[15]。

有研究表明，敲除Sox2轉(zhuǎn)基因成年小鼠出現(xiàn)視神經(jīng)變細(xì)、視交叉結(jié)構(gòu)紊亂等發(fā)育不良現(xiàn)象，并且神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、水平細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、視桿雙極細(xì)胞、視桿光感受器細(xì)胞等各種類(lèi)型細(xì)胞的數(shù)量顯著減少；僅敲除一條染色體的Sox2基因時(shí)，上述現(xiàn)象較敲除兩條染色體Sox2基因時(shí)減輕，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子Sox2對(duì)視網(wǎng)膜發(fā)育的影響與其表達(dá)量呈正相關(guān)；此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Sox2通過(guò)直接調(diào)控Notch1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)影響視網(wǎng)膜的發(fā)育[16]。在Sox2突變小鼠中，Sox2的表達(dá)精確調(diào)節(jié)了RPCs的分化時(shí)間及其遷移位置[17]。在Sox2基因敲除小鼠中，NPCs異常分化且缺乏Sox2對(duì)Notch信號(hào)通路的激活，從而引起RPCs增殖減少，導(dǎo)致小眼癥[16]。另有研究表明，Sox2缺乏會(huì)引起成年小鼠神經(jīng)退行性病變和神經(jīng)損傷[5]。

2 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)RPCs的影響

RPCs在分化發(fā)育為各神經(jīng)元細(xì)胞的過(guò)程中需保持多能干性。維持RPCs中Sox2和人配對(duì)盒基因6(paired box gene 6，Pax6)含量的比例對(duì)維持RPCs的多能干性至關(guān)重要[18]。在人類(lèi)和小鼠的眼中，轉(zhuǎn)錄因子Pax6突變或過(guò)表達(dá)導(dǎo)致眼部表型異常，出現(xiàn)小眼癥、無(wú)眼癥、白內(nèi)障和無(wú)虹膜眼[19-23]。條件性敲除小鼠RPCs的Pax6將導(dǎo)致除γ-氨基丁酸能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞外的所有類(lèi)型視網(wǎng)膜細(xì)胞數(shù)量的減少；同時(shí)，Pax6在虹膜和睫狀體上皮中也高度表達(dá)，對(duì)于RPCs的發(fā)育和分化起重要作用[24-25]。視網(wǎng)膜Sox2水平自視網(wǎng)膜中央向邊緣逐漸降低，而視網(wǎng)膜中Pax6水平與Sox2的分布相反，自視網(wǎng)膜中央向邊緣逐漸升高[26]。有研究表明，抑制RPCs中Sox2活性時(shí)，RPCs中與神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(如Notch1)的表達(dá)急劇減少，導(dǎo)致RPCs神經(jīng)干性喪失，同時(shí)Pax6以及睫狀上皮(非神經(jīng)元)標(biāo)志物的表達(dá)水平升高，使本該發(fā)育為神經(jīng)元的細(xì)胞向睫狀體非神經(jīng)元上皮發(fā)育和分化[16,26]。因此，轉(zhuǎn)錄因子Sox2的正確表達(dá)是維持RPCs神經(jīng)干性不可或缺的因素，其缺失或表達(dá)減少均將引起RPCs異常分化，導(dǎo)致視網(wǎng)膜發(fā)育異常。

3 轉(zhuǎn)錄因子Sox2對(duì)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞發(fā)育的影響

3.1Müller細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程 在脊椎動(dòng)物出生后，視網(wǎng)膜中的RPCs主要分化為視桿光感受器細(xì)胞、雙極細(xì)胞和Müller細(xì)胞[14]，其中Müller細(xì)胞是唯一同時(shí)保持RPCs形態(tài)和類(lèi)似基因的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞[8,22,27]。Müller細(xì)胞是脊椎動(dòng)物視網(wǎng)膜中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其上端達(dá)外界膜，下端達(dá)內(nèi)界膜，貫穿視網(wǎng)膜全層。Müller細(xì)胞作為視網(wǎng)膜的支持細(xì)胞，對(duì)視網(wǎng)膜的神經(jīng)保護(hù)、營(yíng)養(yǎng)、代謝等起重要作用；同時(shí)，Müller細(xì)胞作為脊椎動(dòng)物視網(wǎng)膜的基礎(chǔ)膠質(zhì)細(xì)胞，是一種生理狀態(tài)下的靜止前體細(xì)胞，在生理穩(wěn)態(tài)條件下，Müller細(xì)胞具有維持視網(wǎng)膜正常結(jié)構(gòu)和提供神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)支持的功能。Müller細(xì)胞表達(dá)大量的前體細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，但仍保存前體細(xì)胞的形態(tài)，在視網(wǎng)膜出現(xiàn)損傷時(shí)被激活，可在一定程度上修復(fù)視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能。研究表明，Müller細(xì)胞的NPCs功能具有可逆性，當(dāng)視網(wǎng)膜受到損傷后，它們可以重新進(jìn)入細(xì)胞周期，并具有分化產(chǎn)生神經(jīng)元的潛力[28]。因此，Müller細(xì)胞被認(rèn)為是視網(wǎng)膜中潛在的NPCs，也是國(guó)內(nèi)外視網(wǎng)膜損傷治療關(guān)注的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。當(dāng)視網(wǎng)膜受到損傷后，Müller細(xì)胞將重新進(jìn)入細(xì)胞分裂周期[29]，這一過(guò)程涉及多種調(diào)控胚胎發(fā)育的信號(hào)通路，其中Notch信號(hào)通路非常關(guān)鍵，不僅調(diào)控了NPCs的功能，還調(diào)控了膠質(zhì)細(xì)胞的再生[30]。發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1/5是Notch通路下游的調(diào)控因子，不僅是出生后視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程中Müller細(xì)胞的重要標(biāo)志物，還在確定Müller細(xì)胞身份方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用[31]。發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1通過(guò)其持續(xù)的非振蕩表達(dá)調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的靜止?fàn)顟B(tài)，并可以防止細(xì)胞在靜止?fàn)顟B(tài)下進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)的分化周期[32]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的過(guò)程中，Notch1是Sox2的直接轉(zhuǎn)錄目標(biāo)[26]。在Sox2蛋白敲除新生小鼠視網(wǎng)膜中，Notch1和發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子5的表達(dá)減少，從而影響Müller細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞分裂周期。

3.2Sox2對(duì)Müller細(xì)胞發(fā)育的具體影響 在新生小鼠視網(wǎng)膜中，Müller細(xì)胞需要轉(zhuǎn)錄因子Sox2來(lái)阻止其最終的有絲分裂。在小鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中，條件性敲除轉(zhuǎn)錄因子Sox2的表達(dá)，將引起新生Müller細(xì)胞失去正常形態(tài)而呈放射狀或異常的細(xì)胞分裂狀態(tài)，其胞體原定位于網(wǎng)狀層，但敲除轉(zhuǎn)錄因子Sox2后，其胞體異常定位于核細(xì)胞層，并可能引起整個(gè)視網(wǎng)膜失去正常的結(jié)構(gòu)形態(tài)[15]。視網(wǎng)膜電圖結(jié)果顯示，條件性敲除小鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子Sox2，視網(wǎng)膜電圖b波的幅度較正常小鼠下降，說(shuō)明敲除轉(zhuǎn)錄因子Sox2后的視網(wǎng)膜整體功能受到了影響[33]。Gorsuch等[34]的研究表明，當(dāng)正常斑馬魚(yú)光損傷31 h后，其視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞大量增殖；利用嗎啉代使斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中Sox2表達(dá)減少后，Müller細(xì)胞的增殖大大減少，而重新在Müller細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Sox2后，Müller細(xì)胞的增殖又增多，可見(jiàn)轉(zhuǎn)錄因子Sox2是視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞增殖和發(fā)育過(guò)程中必不可少的重要轉(zhuǎn)錄因子。

4 轉(zhuǎn)錄因子Sox2對(duì)視網(wǎng)膜無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞發(fā)育的影響

4.1無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的分類(lèi)和發(fā)育過(guò)程 無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞是視網(wǎng)膜中的中間神經(jīng)元，其樹(shù)突分叉延伸至內(nèi)叢狀層，與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和(或)雙極細(xì)胞連接形成突觸，負(fù)責(zé)輸出雙極細(xì)胞的信息，特異性很高。根據(jù)樹(shù)突形態(tài)和層級(jí)分類(lèi)可至少將無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞分為33種不同的亞型，各型無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞通過(guò)釋放一種或多種神經(jīng)遞質(zhì)與其他視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞相聯(lián)系。根據(jù)無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞釋放的神經(jīng)遞質(zhì)的種類(lèi)可以分為γ-氨基丁酸能、甘氨酸能或其他類(lèi)型無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞。γ-氨基丁酸能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞通常細(xì)胞胞體較大，主要分布在視網(wǎng)膜GCL和INL，目前對(duì)星形無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞(一種γ-氨基丁酸能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞)的研究較多，星形無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞以釋放膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶為特征，被認(rèn)為參與調(diào)控了視覺(jué)的方向選擇和方向性活動(dòng)，故稱為膽堿能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞；星形無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞呈顯著的星形放射形態(tài)，在視網(wǎng)膜GCL和INL成簇分布[35]，且單個(gè)星形無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的樹(shù)突很少相互交叉，形成特征性“星爆”形態(tài)[36]，故又稱星爆無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞(starburst amacrine cell，SBACs)，但相鄰細(xì)胞間的樹(shù)突狀高度重疊[37]，并形成相互抑制性突觸[38]。膽堿能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞是最易辨認(rèn)的視網(wǎng)膜無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞，也是視網(wǎng)膜中唯一的膽堿能神經(jīng)元[39]。根據(jù)膽堿能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的胞體分布及其樹(shù)突位置(INL的ON層和OFF層)分為ON型(GCL)和OFF型(INL)[40]，雖然膽堿能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的數(shù)量?jī)H占無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞總數(shù)的5%，占整個(gè)視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞總數(shù)的0.5%，但具有顯著的細(xì)胞形態(tài)和分布特征，是目前研究最多、最深入的無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞[41-42]。

4.2Sox2對(duì)無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞發(fā)育的影響 哺乳動(dòng)物胚胎形成后10 d至出生后4 d，無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞由視網(wǎng)膜神經(jīng)生發(fā)層分化[43]，無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞發(fā)育早期，膽堿能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞在視網(wǎng)膜內(nèi)層呈單層分布[44]，隨后逐漸分化為ON型和OFF型兩種不同膽堿能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞[45]。在膽堿能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞遷移至視網(wǎng)膜內(nèi)部定位于INL和GCL并分為兩個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞層之前，條件性敲除膽堿能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞中的Sox2基因，將導(dǎo)致INL和GCL中膽堿能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞數(shù)量的變化，導(dǎo)致INL中的膽堿能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞數(shù)目增多，而GCL中的膽堿能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞數(shù)目減少，但兩層膽堿能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的總數(shù)未發(fā)生變化；此外，膽堿能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的細(xì)胞表型也發(fā)生了變化，條件性敲除無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞中Sox2基因后，GCL中的大部分膽堿能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的樹(shù)突呈雙向分布，而位于INL的膽堿能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞失去了正常膽堿能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞應(yīng)有的嘌呤受體2表達(dá)[46]。在條件性敲除Sox2的視網(wǎng)膜中，膽堿能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的整個(gè)樹(shù)突分布區(qū)域面積并無(wú)變化[47]，且細(xì)胞未出現(xiàn)更多的樹(shù)突間交叉[48]。Sox2通過(guò)誘導(dǎo)Pax6、神經(jīng)源性分化蛋白D啟動(dòng)子誘導(dǎo)RPCs分化為無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞[49]。

5 轉(zhuǎn)錄因子Sox2對(duì)視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞發(fā)育的影響

5.1視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程 在小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程中，雙極細(xì)胞的發(fā)育和分化主要發(fā)生在出生后，在出生后第3天達(dá)到高峰[50]。雙極細(xì)胞是視網(wǎng)膜的第二級(jí)神經(jīng)元，與其上級(jí)的光感受器細(xì)胞和下級(jí)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞相連接，將從光感受器細(xì)胞接收的信號(hào)傳遞給神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，且雙極細(xì)胞還通過(guò)旁突觸縫隙連接與無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞和水平細(xì)胞相連接[51]。根據(jù)功能可將雙極細(xì)胞可分為視錐雙極細(xì)胞和視桿雙極細(xì)胞，雙極細(xì)胞的突觸輸入來(lái)自桿或錐光感受器細(xì)胞，由此可將雙極細(xì)胞分為視桿雙極細(xì)胞或視錐雙極細(xì)胞[52]，視錐雙極細(xì)胞有10種類(lèi)型，而視桿雙極細(xì)胞只有1種類(lèi)型；根據(jù)軸突位置又可將雙極細(xì)胞分為OFF型和ON型，其中近3/4的雙極細(xì)胞為ON型[53]。在小鼠視網(wǎng)膜中，ON型雙極細(xì)胞包括視錐和視桿兩種雙極細(xì)胞類(lèi)型，OFF型雙極細(xì)胞僅包含視錐雙極細(xì)胞[54]。

5.2Sox2對(duì)雙極細(xì)胞發(fā)育的影響 ON型和OFF型雙極細(xì)胞通常分別與ON型和OFF型的 SBACs建立突觸連接。雙極細(xì)胞表面表達(dá)不同的鈣黏素，是雙極細(xì)胞與其他細(xì)胞進(jìn)行突觸連接的特異識(shí)別位點(diǎn)[55]。有研究發(fā)現(xiàn)，在條件性敲除Sox2的小鼠視網(wǎng)膜中，位于GCL的ON型SBACs可接收來(lái)自O(shè)N型和OFF型雙極細(xì)胞的興奮性信號(hào)；與正常小鼠相比，Sox2敲除小鼠ON型和OFF型SBACs動(dòng)作電位的振幅減少，反應(yīng)時(shí)間縮短，說(shuō)明Sox2敲除小鼠視網(wǎng)膜中SBACs與雙極細(xì)胞間的突觸連接異常[56]。

6 小 結(jié)

Sox2是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中必需的轉(zhuǎn)錄因子，具有維持細(xì)胞多能性和干性的功能，可促使已分化的細(xì)胞重新進(jìn)入分裂周期[57]；此外，Sox2對(duì)器官發(fā)育至關(guān)重要，如眼的正常發(fā)育，Sox2基因突變會(huì)導(dǎo)致小眼癥、無(wú)眼癥和其他眼部營(yíng)養(yǎng)不良[58]，并影響視網(wǎng)膜及視網(wǎng)膜中各類(lèi)細(xì)胞(如Müller細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞及雙極細(xì)胞)的發(fā)育。Sox2是目前唯一明確的單基因突變引起先天性小眼球和無(wú)眼球的致病基因。如何有效治療眼遺傳性疾病一直是眼科醫(yī)師的努力目標(biāo)，目前治療眼遺傳性疾病的主要方法有干細(xì)胞療法、基因治療、人工視網(wǎng)膜等，利用Sox2轉(zhuǎn)錄因子對(duì)眼部發(fā)育的促進(jìn)作用及其維持RPCs干性的特性，可在基因水平利用基因編輯技術(shù)治療視網(wǎng)膜遺傳性疾病。充分了解Sox2對(duì)視網(wǎng)膜發(fā)育和功能的影響及機(jī)制，將為視網(wǎng)膜遺傳病、視網(wǎng)膜發(fā)育不良等疾病的研究和治療提供新方向。