血凝和血凝抑制試驗注意事項

郭 燕

江蘇省泰興市濱江鎮(zhèn)獸醫(yī)站，江蘇泰興225400

隨著規(guī)模養(yǎng)雞業(yè)的迅速發(fā)展和養(yǎng)殖戶科學(xué)養(yǎng)殖意識的增強(qiáng)，實驗室檢測技術(shù)越來越重要。血凝和血凝抑制試驗是實驗室常用的免疫抗體檢測技術(shù)之一，主要用于雞新城疫和禽流感病毒病的檢測診斷以及監(jiān)測雞的免疫狀態(tài)。筆者結(jié)合日常實驗室操作，淺談該試驗應(yīng)注意的事項，以供參考。

1 1%雞紅細(xì)胞懸液配制

采血應(yīng)選用3 只SPF 公雞或無新城疫、禽流感病毒抗體的健康公雞，其目的是為了避免某些雞只的紅細(xì)胞可能出現(xiàn)自凝現(xiàn)象。采血后將血液迅速加入含抗凝劑的容量瓶中混合均勻，抗凝劑與血液的比例為1:4。離心操作中，注意在離心管加入PBS 液混合時不要用力，防止紅細(xì)胞破裂產(chǎn)生溶血。以2 000 r/min 的速度離心5～10 min，離心次數(shù)不宜過多，3 次即可。每次離心后，用吸管吸去上層清液和白細(xì)胞膜。白細(xì)胞膜吸除得越干凈越好。配置好的雞紅細(xì)胞懸液放置后若出現(xiàn)上清液呈紅色，說明有溶血，不可使用。

2 試驗器材的準(zhǔn)備及操作

血凝和血凝抑制試驗主要用到的器材有96 孔V 形微量反應(yīng)板、單道或多道微量移液器、吸頭、恒溫培養(yǎng)箱、微量振蕩器等。試驗過程全部無菌操作，試驗人員注意安全，做好自身防護(hù)。選用清潔干燥的反應(yīng)板，移液器吸頭盡量選用合格的一次性產(chǎn)品，一個吸頭只能移取一種溶液。移液器在使用前先進(jìn)行檢查校正，每個吸頭要牢固固定，以防操作過程中漏氣或掉落。使用時操作要規(guī)范，先按下移液器，再將吸頭放入反應(yīng)孔中吸取樣品。移液器吸頭要垂直懸空加入液體，避免接觸反應(yīng)板和孔壁。操作要穩(wěn)，手每次按壓的力度要均衡，確保移液量的準(zhǔn)確。樣品稀釋過程中，使用移液器在反應(yīng)孔中吹打幾次，混合均勻后再吸取移至下一孔。吹打時移液器吸頭不要離開樣品液面，防止產(chǎn)生氣泡影響移液量。

3 血凝價的判定

在紅細(xì)胞各組對照孔均正確的情況下，將反應(yīng)板傾斜，觀察紅細(xì)胞是否完全凝集，能使雞紅細(xì)胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)即為該病毒的凝集價。

4 4 單位抗原的配制

根據(jù)獲得的血凝價進(jìn)行4 單位抗原的配制，4單位抗原的稀釋倍數(shù)為血凝價除以4，假設(shè)測得的血凝價為8log2，4 個血凝單位則為6log2，將抗原做64 倍稀釋即可。也就是取1 mL 病毒抗原加入63 mL PBS 液中即為4 單位抗原。4 單位抗原最好現(xiàn)用現(xiàn)配。

5 抗原回歸試驗

4 單位抗原是血凝抑制試驗中尤為重要的一個環(huán)節(jié)，其準(zhǔn)確性決定了血凝抑制試驗的結(jié)果。為防止4 單位抗原配制不準(zhǔn)確，在血凝抑制試驗前必須做抗原回歸試驗。抗原回歸試驗觀察結(jié)果時，以前2孔完全凝集、后2 孔不凝集為準(zhǔn)。若4 孔全部凝集，說明配制濃度過高；4 孔不凝集，說明配制濃度過低。只有在抗原回歸試驗成功的情況下，才能進(jìn)行下一步的血凝抑制試驗。

6 血凝抑制效價的判定

觀察血凝抑制試驗結(jié)果時，將反應(yīng)板傾斜45°，從反應(yīng)板背側(cè)觀察紅細(xì)胞有無呈淚滴樣流掛，以能完全抑制紅細(xì)胞凝集的最高血清稀釋倍數(shù)判為該血清的血凝抑制效價。

7 試驗后的整理和消毒

試驗結(jié)束后，將此次試驗記錄及操作過程中出現(xiàn)的問題進(jìn)行歸納整理，做好儀器、設(shè)備的清潔消毒工作。先將96 孔V 形微量反應(yīng)板用流水沖洗一遍，然后放入清潔液中浸泡數(shù)小時，再取出用流水沖洗干凈，接著用生理鹽水或蒸餾水再沖洗一遍，甩干，放入恒溫箱中烘干，供下次使用。雖然移液器吸頭可以循環(huán)利用，但清洗容易有殘留，一般做集中回收進(jìn)行無害化處理。使用過的器械、設(shè)備進(jìn)行原處歸位，做好日常管護(hù)，為下次試驗成功做好預(yù)準(zhǔn)備。