動(dòng)物肝硬化模型構(gòu)建的研究進(jìn)展

李松，倪德生

(金華市人民醫(yī)院肝膽外科，浙江 金華 321000)

肝硬化是肝臟病變的最終結(jié)果，其病理變化主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞的廣泛壞死，殘存肝細(xì)胞結(jié)節(jié)性再生，結(jié)締組織增生，形成纖維隔，破壞肝小葉結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致假小葉形成，肝臟組織發(fā)生變形變硬，最終成為肝硬化。在我國(guó)，肝硬化形成較為常見的因素主要是由乙型肝炎病毒(HBV) 和丙型肝炎病毒(HCV)感染導(dǎo)致的[1-2],一般情況下，肝硬化代償期屬于 Child-Pugh A級(jí)，由于肝臟代償功能較強(qiáng)可無明顯癥狀，也可有輕度乏力、腹脹、肝脾輕度腫大、輕度黃疸、肝掌、蜘蛛痣的表現(xiàn)，而肝硬化失代償期則屬于Child-Pugh B C級(jí)，以不同程度的肝損害和(或)門靜脈高壓為主要表現(xiàn)，并伴有多系統(tǒng)受累，晚期常出現(xiàn)上消化道出血、肝性腦病(HE) 繼發(fā)感染脾功能亢進(jìn)、腹水、癌變等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響人類健康。目前對(duì)于肝硬化的治療包括病因治療、門靜脈高壓及食管胃靜脈曲張(esophageal gastric varices，EGV) 出血的治療、腹水的治療、功能性腎衰竭的治療、感染的治療、肝性腦病的治療。對(duì)于失代償期肝硬化，內(nèi)科常規(guī)的保肝和對(duì)癥治療不能延長(zhǎng)患者生存期，原位肝移植是唯一有效的治療手段，但受供肝缺乏、費(fèi)用高昂等因素的限制，須嚴(yán)格評(píng)估肝硬化患者的適應(yīng)證和禁忌證。所以提倡早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防、早治療，防止疾病進(jìn)展對(duì)于肝硬化患者尤為重要，這樣可以減少肝硬化患者臨床失代償性并發(fā)癥的體現(xiàn)。但目前來說比較艱難的問題還是終末期肝硬化患者，因此尋找有效的方法治療肝硬化十分緊迫。實(shí)驗(yàn)性肝硬化模型的建立始于1938年，以往的多以鼠為主，用以藥敏實(shí)驗(yàn)居多，不適宜手術(shù)的干預(yù)[3-5]。而大型動(dòng)物肝硬化的制備又非常困難，因此，建立合適肝硬化模型，能為后續(xù)的手術(shù)干預(yù)創(chuàng)造有利條件，本文就動(dòng)物肝硬化模型研究進(jìn)展做一簡(jiǎn)要綜述。

1 肝硬化模型

1.1 化學(xué)性肝硬化模型

1.1.1 二甲基亞硝胺(DMNA)誘導(dǎo)肝硬化模型 二甲基亞硝胺主要是由肝內(nèi)氧化酶作用下進(jìn)行氧化代謝激活，例如N-脫羥基生成甲醛物質(zhì)，或者產(chǎn)生活性甲基和酚酞烷基亞硝胺。再經(jīng)過氧化形成甲烷亞硝胺，這些物質(zhì)對(duì)肝臟形成一定的危害，可以導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，纖維組織形成，肝臟萎縮，蛋白合成能力下降，肝功能失代償，進(jìn)一步形成肝硬化。該模型較穩(wěn)定，與肝炎形成的肝硬化較相似。研究[6-8]顯示用0.5% DMNA溶液2 mL·kg-1(鹽水稀釋)腹腔注射小鼠，每天1次，4周便形成肝硬化，成模率較高，時(shí)間較短。有研究者使用上述方法建模[9-13]，發(fā)現(xiàn)二甲基亞硝胺不是導(dǎo)致肝臟纖維結(jié)締組織沉積而形成肝硬化，而是導(dǎo)致肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞大面積壞死，破壞并改變了肝竇壁的結(jié)構(gòu)，肝臟萎縮，肝功能損害而形成肝纖維化，最終形成肝硬化。DMNA制造肝硬化模型具有以下特點(diǎn)，成功率高、動(dòng)物死亡率低，而且穩(wěn)定性較好。由于其過程易形成肝硬化門脈高壓，所以該方法常用于肝硬化門靜脈高壓類動(dòng)物模型的研究[14-17]。該建模方法是用來研究肝硬化過程中病理生理變化產(chǎn)生的一些組織學(xué)變化指標(biāo)。隨著對(duì)該疾病發(fā)病機(jī)制以及藥物療效的深入研究， DMNA出現(xiàn)一定的弊端，其價(jià)格較貴、劑量難以掌握，毒性大易揮發(fā)，容易影響周圍的環(huán)境和人，再加上用大動(dòng)物作為研究對(duì)象，價(jià)格昂貴、管理困難，所以近來運(yùn)用此種方法制備大動(dòng)物肝硬化模型較為少見。但考慮DMNA制備肝硬化模型的一些優(yōu)點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外尚有應(yīng)用DMNA制備大鼠肝硬化模型用于肝硬化機(jī)制及篩選抗纖維化藥物的研究報(bào)道。

1.1.2 CCl4是由甲烷和氯氣作用產(chǎn)生的一種無色透明的液體，是常用的肝硬化誘導(dǎo)物質(zhì)，對(duì)肝細(xì)胞有很強(qiáng)的毒性作用。其作用是溶解肝細(xì)胞膜，經(jīng)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞色素P450依賴性混合功能氧化酶的代謝作用下釋放三氯化碳(-CCl3)，進(jìn)一步經(jīng)過氧化作用，破壞肝細(xì)胞膜、影響蛋白質(zhì)合成，肝功能損害，肝硬化形成。CCl4建模的原理是其作用于肝臟，導(dǎo)致肝細(xì)胞損害的過程中會(huì)產(chǎn)生一些炎癥因子和自由基，進(jìn)一步激活肝星狀細(xì)胞(HSC)，產(chǎn)生過多的細(xì)胞外基質(zhì)沉積于肝內(nèi)導(dǎo)致肝臟纖維化，進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化。人類藥物性肝硬化病理特點(diǎn)與其有很多相似之處[18-20]，再加上CCl4誘導(dǎo)動(dòng)物模型具有以下優(yōu)點(diǎn)，操作簡(jiǎn)便、材料價(jià)廉，以及病變典型，所以很多研究者選用該建模方法研究藥物性肝硬化發(fā)病機(jī)理[21-22]，評(píng)估抗肝硬化藥物的藥效。當(dāng)前的制作肝硬化模型的方法包括，單純 CCl4建模、CCl4聯(lián)合苯巴比妥、CCl4聯(lián)合乙醇、CCl4復(fù)合法等。雖然該方法成模率低、死亡率高，但由于其一定的優(yōu)點(diǎn)，很多肝硬化相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究還是采用該建模方法。

1.2 酒精性肝硬化模型 酒精主要在肝臟內(nèi)代謝，代謝過程中會(huì)產(chǎn)生許多毒性物質(zhì)。酒精抑制肝細(xì)胞的能量代謝循環(huán)，導(dǎo)致脂肪酸合成增加，發(fā)生脂肪變，進(jìn)一步造成肝臟形態(tài)和功能的改變，再加上酒精的直接毒害作用，如損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、激活儲(chǔ)脂肪細(xì)胞，導(dǎo)致肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能損害，進(jìn)一步導(dǎo)致肝纖維化及肝硬化[23-25]。近年來，隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，居民生活水平提高，酒精性肝硬化的患者逐漸增多，對(duì)人類健康構(gòu)成了一定的威脅。長(zhǎng)期過度飲酒可以導(dǎo)致肝硬化。有研究者利用狒狒作為研究對(duì)象，成功的制作了酒精性肝硬化模型。該動(dòng)物與人類結(jié)構(gòu)較相似，所以酒精性肝硬化的發(fā)生機(jī)制、病理生理改變以及藥物治療多用此模型進(jìn)行研究，但是狒狒價(jià)格較貴，而且不易獲得。Lee等[26]采用長(zhǎng)白豬作為研究對(duì)象，維持12個(gè)月制備肝纖維化模型，時(shí)間較長(zhǎng)，可見如何縮短造模時(shí)間提高造模成功率是此模型今后研究的重點(diǎn)。由于制造模型的時(shí)間較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、造模不穩(wěn)定，所以這種造模方法多用于酒精造成肝損害機(jī)制的研究。

1.3 手術(shù)性肝硬化模型 該模型的原理是引起膽管梗阻。具體操作是通過結(jié)扎膽總管，使膽汁排除困難，造成肝內(nèi)膽汁淤積，進(jìn)一步引起毛細(xì)膽管梗阻，匯管區(qū)膽管擴(kuò)張，肝臟纖維組織增生，最終形成肝硬化。有研究者[27-28]利用鼠作為研究對(duì)象，手術(shù)解剖膽總管予以結(jié)扎。該方法一般需要6周，缺點(diǎn)就是死亡率較高，達(dá)到30%以上?；谑笊斫Y(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，此模型應(yīng)用的比較多，由于鼠缺乏膽囊，所以并發(fā)癥的概率較大，因此死亡可能性也增加。膽管結(jié)扎后再通，使組織學(xué)形成了逆轉(zhuǎn)。由于此模型血流動(dòng)力學(xué)變化比較突出，所以該模型制造方法常用于研究門靜脈高壓癥血流動(dòng)力學(xué)的改變。

1.4 免疫性肝硬化模型 導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷的各種因素(化學(xué)藥物、酒精、病毒)作用于肝臟，在產(chǎn)生肝細(xì)胞損害的過程中，由于物質(zhì)結(jié)合后可獲得抗原性，進(jìn)一步破壞了機(jī)體免疫耐受機(jī)制，經(jīng)過機(jī)體免疫產(chǎn)生自身抗體，進(jìn)一步引發(fā)一系列的病理變化，造成肝細(xì)胞凋亡，最終形成肝硬化。比如病毒性肝炎，是我國(guó)目前最常見的肝硬化病因。由于鼠不易被人類嗜肝細(xì)胞病毒感染，用傳統(tǒng)方法造模無法成功，不少研究者近年來開始用嘗試新的技術(shù)[29-31]，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立此種模型，如肝炎病毒轉(zhuǎn)基因模型、人類肝嵌合模型是比較常用的方法。由于小鼠的免疫機(jī)制對(duì)病毒抗原耐受，并不產(chǎn)生損傷肝細(xì)胞的沉積物，所以無法觀察到宿主的免疫應(yīng)答形成機(jī)理[32-33]。目前該造模方法用于病毒復(fù)制、基因表達(dá)等研究。人類肝嵌合模型使小鼠體內(nèi)高表達(dá)尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑(uPA)，從而激活降纖作用破壞肝細(xì)胞。但此種模型免疫缺陷，無法觀察到免疫應(yīng)答過程。但由于此模型能感染肝炎病毒，所以此方法常用來抗病毒藥物藥效的評(píng)估。

1.5 其他性肝硬化模型 血吸蟲蟲卵在肝臟內(nèi)沉積，導(dǎo)致肝內(nèi)肉芽腫炎癥及免疫反應(yīng)，形成可溶性蟲卵抗原，進(jìn)一步造成肝星狀細(xì)胞凋亡，同時(shí)激活大量的成纖維細(xì)胞，形成大量的膠原纖維，最終形成肝硬化。有研究者注射日本血吸蟲，在第6、8、10周分別形成不同的變化，在匯管區(qū)有大量蟲卵，炎癥細(xì)胞刺激形成肉芽腫，蟲卵周圍沉積了大量纖維細(xì)胞，纖維組織增生；進(jìn)一步導(dǎo)致肝小葉間膠原纖維沉積，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致假小葉形成[34-36]。所以抗血吸蟲的藥物實(shí)驗(yàn)和門靜脈高壓癥的研究常用此模型。

2 模型動(dòng)物選擇

2.1 小型動(dòng)物 對(duì)于不同的研究目的，小型動(dòng)物的選擇性較高，目前最常用的小型動(dòng)物是小鼠。對(duì)于肝硬化模型以及其他相關(guān)研究來說，小鼠作為研究對(duì)象建模具有大量化、多樣化、成熟化的特點(diǎn)[37-38]。但小鼠的體積較小也有一定的弊端，由于血樣本較少，不能同時(shí)完善多項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定，對(duì)于外科微創(chuàng)手術(shù)的操作更不適合。目前最重要的是，由于小鼠與人的解剖結(jié)構(gòu)相差甚遠(yuǎn)，所以一些疾病發(fā)展過程的生理、生化正常值也不盡相同。如果想對(duì)小鼠肝硬化模型以及肝硬化引起的門靜脈高壓癥的手術(shù)方式進(jìn)行研究，操作十分不方便，而且小動(dòng)物模型很難達(dá)到預(yù)期的效果。

2.2 中型動(dòng)物 對(duì)于外科微創(chuàng)手術(shù)介入的研究，小型動(dòng)物由于體形小的原因，受到很大的限制，尤其是肝臟血管的外科實(shí)驗(yàn)，小型動(dòng)物建立的手術(shù)阻斷肝硬化模型應(yīng)用就有很大困難。相對(duì)于大來說，中等體形動(dòng)物模型更合適(比如大白兔)。有研究者使用兔作為研究，不但簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，而且成功率很高[39-40]，特別對(duì)肝性腦病的磁共振波譜、動(dòng)物肝移植的實(shí)驗(yàn)研究更適用。

2.3 大型動(dòng)物 利用大動(dòng)物(猴子、豬、犬等)建立模型，用于觀察外科治療療效相當(dāng)重要。有研究者利用大型動(dòng)物建模，制作門靜脈高壓模型[41-42]。因?yàn)槠滹曫B(yǎng)簡(jiǎn)單容易采集樣本，觀察多項(xiàng)指標(biāo)方便，而且大型動(dòng)物肝臟大小適中，取材方便。有研究者用豬作為研究對(duì)象，建立豬肝硬化模型。因?yàn)樨i的結(jié)構(gòu)接近人類，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)褪苄詮?qiáng)、解剖結(jié)構(gòu)清晰、操作方便。也有研究者使用犬運(yùn)用改良四氯化碳皮下注射法制備犬肝硬化門靜脈高壓癥模型，而猴子由于價(jià)格比較貴，較少用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。

利用動(dòng)物建模需要合適的方法。因?yàn)閯?dòng)物實(shí)驗(yàn)與體外細(xì)胞培養(yǎng)不同，動(dòng)物的解剖特點(diǎn)可以更好地幫助我們研究肝硬化的生物醫(yī)學(xué)和病理組織學(xué)特征[43-44]，幫助我們?cè)趶?fù)雜的體內(nèi)多器官系統(tǒng)中觀察各項(xiàng)指標(biāo)，為開展新的治療措施和測(cè)試新的治療藥物提供條件。近期采用不同劑量、不同頻度的CCl4做皮下注射新西蘭大白兔來研究合適濃度四氯化碳建模效果，雖然取得了一定的研究結(jié)果，由于動(dòng)物和人類畢竟存在差異，其發(fā)病機(jī)制不同于人類，所以實(shí)驗(yàn)中的一些新的發(fā)現(xiàn)尚不能直接應(yīng)用于臨床。

綜上所述，由于動(dòng)物結(jié)構(gòu)與人類種屬差異，現(xiàn)在沒有出現(xiàn)合適的動(dòng)物肝硬化模型能夠很好地展現(xiàn)出人的肝硬化特征。但是我們不可否定的是，動(dòng)物模型給研究者帶來一定益處，它們幫助我們更好地研究疾病發(fā)病機(jī)制，尋找出新的治療策略。隨著研究的進(jìn)展，有望尋找一種合適的動(dòng)物建立有效的動(dòng)物模型，更好地研究肝硬化發(fā)病機(jī)制，尋找出肝硬化治療有效藥物，為更好地外科干預(yù)提高更好的條件。