基于網(wǎng)絡藥理學的丹參川芎嗪注射液入血成分治療腦梗死機制分析

段凱旋，劉志強，王博龍

(1.宜春學院，江西 宜春 336000；2.鶴壁職業(yè)技術學院，河南 鶴壁 458030)

中藥復方是中華民族使用天然藥物千百年的經(jīng)驗結晶，由于其化學成分復雜，導致藥效物質不明。復方藥效物質的研究方法有多種，其中通過分析復方口服給藥后血中移行成分，確定其體內(nèi)直接作用物質，已成為快速確定復方藥效物質的有效途徑之一[1]。丹參川芎嗪注射液主要有效成分均是對腦血管治療的有效藥物,現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)[2]丹參素具有溶解纖維蛋白,降低血液黏度,改善微循環(huán)的作用，而川芎嗪則可以擴張腦血管,預防血小板凝聚,降低腦耗氧量。目前針對丹參川芎嗪注射液的藥理學研究已有一些報道，但其治療腦梗死的作用機制研究尚未完全明確。而網(wǎng)絡藥理學是融合了藥學、生物學、計算機學及復雜網(wǎng)絡分析等多學科的新技術與新成果，在預測和辨識中藥活性成分群及作用靶點、闡明作用機制、解釋組方規(guī)律、發(fā)現(xiàn)新適應證及新活性化合物等方面，具有獨特優(yōu)勢和巨大潛力[3]。本文通過網(wǎng)絡藥理學的方法對其治療腦梗死的作用機制進行研究，以期望為后續(xù)研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 入血成分治療腦梗死靶點篩選及其網(wǎng)絡構建 根據(jù)文獻報道[4-5]確定丹參川芎嗪注射液14種入血成分(見表1)，并通過TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetSprediction.ch/)檢索丹參川芎嗪注射液入血成分靶點，然后利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將靶點轉換成對應靶點。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)以“Cerebral infarction、Ischemic stroke”為檢索詞，搜索腦梗死靶點，將腦梗死靶基因與丹參川芎嗪注射液入血成分靶點同時輸入Venny 2.1軟件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，篩得二者靶基因交集作為作用靶點，將入血成分及其靶點導入 Cytoscape 3.7.1 軟件構建入血成分-靶點網(wǎng)絡圖。

表1 丹參川芎嗪注射液入血成分

1.2 靶點的相互作用研究 將篩選得到的作用靶點導入STRING平臺(https://string-db.org/)構建靶蛋白互作網(wǎng)絡(protein-protein interaction，PPI)，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為“medium confidence”，其他參數(shù)保持默認值。將 PPI 網(wǎng)絡導入Cytoscape 3.7.1軟件，利用“Network Analysis”功能進行網(wǎng)絡拓撲屬性分析篩選出關鍵靶點。

1.3 關鍵靶點的KEGG通路研究 利用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號通路分析，物種與背景設置均為“Homo sapiens”(智人)進行操作，研究靶點投射的 KEGG 信號通路與疾病之間的相互關系，并通過Omicshare軟件 (http://www.omicshare.com/tools/index.php/)，對富集分析結果進行可視化分析，明確其治療腦梗死的主要藥理機制。

2 結果

2.1 入血成分治療腦梗死靶點及其網(wǎng)絡圖 將TCMSP、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫檢索得到的146個入血成分靶點，與Gene cards數(shù)據(jù)庫挖掘到的2 538個腦梗死靶點篩重，得到83個入血成分治療腦梗死的靶點(見圖1)。圖2為入血成分-治療腦梗死靶點網(wǎng)絡圖，共有個124節(jié)點，235條邊，每個入血成分均能作用于多個治療腦梗死的靶點，體現(xiàn)了丹參川芎嗪注射液治療腦梗死具有多成分、多靶點的特征。

圖1 腦梗死-入血成分靶點韋恩圖

圖2 入血成分治療腦梗死靶點網(wǎng)絡圖(菱形：丹參川芎嗪注射液；圓形：入血成分；三角形：腦梗死；橢圓形：作用靶點)

2.2 靶點PPI網(wǎng)絡分析 如圖3所示，PPI網(wǎng)絡共有82個節(jié)點(1個靶點未參與)，686條相互作用連線，每個參與互作的蛋白節(jié)點用一個圓圈表示，圓圈面積越大表示其度值越大，圓圈周線越粗代表其介數(shù)越大，PPI關聯(lián)網(wǎng)絡平均度值為16，平均介數(shù)為1.2×10-2，均超過平均值的靶點共有18個(見表2)，以此作為治療腦梗死的關鍵靶點。

圖3 靶點PPI網(wǎng)絡

表2 關鍵靶點及其拓撲參數(shù)

2.3 關鍵靶點的KEGG通路分析 以P<0.05作為篩選標準，富集18個關鍵靶點的KEGG通路，如圖4所示33條信號通路，其中與腦梗死密切相關的有PI3K-Akt信號通路、VEGF信號通路、TNF信號通路、雌激素信號通路和血小板激活等。

圖4 KEGG信號通路點狀圖

3 討論

腦梗死又稱缺血性腦卒中，屬于中醫(yī)中風范疇，其發(fā)病常與風、火、痰、虛、瘀等因素相關。中醫(yī)學理論認為，瘀血貫穿于該病發(fā)生、發(fā)展的始終，因此以活血化瘀、補氣養(yǎng)血為施治原則。隨著現(xiàn)代人們生活節(jié)奏加快和飲食結構不良，腦梗死發(fā)病率上升，且發(fā)病人群呈年輕化的趨勢。丹參和川芎是經(jīng)典的活血化瘀類中藥，由其有效成分精制而成的中藥注射液，廣泛應用于腦梗死的臨床治療，但其藥效成分眾多，作用靶點及機制尚未完全揭示。

本研究以丹參川芎嗪注射液中丹參素、丹酚酸B、川芎嗪等14種入血成分為研究對象，預測出NOS3、VEGFA、IL-4、IL-2、F2等關鍵藥效靶點，而實驗也證實丹參川芎嗪注射液有效成分能夠直接或間接作用于這些靶點。如NOS3又稱eNOS，是內(nèi)皮型一氧化氮合酶，能夠催化血管內(nèi)皮細胞合成一氧化氮(NO)，而NO是重要的血管舒張因子，能夠擴展血管改善腦梗死區(qū)域的血液供應。程先超等[6]發(fā)現(xiàn)川芎嗪可升高血漿中NO水平，改善腦部微循環(huán)，增加局部腦血流量，保護缺血區(qū)腦組織。F2在凝血機制中起著中心作用，可以激活纖維蛋白原，誘導血小板聚集，導致血栓形成，而丹參川芎嗪注射液能明顯降低腦梗早期患者血清F2水平[7]。VEGFA是VEGF主要的亞型，具有誘導血管新生、促血管內(nèi)皮細胞增殖等生物活性[8]。薛亮等[9]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B能夠促進VEGF mRNA的表達，保護內(nèi)皮細胞。此外，川芎嗪、丹參素還可以下調(diào)白介素減輕血管內(nèi)皮細胞損傷[10-11]，且聯(lián)合應用對缺氧損傷的血管平滑細胞具有一定的協(xié)同保護作用[12]。由此可見，無論是從網(wǎng)絡藥理學預測還是他人實驗結果來看，丹參川芎嗪注射液主要通過上述靶點，來改善微循環(huán)、抗凝、保護血管內(nèi)皮細胞，進而發(fā)揮治療腦梗死作用。

通路富集可有效了解丹參川芎嗪注射液靶點的整體協(xié)同作用，KEGG通路研究顯示靶點主要富集在PI3K-Akt信號通路、VEGF信號通路、TNF信號通路、雌激素信號通路和血小板激活等。其中PI3K-Akt被認為是缺氧缺血后腦細胞凋亡的主要信號通路，調(diào)控PI3K-Akt能夠減輕腦損傷。雖無丹參川芎嗪注射液調(diào)控PI3K-Akt信號通路治療腦梗死的實驗，但已證實丹參酮IIA、川芎嗪能通過調(diào)控PI3K-Akt通路促進心肌細胞存活、縮小梗死面積，而防治心肌缺血再灌注損傷[13-14]。

綜上所述，本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法，對丹參川芎嗪注射液入血成分的作用靶點及其信號通路進行了系統(tǒng)研究，為丹參川芎嗪注射液的臨床應用提供了科學依據(jù)。